Abstract
En av de viktigste faktorene i å velge en behandlingsstrategi for kreft er karakterisering av biomarkører i kreftceller. Spesielt nylige fremskritt i monoklonale antistoffer (MTB) som primær-spesifikke legemidler rettet mot kreft reseptorer viser at deres effekt avhenger sterkt av karakterisering av tumor biomarkører. Vurdering av deres status hos enkelte pasienter ville lette valget av en optimal behandlingsstrategi, og kontinuerlig overvåking av disse biomarkører og deres binding prosess til behandling vil tilveiebringe et middel for tidlig evaluering av effekten av terapeutiske inngrep. I denne studien har vi påvist for første gang i levende dyr som fluorescens levetid kan brukes til å påvise bindingen av målrettede optiske sonder til de ekstracellulære reseptorer på tumorceller
in vivo
. Tanken var at fluorescens levetiden til en spesifikk sonde er følsom for lokale miljøet og /eller affinitet til andre molekyler. Vi festet nær-infrarødt (NIR) fluorescerende prober til human epidermal vekstfaktor 2 (HER2 /neu)-spesifikke Affibody molekyler og brukt vår tid-løst optisk system for å sammenligne fluorescens levetid av de optiske sonder som ble bundet og ubundet til kreftceller i levende mus. Våre resultater viser at fluorescens levetid endringer i vår modell system avgrense HER2 reseptoren bundet fra ubundet probe
in vivo
. Således er denne fremgangsmåte anvendbar som en spesifikk markør av reseptoren bindeprosessen, som kan åpne en ny paradigme i «image og behandle» konsept, spesielt for tidlig evaluering av effekten av terapien
Citation.: Ardeshirpour Y, Chernomordik V, Zielinski R, Capala J, Griffiths G, Vasalatiy O et al. (2012)
In Vivo
Fluorescence Lifetime Imaging Skjermer Binding av spesifikke prober til Cancer Biomarkers. PLoS ONE 7 (2): e31881. doi: 10,1371 /journal.pone.0031881
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 16 juni 2011; Akseptert: 19. januar 2012; Publisert: 23 februar 2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen er støttet av egenutført Research Program av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development og av National Cancer Institute , Imaging Probe Development Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health. Som YA, RF, VC, JC, GG, OV, AS, JK, IL, AG og MH er ansatte i National Institutes of Health; dette Funder spilte en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet. De andre organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
en av de viktigste faktorene i å velge en riktig behandlingsstrategi for kreft er karakterisering av biomarkører i kreftceller, og dette kan være ganske utfordrende. Spesielt nylige fremskritt i monoklonale antistoffer (MAB) som primære ikke-spesifikke medikamenter, og er rettet tumor-reseptorer, viser at deres effektivitet er sterkt avhengig overekspresjon av spesifikke reseptorer.
Videre er en av de viktige faktorer som ofte mangler i kreftbehandling (hovedsakelig ved hjelp av MTB) er kontinuerlig overvåking responsen av tumor reseptorer til behandling, særlig på et tidlig stadium, for å kvantifisere bindingen, som er avgjørende for vurderingen av legemidlets effekt.
Gjeldende standard
ex vivo
metoder, for eksempel, immunhistokjemi (IHC), genamplifikasjon demonstrert av Fluorescent
In Situ
Hybridisering (FISH), og Enzyme-Linked immunsorbent analyse (ELISA), er invasiv og krever biopsier fra pasientene. Naturlig, biopsier har en risiko for mangler ondartet lesjon og, i løpet av den terapeutiske syklus, blir det antall ganger som den biopsi kan tas begrenses [1]. Alternative metoder for tiden under vurdering er basert på farmakokinetikken til radionuclide sonder i PET etter injeksjon i blodsirkulasjonen [2].
In vivo
fluorescens bildebehandling er et alternativ ikke-invasiv avbildningsteknikk, som kan brukes separat eller i adjunction med andre modaliteter for rettidig overvåking av biomarkør i løpet av behandlingen. Denne metoden er enkel og portabel.
