Abstract
Bakgrunn
Sirkulasjons svulst DNA (ctDNA) bærer informasjon om tumorbyrde. Imidlertid er mutasjonen spektrum forskjellig blant tumorer. Denne studien er designet for å undersøke nytten av ctDNA for overvåking av tumorbelastning basert på en individuell mutasjon profil.
Metodikk
DNA ble ekstrahert fra til sammen 176 prøver, inkludert pre- og post- operasjonell plasma, primære svulster og perifere mononukleære blodceller (PBMC), fra 44 personer med kolorektal svulst som gjennomgikk kurativ reseksjon av kolorektale svulster, samt ni friske individer. Ved hjelp av et panel av 50 kreftassosierte gener, ble tumor unike mutasjoner identifisert ved å sammenligne single nucleotide varianter (SNVs) fra svulster og PBMC med en Ion PGM sequencer. En gruppe av tumor unike mutasjoner fra individuelle svulster ble utpekt som individuelle markør mutasjoner (MMS) til å spore tumorbelastning ved ctDNA hjelp dråpe digital PCR (ddPCR). Fra disse forsøk ble tre hovedmål vurderes: (a) tumor-unik mutasjoner; (B) mutasjon spektrum av en tumor; og (c) endringer i allelfrekvenser av MMS i ctDNA etter kurativ reseksjon av svulsten.
Resultater
Det er totalt 128 genet punktmutasjoner ble identifisert i 27 kolorektal tumorer. Tjueseks gener ble mutert i det minste i en prøve, mens 14 gener ble funnet å være mutert i bare en prøve, respektivt. Et gjennomsnitt på 2,7 genene ble mutert per svulst. Deretter ble 24 MMS valgt fra SNVs for tumorbyrde overvåking. Blant MMS funnet av ddPCR med 0,1% variant allelfrekvenser i plasma DNA, 100% (8 av 8) viste en nedgang i post-operasjon ctDNA, mens ingen av de 16 MMS funnet av ddPCR med 0,1% variant allelfrekvenser i plasma DNA viste en nedgang.
Konklusjoner
Dette panelet av 50 kreft-assosiert gener syntes å være tilstrekkelig til å identifisere individuelle, tumor-unik, muterte ctDNA markører i kreft pasienter. MMS viste den kliniske nytte i overvåkingen curatively behandlet tykktarmstumorbelastning dersom allelet hyppigheten av MMS i plasma DNA er over 0,1%
Citation. Sato KA, Hachiya T, Iwaya T, Kume K, Matsuo T , Kawasaki K, et al. (2016) Individualisert mutasjonsdeteksjons i Sirkulasjons Tumor DNA for overvåking tykktarms Tumor Burden Ved hjelp av en kreft-Associated Gene Sequencing Panel. PLoS ONE 11 (1): e0146275. doi: 10,1371 /journal.pone.0146275
Redaktør: Alvaro Galli, CNR, ITALIA
mottatt: 11 juni 2015; Godkjent: 15 desember 2015; Publisert: 04.01.2016
Copyright: © 2016 Sato et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Keiryoukai Research Foundation No.125 fra Iwate Medical University [KAS]; og departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan for MIAST (Medical Innovation av Advanced Science and Technology) prosjekt av tilskuddet-i-Aid for Strategic Research Foundation ved private universiteter [S1001001 til SSN]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kvantitativ vurdering av sirkulerende tumor DNA (ctDNA) har vist seg å være nyttig for overvåking av tumorbyrden som respons på behandling [1, 2]. Imidlertid muterte gener i mange typer av kreftformer bare utgjør noen få prosent av hele antallet gener som er tilstede, noe som tyder på at bare et begrenset antall av gener som er assosiert med kreftutvikling og progresjon [3, 4]. Derfor er et sett av selektive gener som er kjent å være assosiert med kreft er fundamentalt for å overvåke tumorbyrde. Faktisk, overvåking behandlingseffekten av ctDNA er utført ved hjelp av et sett av godt studert målgener, inkludert
KRAS
,
BRAF
,
HER2
og andre [5 -9]. På den annen side, er opplysninger om overvåking tumorbyrde etter kirurgiske inngrep begrenset fordi det er fortsatt ukjent hvor tumor unik muterte gener bør overvåkes for hver pasient [10]. Faktisk har data antydet at et begrenset antall tumor-unik mutasjoner kan representere tilstrekkelig volum og karakteristika (f.eks medikamentresistens) av individuelle tumorer [11]. Dersom et lite antall tumor-unik mutasjoner identifisert fra primære tumorer, da de kan bli anvendt for å detektere mutasjoner i ctDNA. Dette representerer en fordelaktig og kostnadseffektiv tilnærming for overvåking av tumorbyrde etter kirurgiske inngrep.
