Abstract
Bakgrunn
Behandling for pasienter med avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er ofte bestemmes av tilstedeværelsen av biomarkører som forut responsen til agenter rettet mot bestemte molekylære stier. Krav om multiplex analyse av de involverte i patogenesen av NSCLC gener øker.
Metoder
Vi validert Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) systemet med Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel og sammenlignet resultatene med de som ble oppnådd ved bruk av gullstandardmetoder, konvensjonelle PCR og Sanger-sekvensering. Den cycleave PCR-metoden ble brukt til å bekrefte resultatene.
Konklusjon
Resultater og
Ion Torrent PGM resulterte i et tilsvarende nivå av nøyaktighet i å identifisere flere genetiske mutasjoner i parallell, sammenlignet med konvensjonell PCR og Sanger-sekvensering; imidlertid Ion Torrent PGM var overlegen de andre sekvenseringsmetoder i form av økt brukervennlighet, selv når du tar i betraktning den lille mengden av DNA som ble hentet fra formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) biopsiprøver.
Citation: Fujita S, Masago K, Takeshita J, Okuda C, Otsuka K, Hata A, et al. (2015) Validering av en Ion Torrent Sekvensering Platform for påvisning av genmutasjoner i snitt fra pasienter med ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (6): e0130219. doi: 10,1371 /journal.pone.0130219
Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG
mottatt: 28 desember 2014; Godkjent: 17 mai 2015; Publisert: 15 juni 2015
Copyright: © 2015 Fujita et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data er tilgjengelig fra Ibri Institutional data Access /etikk-komité på grunn av etiske restriksjoner knyttet til pasientens personvern. I tilfeller av data forespørsel vil styremedlemmene avgjøre om ikke å utlevere informasjon
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Behandling for pasienter med avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) bestemmes ofte, slik tilfellet er for andre kreft hos mennesker, ved tilstedeværelse av biomarkører som forut responsen til agenter rettet mot spesifikke molekylære stier i maligne celler. Gunstig respons til tyrosin-kinase (TK) inhibitorer som er målrettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), i tilfeller av NSCLC hvori mutasjoner er til stede i EGFR-genet, illustrerer viktigheten av identifikasjon av molekyl biomarkører, og flere slike onkogene endringer har vært rapportert å tidspunkt [1-3]. Disse molekylære forandringer kan deles inn i to kategorier; genetiske rearrangementer som krever RNA-baserte analyser og /eller fluorescens in situ hybridisering for deres identifikasjon, og genmutasjoner (inkludert små innsetting eller sletting hendelser) som blir undersøkt ved hjelp av DNA-basert analyse. Mutasjoner har blitt oppdaget i flere gener i tillegg til
EGFR Hotell som er involvert i patogenesen av NSCLC (dvs.
KRAS
,
NRAS
,
HER2
akt1
,
BRAF
,
PIC3CA
) og etterspørselen etter multiplex analyse av disse genene er økende.
de eneste vevsprøver som vanligvis tilgjengelig for mutasjonsanalyse i klinisk setting er biopsiprøver innhentet transbronchially eller transkutant. Disse prøvene har en tendens til å være liten, og utsettes for den formalinfikseringsprosessen. Påvisning av mutasjoner ved å utføre PCR og Sanger-sekvensering i parallell er tidkrevende og krever en betydelig mengde av DNA, som ofte utilgjengelig på grunn av den lille prøvestørrelsen. En nylig utviklet teknikk, massivt parallell sekvensering DNA, gir rask, følsom og svært spesifikk påvisning av genmutasjoner i en enkel analyse, til rimelig pris.
Her har vi brukt Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) system (Thermo Fisher Scientific) i forbindelse med den Ion AmpliSeq Cancer hotspot Panel, versjon 2 og sammenlignet resultatene med de som oppnås ved de gull standardmetoder for mutasjonsanalyse, konvensjonelle PCR og Sanger-sekvensering. Videre, en svært sensitiv PCR-metoden, den cycleave PCR-metoden ble benyttet, med fokus på EGFR og KRAS genmutasjoner spesielt, for å verifisere resultatene oppnådd av både konvensjonell PCR og Ion Torrent PGM system.