Nylige fremskritt innen fluorescerende prober, rettet mot spesifikke sykdoms biomarkører, har åpnet en ny æra i
in vivo
fluorescens bildebehandling. De gjør det et lovende verktøy for medisinsk diagnostikk [3] – [8]. Spesielt utviklingen av nær infrarød (NIR) fluorescerende prober har forbedret evnen til
in vivo
fluorescens bildebehandling, på grunn av lav autofluorescence bakgrunn og dyp penetrasjon av NIR lys i vevet [9].
fluorescens avbildning kan realiseres i form av måling av fluorescens-intensitet fordelingene og /eller fluorescens levetid [10] – [18]. Fluorescens levetid bildebehandling er basert på vurdering av den gjennomsnittlige tiden som elektronisk spent fluorophore forblir i opphisset tilstand før overgangen til en grunntilstanden, ledsaget av foton emisjon. Fluorescens levetid kan måles ved tidsdomene eller frekvensteknikker [19] – [22]. I denne studien, har vi brukt mer nøyaktig førstnevnte metode og målte den eksponentielle forbigående nedbrytning av fluorescens-intensitet med tiden etter vurdering av virkningen av impulsresponsen til systemet. Det har vist seg at fluorescens levetid er uavhengig av konsentrasjonen av fluoroforene og intensiteten av eksitasjonslyset. Fluorescens levetid kan forbli konstant selv innenfor femdoblet svingninger i intensiteten av eksitasjonslyset [23]. På den annen side kan det være følsom for lokal biokjemiske miljø, f.eks, temperatur og pH-verdi eller molekylære interaksjoner [24], [25]. Denne egenskapen gjør at fluorescens levetid imaging en lovende kandidat for å oppdage og overvåke spesifikke kreft reseptorer i diagnostisering og behandling av sykdommer. En annen viktig anvendelse av denne teknikken er å undersøke effektiviteten av tidlig-fase behandlingseffekt ved overvåkning av bindingen av medikamentmolekyler til tumorcellene.
I denne studien vi målrettet Human epidermal vekstfaktor 2 (HER2 /neu) reseptoren, som er en av de viktige biomarkører i mange kreftformer, inkludert bryst- og eggstokk-kreft [26]. Overekspresjon av denne reseptoren korrelerer med dårlig prognose og motstand mot spesifikke kjemoterapier [27]. For å optimalisere behandlingsprosedyren, er det viktig å vurdere ekspresjonen av HER2-reseptoren i den diagnostiske fremgangsmåten, og for å overvåke det
in vivo
i løpet av behandlingen. For å vurdere status for denne reseptoren, søkte vi en HER2-spesifikk Affibody konjugert til nær infrarød (NIR) fluorescerende fargestoff.
Selv om flere nyere studier har vist økt Signal /støyforhold for
in vivo
fluorescens bildebehandling av bur fluoroforen fargestoffer ved hjelp Polymersomes [28], nanorør [29] eller ved hjelp av nanopartikler [30] som et alternativ for et enkelt molekyl fluoroforer, Affibody-DyLight750 konjugat, undersøkt i manuskriptet, synes å være en bedre egnet probe for vårt mål, dvs. karakterisering av HER2 reseptorer overekspresjon i svulster
Invivo
Affibody molekyler [31] -. [34] er svært stabile proteiner. De er forholdsvis liten (8,3 kDa), omtrent 20 ganger mindre enn antistoffer. Som alle andre små molekyler, kan de hope seg opp i svulsten gjennom utette kreft vasculatures. Deres store diagnostisk fordel er at de kan bli gjort svært spesifikke for bestemte kreftcellereseptorer, for eksempel, HER2. Etter binding til disse reseptorene, den løse prober vaske ut og hovedsakelig bundet fluorescerende ligander bidra til signalet fra tumorområdet på senere tidspunkt. Dette forbedrer kontrasten av svulsten, i forhold til bakgrunnen.
I vår forrige undersøkelse, har vi vist at de dynamiske endringer i fluorescens intensitet nivåer av HER2-spesifikke Affibody proteiner, konjugert med et fluorescerende fargestoff, kan bli brukt til å kvantifisere HER2-ekspresjon i tumorceller [35] – [37]. Relativt rask farmakokinetikken til Affibody-DyLight750 konjugat akselererer datainnsamling og forenkler deres analyse. Fremgangsmåten presentert i det aktuelle manuskript, skjønt mindre kvantitativ på det nåværende stadium sammenligne med farmakokinetikken analyse, tillater en å vurdere HER2 status av tumoren fra bare en tids-oppløst måling. Det krever ikke gjentatt målinger av fluorescens fra svulsten etter at sonden injeksjon som innebærer mye lengre tid for observasjon. Foreslått tilnærming kan brukes til en foreløpig vurdering av HER2 uttrykk i tumor. Det er inkludert for kvantitativ karakterisering av HER2-reseptorer, basert på farmakokinetikk.