Ideen om å bruke ctDNA fra kreftpasienter å overvåke tumorbyrden førte oss til å utforme denne studien fokusert på pasienter med kolorektal kreft som hadde fått kurativ fjerning av tumoren. Vår strategi var å samle individuelle kolorektal kreftprøver gjennom endoskopisk eller laparoskopisk colorectal svulst kurativ reseksjon samt blodprøver. I motsetning til tidligere studier ved hjelp av ekstremt avanserte svulster, inkludert tilfeller med ufullstendig reseksjon [1, 2, 7], våre resultater viser at enkelte markør mutasjoner (MMS) i ctDNA kan være nyttig for å overvåke postoperativ, resektabel kolorektal tumorbelastning på grunnlag av nedsatt allel frekvensen av ctDNA i postoperativ plasma.
Pasienter og metoder
menneske~~POS=TRUNC og studiedesign
Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Iwate Medical University i samsvar med Helsinkideklarasjonen deklarasjonen~~POS=HEADCOMP (HG H24-22). En individuell skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne og alle analyser ble utført anonymt. I prinsippet pasienter var kvalifisert dersom kirurgisk eller endoskopisk reseksjon ble indikert for godartede eller Stage 0 til III tykktarmssvulster, og hadde ingen tidligere historie med noen behandling på tidspunktet for informert samtykke. Alle analyser saker ble pålagt å gi følgende fire typer materialer: pre- og post-operativ plasma (minst 24 timer etter tumor reseksjon), primærtumor og perifere mononukleære blodceller (PBMC). Blodprøver ble tatt for rutinemessig før og etter operative laboratorieundersøkelser. Enten åtte eller 16 ml blod ble samlet i en BD Vacutainer CPT blodprøverøret (Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, New Jersey). Innen to timer etter innsamling, ble rørene sentrifugert ved 1800
g
i 20 minutter ved romtemperatur for å skille seg i plasma og PBMC-lag. Den øvre fase av åtte ml blod ble deretter overført inn i en fem ml rør som er merket med pasientens-unikt identifikasjonsnummer. Rørene ble umiddelbart lagret ved -80 ° C til DNA-isolasjon. Totalt genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit for plasma og QIAamp DNA Mini Kit for primære svulster og PBMC (Qiagen, Venlo, Nederland). Mengden av ekstrahert DNA ble målt ved bruk av Qubit® 2,0 dsDNA høy følsomhet assay (Life Technologies, Carlsbad, CA). I denne studien, bekreftet vår foreløpige eksperiment som forlater 5-7mm av «bufring» lag fra buffy coat etter sentrifugen hindrer tilstrekkelig plasmalaget mot forurensning av blod og celleavfall, og gir akseptabel DNA kvalitet [12, 13]. Relativ kopiantallet av genomet i plasma-DNA ble også beregnet ved kvantitativ PCR-(qPCR) for den LINE-1-genet ved hjelp av primersettene tidligere beskrevet [14].
DNA ekstraksjon fra human koloncancercellelinje
den menneskelige tykktarmskreft cellelinje, HCT116, ble innhentet i 2008 fra Seksjon for kreft behandling og diagnostisering Tumor Repository, National Cancer Institute (NCI MTA # 1-2093-08). Cellelinjen ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% FBS og det genomiske DNA ble ekstrahert ved anvendelse av en DNA-QIAamp Mini Kit (Qiagen, Venlo, Nederland) i løpet av tre passeringer etter tining.