Metoder
Etikk
Denne studien ble godkjent av Institute of Biomedical Research and Innovation Hospital sin Institutional Review Board. Alle pasienter gitt skriftlig, informert samtykke. Studien ble gjennomført i samsvar med de etiske prinsippene i Helsinkideklarasjonen.
Pasientinformasjon
tumorprøver som brukes i studien ble samlet inn fra Institute of Biomedical Research and Innovation Hospital, Japan. I samsvar med gjeldende retningslinjer, alle FFPE- tumorprøver fra ikke-småcellet lungekreft pasienter med ukjent genotype (
EGFR Hotell og
KRAS
) ble analysert ved konvensjonell PCR og Sanger-sekvensering for å fastslå ytterligere behandling. Til sammenligning ble totalt 21 tumorprøver analysert med Ion PGM systemet og cycleave PCR-metoden
analysert gener
EGFR
. Exon 19 sletting (inkludert E746 -A750), exon 21 L858R, ekson 21 L861Q
KRAS
: exon 2 G12X
vevsprøver og DNA-isoleringer
Bare de biopsiprøver som avslørte NSCLC patologisk ble analysert. I alle tilfeller ble bronkoskopi-biopsi eller kjerne nål biopsi utført (figur 1A og 1B). En dedikert 21-gauge nål ble anvendt for å oppnå histologisk kjerne. Histologiske Kjernene ble fiksert med formalin og anvendt for patologisk diagnose. Etter histopatologiske diagnose, ble FFPE- prøver (en til tre prøver på 5-mikrometer tykke delen) deparaffinized hjelp xylen. DNA ble isolert fra seksjonene ved hjelp av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), i henhold til produsentens anvisninger. Vi målte DNA konsentrasjon med Nanodrop Lite spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific).
(A) formalinfiksert parafin innebygd prøven. (B) En prøve av 5-mikrometer tykke delen.
Konvensjonell PCR og Sanger-sekvense
Eksoner 18-21 ble forsterket av PCR og analysert. Primere og sykkelforhold for PCR amplifisering ble endret fra metoder som er publisert tidligere [4]. Sekvenseringsreaksjoner ble elektroforese på en ABI PRISM 3100 (Thermo Fisher Scientific). Direkte sekvensering av PCR-produktene ble gjennomført i både fornuft og antisense retninger.
Den cycleave PCR-metoden
Vi brukte en kimære DNA-RNA-DNA probe merket med et fluorescerende fargestoff og drikk på hver ende [5]. En RNA-sekvens av probene svarer til den for villtypen og punktmutasjon (Exon 21 L858R, Exon 21 L861Q) merket med FMA og ROX, respektivt. Når mutante molekyler er til stede i prøven, og PCR-amplifisert DNA som genererer et komplett hybrid med RNA-delen av det mutante probe, fordøyer RNase-H sonden ved RNA-DNA heterodupleks i to deler, som fører til en betydelig økning i fluorescens-intensitet ved separasjon av fluorescerende fargestoff fra drikk.
for å oppdage slettingen i ekson 19 i EGFR-genet, ble vanlig fragment analyse brukt. Prøve-DNA ble amplifisert med en FAM-merket primer set og PCR-produktene ble underkastet elektroforese. PCR forsterket kortere segment av DNA, og skaper en ny topp i en elektroferogrammet når en sletting mutasjon var til stede [5].
Ion Torrent PGM Bibliotek Forberedelse og sekvense
En Ion Torrent adapter-ligert biblioteket ble generert følge produsentens Ion AmpliSeq Library Kit 2.0-protokollen (Thermo Fisher Scientific, Rev. 5; MAN0006735). Kort, 50-ng sammenslåtte amplikonene var slutt reparert, og Ion Torrent adaptere P1 og A ble ligert med DNA ligase. Etter AMPure perle rensing (Beckman Coulter), konsentrasjonen og størrelsen på biblioteket ble bestemt ved bruk av Life Technologies StepOne systemet (Thermo Fisher Scientific) og Ion Library TaqMan Kvantitering Assay Kit (Thermo Fisher Scientific).