På den annen side har det blitt vist i våre tidligere studier [35] som HER2 Affibody binder til en forskjellig epitop av HER2-reseptoren enn epitop, målrettet av slike utbredt monoklonale antistoffer som trastuzumab eller pertuzumab. Dette muliggjør overvåking av HER2-ekspresjon under behandlingen uten interferens med den potensielle effekt av disse stoffene [35].
I denne studien undersøkte vi i levende dyr hvorvidt binding av den Affibody-konjugerte fluorescerende probe for HER2-reseptoren kan påvirkning fluorescens levetiden av sonden. For dette formål ble fluorescens levetid undersøkt i tre forskjellige tilfeller: HER2-spesifikk Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) fluorescerende probe i humane tumormodeller med høy HER2 ekspresjon, HER2-spesifikk Affibody fluorescerende probe i en humane tumormodellen uten HER2 uttrykk, og HER2-ikke-spesifikk Affibody (His
6-Z
Taq: GS-Cys) fluorescerende probe i humane tumormodeller med høy HER2 ekspresjon, alt i musemodellen
i vivo
. Resultatene viser signifikante forskjeller i fluorescens levetid mellom tumorområdet og den kontralaterale området, når og bare når, binding av optiske sonden til tumor reseptorene kan forekomme. Tvert imot, ble ingen endring i fluorescens levetid observert i de tilfeller hvor de optiske sonder ikke har noen tilhørighet til HER2-reseptorer.
Materialer og Metoder
kontrastmiddel
I disse eksperimentene, to forskjellige Affibody® molekyler (Affibody, Stockholm, Sverige) ble brukt: HER2-spesifikke Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) og HER2-uspesifikke Affibody (Hans
6-Z
Taq: GS-Cys), begge konjugert med Dylight750 fluorescerende probe (Thermo-Fisher-Scientific, Waltham, Massachusetts). Dylight750 er lys nok til å brukes for
in vivo
studier uten modifisering og kan lett bli konjugert til HER2 spesifikke /uspesifikke Affibodies. Konjugeringen forholdet mellom Dylight750 til affibody protein er 01:01.
Vi målte levetid Affibody sonde i kjemiske buffere (med en sammensetning av sitronsyre, borsyre, og mono-natriumfosfat som strekker seg fra en pH-verdi på 4,5 til 9. Ingen betydelig endring i fluorescens levetid ble observert over hele pH-området (fig. 1A). Sterilisert saltoppløsning ble brukt til 3 ganger fortynning av Affibody proben før injeksjon.
Vi målte fluorescens levetid av Affibody sonde i kjemisk-buffer med pH-verdi på 6,86 ved å øke dens BSA-konsentrasjon fra 0% til 5% (bovint serumalbumin, fraksjon V, Minimum 96%, Sigma Co.). levetiden til Affibody sonde viste seg å være følsomme for nærværet av BSA proteiner (fig. 1 B). Vi har ikke observert en nedgang i fluorescens levetid i forhold til Affibody probe, anvendes for innsprøytning.
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP
for dyrestudier ble tre humane tumor xenograft modeller uttrykker ulike nivåer av HER2 brukt i denne studien. BT-474 og NCI-N87 er humane tumorcellelinjer med et høyt nivå av HER2 (HER2 /neu) uttrykket: 243 ± 24 ng /mg og 395 ± 41 ng /mg protein, henholdsvis, mens MDA-MB-468 er et human tumorcellelinje uten HER2 uttrykk. Alle tre cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). For in vitro studie har vi benyttet enten SK-BR-3 cellelinje med høy grad av HER2 eller HER2-negative MDA-MB-468 human kreft cellelinje. SK-BR-3 er valgt blant HER2-positiv cellelinjer på grunn av sin bedre feste til platen. Cellene ble dyrket i RPMI (BT-474, NCI-N87), DMEM-F12 (SK-BR-3, MDA-MB-468) kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og Pen /Strep (10000 U penicillin, streptomycin 10 mg) ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator. Løsning på 0,05% trypsin og 0,02% EDTA ble brukt for celler avløsning.