Multiplex PCR og bibliotek konstruksjon med CHPv2
CHPv2 er en pool av PCR-primere som er rettet mot 207 amplikonene for 2885 mutasjoner i 50 kreftassosierte gener [15] (Life Technologies, Carlsbad, California). Hele listen over gener er tilgjengelig gjennom leverandørens hjemmeside (https://tools.invitrogen.com/downloads/cms_106003.csv). Omtrent 10 ng av DNA per prøve ble brukt til amplikonet produksjon ved multipleks PCR ved anvendelse av Ion AmpliSeq CHPv2 og Ion AmpliSeq Library Kit 2,0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Den resulterende multipleks PCR reaksjon bassenget ble brukt for målsekvens bibliotek forberedelse. Primer sekvenser for multipleks PCR ble delvis fordøyd for å ligere strekkode adaptere (Ion P1 Adaptor og Ion XpressTM Bacode X, Life Technologies, Carlsbad, CA) etterfulgt av en perle-basert nukleinsyrerensing system (AMPure® XP Reagent, Life Technologies, Carlsbad , CA). Etter bekreftelse på at den endelige biblioteket fragment størrelse nådde 130 bp, ble biblioteket fragmenter clonally forsterket av emulsjon PCR (Ion PGM Mal OT2, Life Technologies, Carlsbad, California). De emulsjon partikler som inneholder clonally forsterket PCR-fragmentene ble deretter påført på en halvleder-sekvense chip (Ion 316 Chip, Life Technologies, Carlsbad, CA) for massiv parallell sekvense på en Ion PGM sequencer (Life Technologies, Carlsbad, California).
Target dypt sekvense
sekvense data ble lagret i BAM format for nedstrøms analyse. Sekvenser justering ble vurdert med Torrent Suite V.3.6.2 programvare (Life Technologies, Carlsbad, California) for å analysere strek leser og juster leser til referanse genomet (human genome build19; hg19). For påvisning av variasjoner i den målsøkte sekvensen, ble graden av dekning av hvert fragment satt til å oppnå i det minste den midlere dybde av 1400 x for primærsvulster og 700 x Plasma-DNA, hvor det Ion Torrent Variant Anroper v3.6 ble satt ved et allel frekvens over 0,1% for en variant. En Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/) ble også brukt til å visualisere justeringen, som er tillatt for oss å inspisere feilaktig definerte varianter av strand partiskhet og sekvense feil.
identifisering og gjenkjenning av gener for potensielle MMS
MMS fra primærsvulster ble utpekt til å prioritere single nucleotide varianter (SNVs) som var sannsynlig å bli oppdaget i ctDNA. Målrettet sekvense fra Kreft Panel identifisert tumor unik SNVs (dvs. somatiske mutasjoner) ved å sammenligne sekvense resultatene av primærtumor og tilsvarende PBMC (dvs. germline polymorfismer). Kort beskrevet algoritmen for identifikasjon av tumor unike mutasjoner er som følger: (a) Filter kort leser ( 50 nt) ved anvendelse fastaq fil for DNA fra svulsten, PBMC, og plasma; (B) Kart filtrert fragmenter på hg19 bruker Burrows-Wheeler Aligner for DNA fra svulsten, PBMC, og plasma; (C) Detect SNVs hjelp GATK Unified Genotyper for DNA fra svulsten eller PBMC; (D) Listen tumor-unik SNVs ved å sammenligne SNVs fra tumoren og PBMC; og (e) Identifiser tumor-unik mutasjoner fra tumor-unik SNVs som ble kartlagt på målsekvensen fra CHPv2. Hele prosessen med algoritmen gjennomføring tar seks timer ved bruk av en vanlig stasjonær datamaskin (Intel Core 2 Duo-prosessorer med 3 GB tilfeldig Tilgang minne) for 1,5 GB sekvense data. De resulterende tumor-unik mutasjoner kan bli brukt som ctDNA markører. Vår egen algoritme identifiserer primære tumor SNV fragmenter som er forskjellig oppdaget fra PBMC DNA. Det gir mulighet for valg av fragmentene med høy allel frekvens, som har en høy sannsynlighet for deteksjon i ctDNA [11]. Av de resulterende tumor unike mutasjoner i noen variant frekvenser av SNVs, MMS for hver svulst ble prioritert basert på følgende kriterier: (a) mer enn 10 variant dekning; (B) mer enn fem variant dekning hvis ingen mutasjoner hadde mer enn 10 variant dekning; og (c) tilgjengelighet av validert QX200
TM Droplet Digital
TM PCR System (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) primer og probe sekvenser (S1 tabell). Allelet frekvens på MMS i plasma ble overvåket av ddPCR hjelp av spesifikke primer og probe sett.