Prøve emulsjon PCR, emulsjon bryte, og berikelse ble utført ved hjelp av Ion PGM IC 200 Kit (Thermo Fisher Scientific), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, en inngang konsentrasjon av en DNA-templat kopi /ion-Sphere Partikler (ISP) ble tilsatt til emulsjonen PCR masterblanding og emulsjonen ble generert ved hjelp av Ion Chef (Thermo Fisher Scientific). Mal-positive ISPer ble beriket og sekvensering ble foretatt ved hjelp av 314 BC chips på Ion Torrent PGM for 65 sykluser og barcoding ble utført ved hjelp av Ion DNA strekkoding kit (Thermo Fisher Scientific).
Variant ringer
data~~POS=TRUNC fra PGM kjøringer ble først behandlet ved hjelp av Ion Torrent plattformspesifikk rørledning programvare, Torrent Suite, for å generere sekvensen leser, trim adapter sekvenser, filter, og fjerne dårlig signal-profil leser. Initial variant ringer fra Ion AmpliSeq sekvense data er generert ved hjelp Torrent Suite programvare v4.0 med en plug-in » variant som ringer «program. For å eliminere feilaktige basen kall, ble tre filtrering trinn brukes til å generere endelig variant ringer. Det første filteret ble satt til en gjennomsnittlig dybde på total dekning av 100, en hver variant dekning av ved 20, og P-verdi 0,01. Den andre filter ble ansatt ved visuelt undersøke mutasjoner ved hjelp av Genomics Viewer programvare (https://www.broadinstitute.org/igv) eller CLC Genomics Workbench versjon 7.5.1 (Qiagen), samt ved å filtrere ut eventuelle trådspesifikk feil ; dvs. en mutasjon ble påvist kun i enten » plus «eller » minus» strand, men ikke i begge tilnærmingene av DNA.
Resultater og Diskusjon
Det er totalt 21 tumorprøver (10 fra bronkoskopi transbronchial biopsi, 6 CT-veiledet svulst biopsi og 5 kjerne-nål overfladisk lymfeknute biopsi) ble analysert. En medianverdi av ekstraherte DNA-konsentrasjonen var 115,2 ng /mL (29,3 minimum, maksimum 786,1) og en passende mengde av DNA ble anvendt for analysen. Som vist i tabell 1 og figur 2, analyser av resultatene av genmutasjon som oppnås ved Sanger-sekvensering var identisk i alle tilfeller til de som er avledet fra analysen ved hjelp av Ion PGM-systemet. Med hensyn til EGFR, analytiske resultatene oppnådd ved Sanger-sekvensering helt samsvarer de som oppnås ved den cycleave fremgangsmåten og Ion PGM-systemet. Ingen av svulstene som ble undersøkt hadde mutasjoner i både EGFR TK domenet og KRAS-genet.
(A) KRAS mutasjon (G12V) identifisert ved cycleave teknologi. (B) EGFR mutasjon (ekson 19 sletting) identifisert ved fragmentanalyse (C) KRAS-mutasjon (G12V) ble påvist med Ion PGM teknologi. C til A transversjon ble identifisert. (D) EGFR mutasjon (ekson 19 sletting) ble påvist med Ion PGM teknologi.
En annen EGFR mutasjon som metionin erstatter treonin i posisjon 790 (T790M) korrelerer med ervervet resistens til EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer [6]. I vår serie, 3 pasienter gjennomgikk en andre biopsi etter progresjon på behandling av EGFR tyrosinkinasehemmere. DNA-sekvensen av disse biopsiprøver ved vanlige Sanger-sekvensering viste T790M mutasjon i to tilfeller. Sekvensering ved hjelp av Ion PGM avslørte T790M mutasjon også i to tilfeller. I tillegg er blant 900 leser oppnådd, ble det T790M mutasjon observeres i 53 leser (5,9%) i den tredje pasienten. Selv om den detekterte antall leser var under terskelnivået, er det mulig at fremveksten av T790M er den primære årsaken til motstand mot EGFR-tyrosinkinase-inhibitor behandling i dette tilfellet.
Til tross for det lille antall tilfeller som ble analysert, tyder resultatene på at den Ion Torrent PGM er en praktisk og følsom fremgangsmåte som ville være egnet i praksis, da bare en liten mengde av ondartet vev er tilgjengelig og multipleks analyser av gener som er nødvendige for behandling planlegging. I tillegg til etterforskningen av genmutasjoner som utføres her, ytterligere informasjon om genetiske rearrangementer bør integreres i dagens kunnskap til å forbedre behandlingen av NSCLC og legge til rette for videre studier.