In vitro
studie
HER2-positiv SK-BR-3 og HER2 negative MDA-MB -468 celler ble plassert på åtte-kamret confocal lysbilder og inkubert over natten. Etter 24 timer inkubasjon ble Affibody-DyLight488-konjugat tilsettes celler media på 0,5 mikrogram /ml konsentrasjon. Etter ytterligere 30 min inkubasjon ved 37 ° C, ble 2 ug /ml Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt til cellene og inkubert i ytterligere 1 time for kjerner farging. Deretter ble cellene vasket tre ganger og avbildes i PBS med Zeiss LSM 510 konfokal mikroskop (ytterligere detaljer om forsøket vil bli presentert andre steder [i forberedelse]). Vi har brukt markør lik Affibody-DyLight750-konjugat (Affibody-DyLight488), fordi Zeiss LSM 510 konfokalmikroskop ikke fungerer på nær infrarøde bølgelengder.
I tillegg, for å bekrefte konsistensen av oppnådde resultater med Affibody- DyLight750-konjugat og vurdere levetiden på Affibody sonde
in vitro
, FLIM microcopy av cellekulturer ble utført av en spesielt tilpasset Olympus FV1000 invertert laserskanning to-foton mikroskop [38] for avbildning gjennom ikke- descanned deteksjon bane i ett-foton-modus. Selv om disse modifikasjonene redusert mikroskopet dybdeoppløsning i betydelig grad sammenlignet med konfokal mikroskopi, er det tillatt å demonstrere tydelig binding av HER2-Affibody-DyLight750-konjugat til den ytre membran av HER2-positiv SK-BR-3-celler.
Kort fortalt, for bildebehandling, et Olympus Fluoview 1000 galvo-speil laser scanning mikroskop utstyrt med en bredbåndet fleksibel «Mai Tai DeepSee» Ti-Sapphire laser (ved Newport Spectra-Physics) ble brukt. Laseren ble satt til en ett-foton eksitasjonsbølgelengde på 717 nm (for å minimere spredning av dikroiske speil). Betydelig laser dempning med en kombinasjon av ortogonale kalsitt polarisator og en metallisk nøytralt tetthetsfilter ble anvendt for å unngå metning detektor og prøven fotobleking. Prøven ble montert på en omvendt fase i en åtte-brønns plate og belyst med en langpasning 740-830 nm dichroic speil (FF741-DI01 av Semrock) ved hjelp av en vann nedsenking 0,8 NA LUMPlanFl N 40 × objektiv fra Olympus. To stablet Newport Oriel 51350 fargeglass 780 nm longpass filtre ble brukt foran en rød-sensitive Peltier-avkjølt raskt stige PMT modul (Becker Hickl modell PMC-100-20) for å eliminere spredning, andre harmonisk generasjon og celler autofluorescence . Siden detektoren er montert på et ikke-descanned sideporten uten noen spesiell filtrering, effektivt Z-oppløsning ble betydelig redusert i favør av oppsamlingseffektivitet. En rask respons silisium fotodiode (Becker Hickl modell PHD-400-N-12) ble benyttet for laser synkronisering. Photon teller hendelsene ble diskriminert, registrert og tildelt piksel steder ved Becker Hickl SPC-830 PCI bord. Dataanalyse ble utført med SPCImage ver. 3.2 programvare av Becker Hickl. Typisk foton akkumulering ganger varierte fra 60 til 300 s ansette rask toveis skannemodus for ytterligere å redusere fotobleking. Gjennomsnittlig tellerate ble holdt godt under 2 MHz for å unngå pulser pile-up.
Instrumentet respons funksjon, generert av knuste urea krystaller i olje, ble påvist som andre harmoniske generasjon (laser innstilt til 820 nm) gjennom et skikkelig sett av dichroic /emisjonsfiltre og målt som FWHM ~190 ps (i vårt tilfelle ble bestemt av PMT transitt tid spread).