ddPCR
Hver blanding ble utarbeidet med 20 mL reaksjon buffer, 2 x ddPCP SuperMix for prober (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA), og 10 ng templat-DNA. PCR-reaksjonsblandingene ble separert i ensartet størrelse emulsjonsdråper. Dråpene ble fordelt i en 96-brønners mikroplate for bruk med et konvensjonelt termosykler. En standard PCR-reaksjon ble benyttet som følger: 40 sykluser ved 94 ° C i 30 s og 55 ° C i 60 s; og en endelig forlengelse ved 98 ° C i 10 minutter, hvorav glødetemperaturen var kan endres avhengig av primerne. Produktet ble lagret ved 4 ° C. PCR-produktet ble deretter plassert inn i QX200 dråpe leser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), og resultatene ble analysert ved anvendelse QuantaSoft v1.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Statistisk analyse
Enten JMP 10,0 (SAS Institute, Cary, NC) eller Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) ble brukt for statistisk analyse. Clinicopathological og sekvense verdier og frekvenser ble analysert ved hjelp av χ
2 test, Fishers eksakte test, og student
t
-test, avhengig av faggrupper.
Resultater
pasienter
Mellom mai 2013 og 2014 august 37 pasienter med avansert kolorektal kreft og 22 endoskopisk-resektable kolorektale tumorer ble samtykket til studien før en endelig histopatologisk diagnose. Innmelding av pasienter /friske individer og oversikt over studier presenteres (fig 1). I operasjonen gruppe, seks pasientene ikke er kvalifisert: fem pasienter ble funnet å ha Stadium IV sykdom i løpet av kirurgi og en pasient hadde flere primære kreft lesjoner. Blant kvalifiserte pasienter prøven anskaffelsesprosessen mislyktes i tre tilfeller. Derfor ble 28 fullprøvesett hentet fra 31 kvalifiserte pasienter. I endoskopi gruppen, en pasient nektet å delta i studien, og en pasient hadde nyresvikt etter opptak. Blant kvalifiserte pasienter, fire pasienter hadde svulster som var for liten for prøvetaking. Derfor ble 16 fullprøvesett hentet fra 20 kvalifiserte pasienter. Blod fra 10 friske individer (dvs. pasienter i alderen 22 og 68 år, tre kvinner og sju menn) ble også samlet inn ved hjelp av den samme skriftlig informert samtykke. En frivillig ble funnet å være gravid etter å ha tatt en blodprøve og dermed utelukket. Totalt sett, minst én type av prøve ble erholdt fra 60 individer, og en total på 176 prøver av settet av fire materialer fra 44 pasienter ble oppnådd (figur 1). Clinicopathological karakteristika for pasienter (tabell 1) og tumor-markør nivåer (carcinoembryonic antigen; CEA) er summert (S1 Fig). I operasjonen gruppe, ble det observert at 30 av 31 (96,8%) kvalifiserte pasienter i minst ett år. Fire av de 30 (13,3%) pasienter tilbakefall og ingen pasienter døde i løpet av observasjonsperioden (median: 14,3 måneder). Ingen pasienter i endoskopi gruppen hadde ennå ikke besøkt vårt sykehus etter tumorreseksjon per februar 2015.
Alle prøvene ble samlet inn prospektivt. Prøvene ble samlet inn fra følgende tre grupper; Kirurgi, Endoskopi, og friske frivillige. Kirurgi og Endoskopi grupper inneholder Pre (pre-operative plasma), PBMC, Tumor, og Post (postoperativ plasma) prøver. Prøver fra pasienter viser Stage IV sykdom, utilstrekkelig prøvestørrelse, eller utilstrekkelig ekstrahert DNA mengde ble ekskludert fra studien (detaljert informasjon i tekst). Fargen i hver boks angir hvilke prosedyrer ble brukt for analyse hver type prøve.
kvalitetsvurdering av ekstrahert DNA
median (spredning) total mengde DNA fra primære svulster, plasma DNA, og PBMC var 9,4 mikrogram (1,4 til 12,0), 58,1 ng (15,4 til 915), og 4,7 mikrogram (03.02 til 10.03), henholdsvis. Plasma DNA Utbyttet var tilstrekkelig til å utføre nedstrøms analyser, inkludert sekvens bibliotek konstruksjon og ddPCR. Mengden av plasma DNA (range; 83-5,435 ng /ml per plasma) viste svært høy positiv korrelasjon (r = 0,9651, p 0,0001) med kopiantallet av
LINE-1 product: (range; 3050985 -232,689,225 kopier /ml per plasma) (S2 Fig). Samlet våre resultater viser at 22,9 ng DNA i gjennomsnitt kan fås fra en ml plasma.
