Abstract
Mål
REIC /Dkk-3 er nedregulert i et bredt spekter av menneskelige kreftceller og regnes for å fungere som en tumor suppressor. Vi har tidligere rapportert at REIC /Dkk-3-uttrykke adenovirus vektor (Ad-REIC) indusert endoplasmatiske retikulum (ER) stress og kreftspesifikk apoptose i human prostatakreft. I denne studien undersøkte vi den terapeutiske effekten av Ad-REIC på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
Materialer og metoder
Vi undersøkte anti-tumor effekt av Ad-REIC på 25 NSCLC cellelinjer
in vitro Hotell og A549 celler
in vivo
. To av disse cellelinjene ble kunstig etablert som EGFR-tyrosinkinase inhibitor (TKI) resistente underlinjer.
Resultater
Ad-REIC-behandling hemmet cellen levedyktighet med 40% eller mer i 13 ( 52%) av de 25 cellelinjer ved multiplisitet for infeksjon (MOI) på 20 (20 MOI). Disse cellelinjer ble ansett for å være meget følsomme celler. Cellen levedyktigheten til en ikke-ondartet udødeliggjort cellelinje, OUMS-24 ble ikke hemmet ved 200 MOI på Ad-REIC. Virkningene av Ad-REIC på EGFR-TKI resistente underlinjer var tilsvarende de i foreldrecellelinjer. Her viste vi at Ad-REIC behandling aktivert c-Jun N-terminal kinase (JNK) hos NSCLC cellelinjer, noe som indikerer induksjon av ER stress med GRP78 /BiP (GRP78) oppregulering og resulterer i apoptose. En enkelt intratumoral injeksjon av Ad-REIC vesentlig hemmet tumorigen veksten av A549 celler
in vivo
. Som prediktive faktorer av sensitivitet for Ad-REIC behandling i NSCLC, undersøkte vi uttrykket status for GRP78 og coxsackievirus og adenovirus reseptor (CAR). Vi fant at kombinasjonen av grp78 og CAR uttrykksstatuser kan brukes som en prediktiv faktor for Ad-REIC følsomhet hos NSCLC celler.
Konklusjon
Ad-REIC indusert JNK-aktivering og påfølgende apoptose i NSCLC celler. Vår studie viste at Ad-REIC har terapeutisk potensiale mot NSCLC og at uttrykket statusene GRP78 og CAR kan forutsi en potensiell terapeutisk nytte av Ad-REIC
Citation. Shien K, Tanaka N, Watanabe M, Soh J, Sakaguchi M, Matsuo K, et al. (2014) anti-kreft effekter av REIC /Dkk-3-koder Adenoviral Vector for behandling av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (2): e87900. doi: 10,1371 /journal.pone.0087900
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 04.12.2013; Godkjent: 30 desember 2013; Publisert: 03.02.2014
Copyright: © 2014 Shien et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Ingen strøm finansieringskilder for denne studien
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til død av kreft over hele verden og metastatisk form er en viktig faktor som fører til dødelighet [1]. Det er to store histologiske subtyper av lungekreft: ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft. Nyere intensive studier har identifisert årsaks molekylære endringer som har direkte ført til utvikling av nye terapeutiske strategier og har forbedret pasientens prognose [2]. For eksempel, mutasjoner av den epidermale vekstfaktor-reseptor-genet (
EGFR
) er funnet i omtrent 30% av NSCLCs, særlig i lunge adenokarsinomer, og EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) er spesielt effektive i disse tumorene [ ,,,0],3], [4]. Mer nylig har crizotinib vist seg å være effektive for NSCLCs med en
EML4-ALK
fusjonsgenet [5], [6]. Imidlertid er antallet pasienter med disse endringene begrenset, og liten forbedring i prognosen er blitt oppnådd i NSCLCs uten disse medikamentfølsomme endringer. Videre ervervet resistens slutt forekommer i de fleste av
EGFR
-mutant svulster, som tidligere hadde svart på EGFR-TKI, etter et gjennomsnitt på 10 måneders behandling [7]. Dermed er en ny terapeutisk modalitet nødvendig for å forbedre den kliniske resultatet av pasienter med lungekreft.