Animal Forberedelse
for dyrestudier, de dyrkede kreftceller ble implantert inn i høyre forbena av xenograft kvinnelige nakne mus. Fem millioner celler ble injisert i 0,1 ml av 50% Matrigel i den høyre forbena. Studien ble godkjent av National Institutes of Health Animal Care og bruk Committee (Godkjenning ID: ROB117). Etter at tumorene vokste til størrelsen på 0,5-1 cm, ble musene overført til våre avbildnings anlegg. Før avbildning, ble musen bedøvet med isofluran inhalering. Musen ble plassert på en temperaturkontrollert trinn og to sett av bilder fra tumor-regionen og kontralaterale området ble tatt før injeksjon. Deretter, 10 ug av det Affibody konjugert med fluorescerende probe ble injisert gjennom halevenen. Bilder ble tatt fortløpende hvert 30. min for de første 5 timer. Svulstvev ble ekstrahert fra dyr 24 timer etter HER2-Affibody-DyLight750 injeksjon, fiksert i 10% nøytral burred formalin (NBF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Svulster ble farget for HER2 uttrykket (Herceptest, Daco) og Affibody fordelingsmønster.
Det skal bemerkes at Affibody-DyLight forbindelser som ikke induserer toksiske virkninger på brystcancer-celler, slik det ble demonstrert ved
in vitro
eksperimenter med cellekulturer (eksperimentelle detaljer vil bli presentert andre steder [i forberedelse]). For ytterligere å validere lav toksisitet av sonden
in vivo
, holdt vi flere mus med injisert doser så høye som 0,5 mg /kg i live inntil en måned etter injeksjon av Affibody-DyLight750 forbindelsen uten å observere noen toksisitet effekter i mus.
in-vivo
Lifetime Imaging system
in vivo
levetid imaging system besto av en fleksibel puls laser med en pulsbredde på 100 fs og repetisjonsfrekvens på 80 MHz. Laseren ble innstilt til en eksitasjonsbølgelengde på 750 nm. Lyspulsene skannet målet (tumor eller kontralaterale siden) hos et dyr i et rastermønster gjennom en skanning hode med kilde- og detektor-fibre i 2 mm avstand. Dyret ble plassert i et mørkt kammer på en temperaturkontrollert skanning stadium. Det reflekterte signalet fluorescens ble filtrert ved hjelp av en 780 nm lang-pass utslipp filter. De detekterte fotoner ble tatt av et fotomultiplikatorrør (PMT) og fotoner ble talt ved en tids korrelert enkeltfotonteller (TCSPC). Initialisering, skanning, og oppkjøpet ble kontrollert av LabVIEW programvare. Detaljene i avbildningssystem kan finnes i [15]. Fluorescens levetid ble beregnet fra en kurve tilpasning av dataene til en enkelt eksponentiell desintegrasjonsfunksjon, optimaliseres ved iterativ reconvolution av enkelt råtnende eksponensiell med impulsresponsfunksjonen til systemet. Vi avkortet halen av tids løst intensitet data på grunn av sin mer mottakelighet for fotontransportbanevariasjoner. I våre prekliniske studier, ettersom svulsten ligger i mus forbena subkutant, dybden av tumoren ikke har en signifikant effekt på levetiden, men for anvendelser som arbeider med de dypt forankret tumorer, er effekten av foton diffusjon på det observerte tids løst fluorescensstyrkene bør tas i betraktning.