Kvalitetsvurdering av Ion PGM sequencer
Før sekvensepasientmateriale, sekvense kvaliteten på Ion PGM ble sikret ved hjelp av seriefortynnet genomisk DNA fra HCT116 human koloncancer cellelinje tilsatt i oppløsningen av genomisk DNA fra PBMC fra en frisk frivillig (figur 2). Vi først bekreftet at HCT116 cellene bære 10 genmutasjoner fra 50-gener CHPv2 (S2 Table), mens den sunne menneskelige frivillige DNA ikke har vesentlige mutasjoner. Basert på offentlig tilgjengelig informasjon, har 1177 mutasjoner i HCT116 blitt rapportert (https://cansar.icr.ac.uk/cansar/cell-lines/HCT-116/mutations/#). Blant de 10 muterte gener som finnes i denne studien, har fire blitt registrert i den kosmiske database over HCT116, mens de resterende seks var romanen. Spesielt ble det ingen kjente mutasjoner savnet i 50-genene som omfattes av primer sett i CHPv2. For å adressere følsomhet, ble genomisk DNA oppnådd fra en frisk frivillig tilsatt genomisk DNA fra HCT116 tykktarmskreftcellelinje ved fire forskjellige konsentrasjoner (100, 1, 0,1, 0,01 og 0,001% i volum /volum) (Fig 2). Den gjennomsnittlige sekvens dekning av alle amplikonene for de nevnte konsentrasjonene var 1287,7 (100%), 1456,7 (1%), 1412,5 (0,1%), 1708,2 (0,01%), og 1464,3 (0,001%), henholdsvis. I tillegg variasjonskoeffisienter (CV) av variant frekvenser av de muterte fragmenter var 33,4% (100%), 49,9% (1,0%), 125,6% (0,1%), 84,7% (0,01%), og 115,6% (0,001 %), henholdsvis. Totalt sett er rimelig lineære området mellom de angitte konsentrasjoner og detektert allel frekvens med den Ion PGM sekvens syntes å være mellom 0,1 til 100%. Derfor, er sensitiviteten av sekvenseringsfremgangsmåten for variant frekvenser ved hjelp av Ion PGM mer enn 0,1% med tilstrekkelig sekvens lyder.
Horisontalaksen indikerer konsentrasjonen av spiked DNA fra HCT116 tykktarmskreftcellelinje i oppløsning av DNA fra en frisk donor ikke-kreft. HCT116 er kjent for å ha flere genmutasjoner og således konsentrasjonen av mutasjonen fragmentet ble seriefortynnet. Den vertikale aksen er allel frekvens som faktisk detekteres med den Ion PGM. Hver farge punkt indikerer den detekterte allelet hyppigheten av kreftassosierte mutasjoner i den tilsvarende DNA-konsentrasjonen avledet fra HCT116 som strekker seg 0,001 til 100%. Navnene på de muterte gener er angitt i forklaringen til høyre.