REIC /DKK-3, et medlem av den Dickkopf (DKK) genfamilien, er opprinnelig funnet i immortaliserte celler og har blitt rapportert å være en tumor suppressor; dens ekspresjon er signifikant nedregulert i et bredt spekter av kreftcelletyper, inkludert lungekreft [8]. Heatmap bilde av budbringer RNA (mRNA) uttrykk for
REIC /Dkk-3
genet fra UCSC Cancer Genome Browse, som er fritt tilgjengelig offentlig database (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (vi lastet ned dataene den 16. juli 2013), viste at
REIC /Dkk-3
genekspresjon ble redusert i flertallet av undersøkte prøver av både lunge adenokarsinomer og plateepitelkarsinom sammenlignet med normal lunge vev (figur S1) . I tillegg kan det bli bekreftet fra en offentlig database som uttrykk for
REIC /Dkk-3
var også lav i mange NSCLC cellelinjer (Gene Expression Omnibus depot [http: //www.ncbi.nlm.nih gov /geo, GEO tiltredelse GSE4824]). REIC /DKK-3 er kjent for å interferere med Wnt signalering via wnt reseptorer [9], [10] og ble tidligere rapportert å spille en tydelig rolle i induksjon av apoptose og inhibisjon av metastase [11], [12]. Induksjon av apoptose i cancerceller er hovedsakelig forårsaket av endoplasmatisk retikulum (ER) spenning indusert ved overproduksjon av REIC /DKK-3 i cellene. ER stress utløser aktivering av c-Jun N-terminal kinase (JNK), som er en kritisk hendelse i apoptose indusert ved overproduksjon av REIC /DKK-3 ved anvendelse av en adenovirus-vektor (Ad-REIC) [11], [13] . I våre tidligere studier, har vi funnet at Ad-REIC hadde en terapeutisk effekt på ulike typer av kreft hos mennesker, inkludert prostata, testikler, pleura, og brystkarsinomer [11], [13] – [15]. Ad-REIC infeksjon og REIC /DKK-3-protein er også kjent for å opp-regulerer den anti-tumor immunosystemreak- [16]. Basert på prekliniske data, har en klinisk studie ved hjelp av Ad-REIC for human prostatakreft pågått i Japan og USA (NCT01197209).
I denne studien undersøkte vi den terapeutiske effekten av Ad-REIC på NSCLC celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi har også undersøkt faktorer knyttet til følsomheten til cellelinjer til Ad-REIC som et skritt mot utviklingen av tilpasset Ad-REIC behandling for pasienter med NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk komité Okayama University (Permit Number: OKU-2012-549). Alle operasjoner ble utført under ketamin og xylazin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Cellelinjer
Seksten cellelinjer av human lunge adenokarsinom, 3 plateepitelkarsinom, tre store cellekreft , en adenosquamous cell carcinoma, 2 EGFR-TKI-resistente underlinjer fra HCC827 og PC-9 celler (HCC827-GR-HØY2 og RPC-9), den menneskelige mesothelioma cellelinje MSTO-211H (211H), og den normale menneskelige fibroblast celle linje OUMS-24 ble anvendt i denne studien (tabell 1). Detaljene for cellelinjer benyttet i denne undersøkelsen er beskrevet i metode S1. Den HCC827-GR-HØY2 og RPC-9-cellelinjer ble etablert som tidligere beskrevet [17], [18]. OUMS-24 ble etablert ved vår institusjon [19].
Adenovirus vektor som bærer REIC /Dkk-3
REIC /Dkk-3 ble overexpressed ved hjelp av en adenovirus (Ad-REIC) som vi tidligere har generert [11]. En full-lengde cDNA av REIC /DKK-3 ble integrert i en cosmid vektor pAxCAwt og overført til en adenovirusvektor av COS-TPC-metoden (Bio Takara, Shiga, Japan). En adenovirusvektor som bærer LacZ-genet (Ad-LacZ) ble også anvendt som kontroll [11].