Resultater
In vivo
Study
for å undersøke effekten av bindende HER2-spesifikke Affibody fluorescerende probe for HER2-reseptor-positive tumor på fluorescens levetid, ble tre forskjellige tilfeller vurderes. I det første tilfellet, HER2-spesifikke Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) ble optisk sonde injisert i mus med høye HER2-uttrykkende humane tumor karsinomer. I det andre tilfelle, en HER2-ikke-spesifikk Affibody (His
6-Z
Taq: GS-Cys) fluorescerende probe ble injisert i mus med samme HER2-uttrykkende humane tumor karsinomer som i det første tilfellet, og i det tredje tilfellet, HER2 spesifikk Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys). fluorescerende probe ble injisert i mus som ikke kan HER2-uttrykkende tumor
i det første eksperimentet, HER2-spesifikk Affibody var injisert i fire mus med et høyt nivå (3) HER2-uttrykkende humane tumor karsinom, BT-474. Fig. 2 viser resultatene av
in vivo
målinger av fluorescens intensitet og levetid ved tumorområdet og den kontralaterale området. Fig. 2C viser forskjellen mellom fluorescensintensiteten ved tumor (fig. 2A) og kontralaterale steder (fig. 2B) en time etter injeksjon, kartlagt på tumorområdet. Fig. 2D viser dynamikken i den maksimale fluorescens intensitet på tumor-regionen og kontralaterale stedet for 6 timer etter injeksjonen. Pixel med maksimal intensitet ble anvendt for å karakterisere tumoren. Den fluorescens mapping på motsatt side var i gjennomsnitt på 16 piksler, siden det ikke var noen bestemt punkt for å målrette på motsatt side. I gjennomsnitt over 16 bildeelementer er blitt brukt for støyreduksjon. For å demonstrere de variasjoner av levetiden og fluorescens-intensitet i hele det skannede området vi presentert kartene over fluorescens intensitet og levetid ved kontralaterale og tumor regioner. Dataene vist i fig. 2D og fig. 2H er de midlere verdier av målingene mer enn fire mus (Markører viser gjennomsnittet og linjer viser standardavvik). Fig. 2G viser forskjellen mellom fluorescens levetid på tumor (fig. 2E) og kontralaterale steder (fig. 2F) 1 time etter injeksjon, kartlagt på tumor region. Fluorescens levetid i tumorområdet og kontralaterale området i mer enn 6 timer etter injeksjon er vist i fig. 2H. På fig. 2 H, ble dataene, tilsvarende pikselen med maksimal intensitet som brukes for levetidsberegninger, siden det hadde høyest signal til støyforhold.
(A) Fluorescens intensitetskart tumor region. (B) fluorescensintensiteten kart på den kontralaterale stedet (C) Forskjellen av fluorescens intensitet på tumor-regionen og det kontralaterale området, kartlagt på tumor region. (D) Farmakokinetikk av fluorescensintensiteten ved tumor-regionen og kontralateral området etter injeksjon over tid. Fluorescentintensiteten ble fordelt på 16 piksler på motsatt side. Dataene i fig. (D) og (H) er de gjennomsnittlige data fra fire mus. Markører viser gjennomsnittlig og linjer viser standardavvik. (E) Fluorescens levetid kart på tumor region. (F) Fluorescens levetid kartet på motsatt side. (G) Forskjellen i fluorescens levetid på svulsten og den kontralaterale området kartlagt på tumor region. (E) Farmakokinetikk av fluorescerende levetid på svulsten regionen og motsatt side etter injeksjon over tid. Alle levetid og fluorescens-intensitetskart i figurene 2,4-7 er fra målinger på en time etter injeksjonen av Affibody probe. I alle målinger ble fotoner telles over to sekunder integrering tid,
t
0
. For å utelukke metning effekten av 16 bit kamera, i de lyseste piksler, hvor den tilsvarende grense på 65536 tellinger ble nådd før tiden
t
0
, vi har renormalized dataene ved å multiplisere fotontelling, målt etter lavere integrasjonstiden
t
, med faktor
t
0 /t.
I alle forsøkene ble data hentet fra svulsten og kontralaterale sider samtidig område som den første eksperiment. For fluorescensintensiteten og levetid kart, valgte måledataene ved 1 time etter injeksjon, noe som tilsvarer et fall, når en betydelig mengde av fluorescerende fargestoffer var tilgjengelige på begge kontralaterale og tumorsteder.
Som et eksempel, fitting kurver oppnådd ved SPCImage programvare, (ver 3,2, Becker Fluorescens levetid kart på tumor region (F) Fluorescens levetid kart på den kontralaterale området (G) Forskjellen av fluorescerende levetid på tumor-regionen og det kontralaterale området kartlagt på tumorområdet (E) Farmakokinetikk i… fluoriserende levetid ved tumor-regionen og kontralaterale området etter injeksjon over tid.
for det tredje forsøk, tre mus med HER2-negativ modell (MDA-MB-468) ble anvendt for undersøkelsen. Igjen HER2-spesifikke Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) optiske sonden ble brukt som en fluoriserende kontrastmiddel i dette spesielle humane tumormodellen, på grunn av mangel av HER2-reseptorer i tumorområdet, HER2 Affibody. bandt seg ikke til tumorcellene. intensiteten ved både tumor og kontralaterale område betydelig redusert i 2-3 timer etter injeksjon (fig. 5D). fluorescensen levetid ble også observert å være den samme ved både tumor og kontralaterale steder (fig. 5H).