mutasjons spekter av kolorektal tumorer identifisert av CHPv2
Totalt 15.354.178 leser og 1,636,525,575 basen sekvensdata ble innhentet fra 27 primærsvulster og tilsvarende PBMC ved hjelp av en Ion PGM sequencer. De tumor unik muterte gener ble deretter identifisert ved hjelp av vårt egenutviklede algoritmen (se pasienter og metoder). Først satt vi varianten allelfrekvens 0,1% og funnet at 440 til 885 gen forandringer var tumor-unik mutasjoner basert på sammenligning mellom PBMC og primære svulster. Sekvense resultater av primære svulster hentet fra IonPGM ble bekreftet av ddPCR for prøver som kan vurderes (S3 Fig). For en streng analyse, er variant dekning av en av de viktige faktorene for datapålitelighet (S4 Fig). Derfor analyse ble utført med gener hvis variant dekningen var 10, noe som resulterer i totalt 128 gen punktmutasjoner (figur 3A). Siden noen tilfeller besitter flere forandringer i en enkelt gen, det totale antall endrede gener i denne studien for analysen var 73. Derfor er den gjennomsnittlige mutasjonen per tumor var 2,7 av de 50 gener (gjennomsnitt ± standardavvik 2: 2,7 ± 2,9) . Tjueseks gener ble mutert i minst en prøve (26/50, 52%), mens 14 gener (14/50, 28%) ble mutert i kun ett eksemplar, henholdsvis. Vanlige muterte gener inkludert
TP53 plakater (19/27, 70%),
KRAS plakater (10/27, 37%), og
APC plakater (6/27, 22 %). Tre kreftprøver tatt med alle disse mutasjonene, noe som tyder på at endringer av genetisk opphopning typiske for en adenom-karsinom-sekvensen kan ha skjedd i disse prøvene [16, 17] (figur 3B). Disse observasjonene synes å støtte tidligere rapporter fra exome sekvensering av tykktarmssvulster i form av å fange mutasjons karakteristikker av kolorektal tumorer [18], noe som tyder på at 50 kreft-assosiert genet satt rimelig rekapitulerer mutasjons spekteret av svulstene. Mutasjonsraten basert på multipleks PCR lengden hentet fra CHPv2 og antall mutasjoner med dekning 10 (73 muterte gener) var ca 2246 per 10
6 nukleotider (dvs. 207 primer par av gjennomsnittlig PCR produkt lengde 157bp) Dette antyder at CHPv2 ble anriket i forhold til den mutasjonsdeteksjonsraten fra en exome-sekvens, hvor et flertall av kolorektale tumorer viste 1-100 mutasjoner per 10
6 nukleotider [18].
a, mutasjons~~POS=TRUNC typer. Seks typer mutasjoner ble oppdaget med CHPv2. b, Tumor-unik mutasjon profil etter allel frekvens. Hver kolonne betegner et tumor-unik mutasjon av et individ tumor. Hver rad betegner kreftassosierte gener i CHPv2. Fargen indikerer varianten allel frekvensen angitt i fargelinjen.
Påvisning av MMS i plasma DNA
median (spredning) plasma DNA nivåer av friske individer, endoskopisk-resektable svulster , og avansert kreft var 4.2 (02.06 til 10.04), 6,8 (2,1 til 100,6), og 9,2 (3,8 til 228,8) ng /ml i plasma, henholdsvis (S5 fig). For mutasjonsdeteksjon i plasma DNA, ble 66 MMS valgt fra de 320 tumor unik SNVs henhold til kriteriene som er beskrevet i Pasienter og metoder. Følgende mutasjoner, som er rapportert i mange forskjellige krefttyper, dukket opp mer enn en gang i flere svulster:
KRAS plakater (G12C) x2;
KRAS plakater (G12D) x4;
KRAS plakater (G12V) x3;
TP53 plakater (R273C) x2; og
BRAF plakater (V600E) x3, noe som resulterer i totalt 57 unike MMS (S3 Table). MMS ble først undersøkt ved hjelp av Ion PGM for Cases 1, 2 og 3, men ingen av de åtte MMS i plasma DNA viste en høy nok variant dekning (fig 4A og S4 tabell). Selv om noen gener påvist redusert allel frekvens i en tumorbyrde avhengig måte, den grad av dekningen var ikke pålitelig høy nok i de foreliggende tilfeller (S6a Fig).
a, MMS overvåkes med mutasjonen allelet frekvens ved hjelp av en ion PGM. Tre, en, og tre MMS ble anvendt for å overvåke tilfeller 1, 2 og 3, respektivt. De tilsvarende serumnivåer av CEA er vist. b, MMS overvåkes med mutasjonen allelfrekvens av ddPCR. En eller to MMS ble anvendt for å overvåke i de representerte tilfeller. Den horisontale stiplede linjen viser den øvre grense for det normale område av CEA-serumnivåer (3,4 ng /ml). Hvert tall i tilknytning til hvert datapunkt er allelet frekvens for gener; og serumverdier for CEA.
aStop kodon,
bSplice nettstedet.