Celleviabilitet assay
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1,5 x 10
3 celler /brønn på 48 timer etter infeksjon med Ad-LacZ eller Ad-REIC på et mangfold av infeksjon (MOI) på 20, 100 eller 200 MOI. Celleviabilitet ble evaluert 3 dager senere ved hjelp av en MTS analysen med CellTiter 96 vandige løsning Reagens (Promega, Madison, WI).
apoptose analysen
For å undersøke
in vitro
induksjon av apoptose etter behandling, sådd vi cellene i 6-brønns plater og inkubert dem i 24 timer. Cellene ble behandlet med Ad-LacZ eller Ad-REIC ved 20 MOI i serumfritt medium (500 pl) i 2 timer; mediet ble deretter byttet ut med friskt komplett medium (2 ml). Etter ytterligere 48 timers inkubering, ble Hoechst 33342 fargestoff (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tilsatt til mediet ved en konsentrasjon på 2 ug /ml, og cellene ble inkubert i mørket i 10 min. Hoechst 33342 er en interkalerende fargestoff som tillater bestemmelse av variasjoner i den totale mengde kromatin og graden av kromatin kondensering [15]. Ved å bruke fluorescens mikroskopi identifiserte vi apoptotiske celler ved nærvær av høyt kondenserte eller fragmenterte kjerner. Apoptotiske celler ble talt i 5 forskjellige områder i henhold mikroskopiske observasjon.
Western blot analyse
Den detaljerte protokollen for Western blot analyse er beskrevet i metode S1. Det ble utført under konvensjonelle betingelser ved anvendelse av følgende antistoffer: kanin-anti-human REIC /DKK-3 antistoff dannet i vårt laboratorium [11]; kanin anti-humant GRP78 /BiP (GRP78) (ab21685; Abcam, Cambridge, MA); kanin anti-human SAPK /JNK (# 9252) og kanin anti-human fosfor-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185; # 9251) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); kanin anti-human coxsackievirus og adenovirus reseptor (CAR) (HPA030411; Atlas antistoffer, Stockholm, Sverige); og mus anti-actin (MAB1501; Millipore, Billerica, Massachusetts). De følgende sekundære antistoffer ble anvendt: geit-anti-kanin eller anti-mus-IgG-konjugert pepperrotperoksidase (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). For å oppdage det spesielle signalet ble membranene undersøkt ved hjelp ECL pluss Western blotting Detection reagenser (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK). I tillegg har bandet intensiteter for GRP78, CAR, og aktin, representerer deres uttrykk nivåer, ble målt ved hjelp av Imagequant TL programvare (GE Healthcare Biovitenskap) og kvantifisert ved GRP78 eller CAR /aktin-forhold.
Tumor vekst analyse i vivo
A549-celler (5 x 10
6 i 50 ul fosfatbufret saltvann [PBS]) blandet med 50 ul av Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) ble injisert subkutant inn i høyre flanke av voksne hunn BALB /c nu /nu-mus (CLEA Japan, Tokyo, Japan). Tumorvolumet ble beregnet ved bruk av den empiriske formelen V = 1/2 x [(den korteste diameter)
2 x (lengste diameter)]. Når tumorene hadde nådd ca. 50-100 mm
3, mus (n = 15) ble tilfeldig delt inn i 3 behandlingsgrupper: (a) PBS; (B) Ad-LacZ; og (c) Ad-REIC. Virus (1 x 10
9 pfu) i 100 ul serumfritt medium ble administrert intratumorally. På slutten av forsøkene ble mus avlivet etter 24 dager etter den virale injeksjon og tumorer ble høstet, måles, og fotografert.