(A) fluorescensintensiteten kart på svulsten regionen. (B) Fluorescens intensiteten kartet på motsatt side. (C) Forskjellen av fluorescens intensitet på tumor-regionen og det kontralaterale området, kartlagt på tumor region. (D) Farmakokinetikk av fluorescensintensiteten ved tumor-regionen og kontralateral området etter injeksjon over tid. Dataene i fig. (D) og (H) er de gjennomsnittlige data fra tre mus. Markører viser gjennomsnittlig og linjer viser standardavvik. (E) Fluorescens levetid kart på tumor region. (F) Fluorescens levetid kartet på motsatt side. (G) Forskjellen av fluorescerende levetid ved svulsten og den kontralaterale området kartlagt på tumor region. (E) Farmakokinetikk av fluorescerende levetid på svulsten regionen og motsatt side etter injeksjon over tid.
De samme testene ble gjentatt for NCI-N87 tumor modell. NCI-N87-celler er også kjent for å ha et høyt nivå av HER2 uttrykk [26]. Fluorescens intensitet og levetid ble målt
in vivo
etter injeksjon av fluorescerende probe, basert enten på HER2-spesifikke Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) eller HER2-uspesifikke Affibody (His6-Z
Taq: GS-Cys). Resultatene er vist i fig. 6 og fig. 7, henholdsvis.
(A) Fluorescens intensitetskart tumor region. (B) Fluorescens intensiteten kartet på motsatt side. (C) Forskjellen av fluorescens intensitet på tumor-regionen og det kontralaterale området, kartlagt på tumor region. (D) Farmakokinetikk av fluorescensintensiteten ved tumor-regionen og kontralateral området etter injeksjon over tid. Dataene i fig. (D) og (H) er de gjennomsnittlige data fra tre mus. Markører viser gjennomsnittlig og linjer viser standardavvik. (E) Fluorescens levetid kart på tumor region. (F) Fluorescens levetid kartet på motsatt side. (G) Forskjellen av fluorescerende levetid ved svulsten og den kontralaterale området kartlagt på tumor region. (E) Farmakokinetikk av fluorescerende levetid på svulsten regionen og motsatt side etter injeksjon over tid.
(A) fluorescensintensiteten kart på svulsten regionen. (B) fluorescensintensiteten kart på den kontralaterale stedet (C) Forskjellen av fluorescens intensitet på tumor-regionen og det kontralaterale området, kartlagt på tumor region. (D) Farmakokinetikk av fluorescensintensiteten ved tumor-regionen og kontralateral området etter injeksjon over tid. Dataene i fig. (D) og (H) er de gjennomsnittlige data fra tre mus. Markører viser gjennomsnittlig og linjer viser standardavvik. (E) Fluorescens levetid kart på tumor region. (F) Fluorescens levetid kartet på motsatt side. (G) Forskjellen av fluorescerende levetid ved svulsten og den kontralaterale området kartlagt på tumor region. (E) Farmakokinetikk av fluorescerende levetid på svulsten regionen og motsatt side etter injeksjon over tid.
Før injeksjon fluorescens levetid Dylight750, konjugert til HER2-spesifikke Affibody (His6-Z
HER2: GS-Cys) ble målt som 0,71 ns. Men levetiden for Dylight750 konjugert til HER2-uspesifikke Affibody (His6-Z
Taq: GS-Cys) ble målt som 0,62 ns. Denne levetiden forskjellen mellom HER2-spesifikk og uspesifikk var konsistens i våre in-vivo målinger ved kontralateral side.
For å vurdere potensialet bidrag autofluorescence inn de målte fluorescensstyrkene, har vi målt signal før sonden injeksjon både i svulsten og kontralaterale steder. Fig. 8A-8B viser intensiteten kart over de 16 piksler ved svulsten regionen og motsatt side før injeksjon av Affibody sonde. En sammenligning mellom den autofluorescens (før injeksjon) og fluorescens-signalet etter injeksjon av (A) HER2 spesifikk Affibody-Dylight750 (B) HER2 ikke-spesifikk Affibody-Dylight750 i mus med NCI-N87 tumorxenotransplantater er presentert i fig.