Siden Ion PGM ikke synes å være følsom nok til å oppdage sjeldne alleler, bestemte vi oss for å bruke ddPCR å oppdage MMS i pre- og post -operative plasma DNA. Selv om digital PCR krever en spesifikk primer /probe angir for hver mutasjon, etterfulgt av kvalitet validering av qPCR [10], er minst 3 ganger mer følsom enn den for dype sequencers [19] den digitale PCR. I denne studien, var vi i stand til å validere 19 unike primer /probe sett av qPCR for bruk i kvantifisering mutasjoner i plasma ved ddPCR (S1 tabell). Siden noen tilfeller hadde flere MMS, den 19 validert ddPCR primer /probe sett representerte totalt 24 MMS for 19 tilfeller (S5 Table). Elleve mutasjoner (i 9 pasienter) som matchet primære svulster var tydeligvis til stede (minimum allelfrekvens 0,032%) i pre-operative plasma (fig 4B, S5 tabell, og S6B figur). I postoperativ plasma DNA, 8 av 24 (33,3%) MMS vist en nedadgående trend som tilsvarte 6 av 19 pasienter (31,6%), inkludert to pasienter med flere MMS (fig 4B og S6B Fig). Viktigere, 100% (8 av 8) MMS med 0,1% allel frekvens i pre-operativ plasma DNA oppviste en reduksjon i post-operasjons prøver (figur 4B), mens ingen av de 16 MMS med mindre enn 0,1% allel frekvens i pre-operativ plasma DNA oppviste en reduksjon i post-operativ plasma DNA (fig 4B og S6B fig). Den reduserte trend fås ved MMS med 0,1% allelfrekvens korrelert godt med serum CEA nivåer. Det var 2 pasienter som hadde tilbakefall innen ett år observasjonsperioden (sak 5 og 6). Begge sakene viste en klar nedgang på MMS i postoperativ ctDNA (fig 4B), men ingen bemerkelsesverdig mutasjons profilen ble identifisert i begge tilfeller.
Diskusjoner
Settet av genmutasjoner i en svulst er svært mangfoldig. Derfor bør en individuell sett av tumor-avledet muterte gener være passende biomarkører for enkelte fag. Hele genomanalyse og exome sekvens er ikke kostnadseffektivt for dette formål, ettersom mer enn 99,99% av genomet eller exome sekvens i primærsvulster ikke oppviser mutasjoner [4, 18]. Her har vi identifisert tumor unike mutasjoner med en CHPv2 på Ion PGM og deretter overvåket tumorbelastning med MMS med ddPCR fra en svært liten mengde plasma DNA. Siden vår tilnærming synes å være tilstrekkelig for å oppnå god kvalitet mutasjons informasjon i forhold til hele genomet eller exome sekvens teknologier, kan det være umiddelbart gjeldende i klinisk praksis.
Nytten av mutasjonsdeteksjon i ctDNA har blitt rapportert i svært avanserte pasienter med kolorektal kreft, de fleste av dem opplevde tilbakefall, progresjon eller død innen ett år etter første behandling [1, 2, 5, 9, 20, 21]. Disse svært avanserte tumorer (dvs. trinn IV) anses å ha en høy risiko for tilbakefall eller progresjon [22], slik at rollen av ytterligere markører kan være begrenset i dagens praksis. Faktisk kan de fleste pasienter med kolorektal kreft behandles med kurativ hensikt (dvs. Stage II-III), som har 5-års sykdomsfrie renter har blitt rapportert å være omtrent 70% [23, 24], noe som tyder på at omtrent 30 % av pasientene fortsatt krever nøye overvåking for tilbakefall. For tiden, er CEA en av de eneste molekylære markører for rutinemessig anvendelse i overvåking av postoperativ oppfølging [25]. Imidlertid er det blitt rapportert at overlevelsesfordel ved CEA overvåking og etterfølgende kirurgisk behandling er sannsynlig å være liten [26]. Denne observasjonen er sannsynligvis på grunn av det faktum at øket CEA-nivåer er: (i) en dårlig prediktor for lokalt tilbakefall; og (ii) en forholdsvis sen hendelse [27]. I motsetning til CEA, ctDNA reagerer raskt, er spesifikk for tumorbyrde, og er synlig uavhengig av histologisk type [2]. Imidlertid bør det bemerkes at en av de viktige problemene av å bruke ctDNA i trinn II-III-pasienter er deteksjonsfølsomhet. Forekomsten av primære tumor-drevet mutasjoner i ctDNA har bare en 0,1 til 10,0% variant allel frekvens, selv i meget avanserte tumorer [10, 11, 28]. Derfor, for ctDNA å bli brukt som en biomarkør for Trinn II-III eller til og med trinn I kolorektal kreftpasienter, ideelt sett følsomheten er lavere enn 0,1% [19]. Nye fremskritt i digital genomiske sekvense teknologier, inkludert perler, emulsjon, forsterkning og magnetisme (strålte) [29], merket-fragment dypt sekvensering (Tam-Seq) [10], safe-sekvenseringssystem (Safe-SeqS) [30] og feiltrykt multiplex dypt sekvensering [31], og Duplex sequencing [32] har nærmet denne følsomheten etterspørselen. Disse metodene er faktisk svært nøyaktig, men har ikke vært fullt aktuelt å søke mutasjoner med flere amplikonene fra et begrenset kopi rekke maler som ctDNA [30]. I denne studien, må vi først identifisert tumor unike mutasjoner av Ion PGM, og deretter disse mutasjonene ble analysert ved hjelp av ddPCR. Den ddPCR krever primer /probe design og validering for tidligere identifikasjon av hver mutasjon i primærtumor, men det krever ikke bassenget eller dyp-sekvensering. Vi har bekreftet at ddPCR var egnet for kvantitativ måling av sjeldne varianter ved et mutant allel fraksjon på 0,1% eller mer (en mutant molekyl i en bakgrunn av 1000 vill-type molekyler) [1, 33, 34]. For praktisk bruk av ctDNA som en svulst byrde overvåking markør, kan bare et fåtall sikkert identifisert mutasjoner fra primærsvulster være pålitelige markører. Vår nåværende strategi er derfor rimelig for klinisk tumorbyrde overvåking spesielt for postoperative pasienter med kurativ hensikt.
Gene endringer som er involvert i de tidlige stadier av tumordannelse er tydeligvis en fordel som MMS, fordi de skal være involvert i etableringen av tumorigene kloner [4]. I prinsippet har genetisk heterogenitet av en tumor vært ansett for å være et resultat av heterogene akkumulering av genetiske endringer på toppen av forstadier eller tidlig kreft lesjoner [35, 36]. Faktisk mutasjoner av
TP53
,
KRAS
,
KIT
, og
CDKN2A
ble påvist i endoskop gruppe svulster samt avansert kreft, noe som tyder at disse mutasjonene blir overført i prosessen med kreftutvikling og spre seg ut i hele tumormasse. Dersom en gitt mutasjon er assosiert med tidlig utvikling av kreft svulsten, deretter mutasjonen deteksjons skjevhet i ctDNA på grunn av tumor heterogenitet bør minimaliseres. Imidlertid kan identifisering av gener som er spesielt involvert i den tidlige utviklingen av enkelte svulster være utfordrende. I den foreliggende undersøkelse, kan det være vanskelig å ta opp klonal heterogenitet av en tumor i mutasjonen profilering med liten cancer-assosierte genet sekvense panelet fra en enkelt biopsi pr primær tumor. Ideelt sett alle mutasjoner, også de med lave allelfrekvenser i primærtumor fra en enkelt biopsi, bør undersøkes i ctDNA. Imidlertid påvisning av ekstremt lav frekvens allel kan ikke være hensiktsmessig ennå på grunn av mangel på ddPCR primer /probe-sett for hver enkelt nukleotid endring av alle kodende områder. Mutasjons profilering med flere biopsier fra en tumor kan være et alternativ for å kompensere for klonal heterogenitet, men denne tilnærmingen er som ennå ikke er mulig for små svulster, som for eksempel polypper og reseserbare tumorer. Derfor vurdering av klonal heterogenitet av en tumor kan ikke være fullt ut gjennomførbart i tidlig kreft. I mellomtiden, mutasjoner med høy utbredelse i primærsvulster-MMS fra en kreft-assosiert gensekvensering panel i denne studien-kan være en av de beste surrogater for denne tilnærmingen [11].
I sammendraget,