Statistiske analyser
Alle data ble analysert ved bruk av STATA ver.12 (Stata Corp., College Station, TX). Fishers eksakte test ble brukt når det passer. For en sammenligning av induksjon av apoptose mellom Ad-REIC behandlet og Ad-LacZ-behandlede A549 celler, ble en Cochran-Mantel-Haenszel statistikk brukes for å sammenligne. Gjentatte målinger ANOVA ble brukt for sammenlikning av xenotransplanted NSCLC kreft størrelser mellom PBS, Ad-LacZ og Ad-REIC.
P
0,05 ble betraktet som signifikant. Alle testene var tosidig.
Resultater
Effekt av Ad-REIC på NSCLC cellelinjer
Vi undersøkte hemming av celle levedyktighet ved hjelp av Ad-REIC og en MTS analyse . I 13 (52%) av 25 NSCLC-cellelinjer, Ad-REIC behandling ved 20 MOI inhiberte cellelevedyktighet (40% -60% inhibering), sammenlignet med Ad-LacZ-behandling (tabell 1, figur 1). Disse cellelinjene ble ansett som svært sensitive for Ad-REIC. I motsetning til dette ble 12 cellelinjer (48%) ikke hemmet av Ad-REIC behandling ved 20 MOI og ble betraktet som resistente celler. OUMS-24 ble ikke hemmet på 20 eller 200 MOI av Ad-REIC. Av notatet, Ad-REIC behandling på 100 og 200 MOI forbedret hemming av celle levedyktighet (100 MOI: 15% -59% hemming, 200 MOI: 40% -78% hemming), sammenlignet med Ad-LacZ behandling (tabell 1) . Dermed har vi definert 20 MOI som en lav MOI verdi og 200 MOI som en høy MOI verdi. Til sammenligning ble Ad-REIC behandling også utført i menneske mesothelioma cellelinje 211H, som vi tidligere har rapportert å være Ad-REIC sensitiv [14]. Den 211H ble ikke hemmet ved 20 MOI, men ble hemmet ved 200 MOI av Ad-REIC (tabell 1). De kjente molekylære karakteristika for hver cellelinje er vist i tabell 1. De 25 NSCLC-cellelinjer som besto av 8
EGFR
-mutant, 6
KRAS
-mutant, 1
HER4
-mutant, en
NRAS
-mutant, en
PIK3CA
-mutant, en
EML4-ALK
fusion, en
HER2
-amplified, og 6 cellelinjer uten genet endringer oppført. Ni av de 17
EGFR
-wild typen cellelinjer var følsomme for Ad-REIC. HCC827 og dens motstandsdyktig underlinjen, HCC827-GR-HØY2, viste en tilsvarende grad av følsomhet for Ad-REIC. Ingen trend i molekylær genotype ble sett mellom sensitive og ikke-sensitive cellelinjer. Disse resultatene antydet at effekten av Ad-REIC ikke er avhengig av en kjent molekyl genotype.
hemming priser av 25 NSCLC cellelinjer transfektert med Ad-REIC forhold til Ad-LacZ er vist som svart strek i 20 MOI og den hvite stripen i 200 MOI. Tretten cellelinjer med over 40% hemming rate i 20 MOI er definert som svært sensitive og 12 cellelinjer med lavere hemming hastighet i 20 MOI er definert som resistente. Alle de resistente cellelinjer viser over 40% hemming rate i 200 MOI. Cellelinjene er klassifisert i 3 kategorier basert på GRP og CAR-proteinekspresjon nivå som følger; kategori A (lav GRP /høy CAR), kategori B (lav GRP /lav CAR eller høy GRP /høy CAR), kategori C (høy GRP /lav CAR). Alle 8 svært følsomme cellelinjer ble inkludert i klasse A, og alle 5-resistente cellelinjer ble inkludert i kategori C. Sq; plateepitelkarsinom, AD; adenokarsinom, LC; stor celle karsinom, ADSQ; adenosquamous cell carcinoma, MM; ondartet mesothelioma, NHF; normal human fibroblast.
Hoechst 33342 farging ble utført i A549 celler for å undersøke induksjon av apoptose. Apoptotiske celler ble observert i Ad-REIC-behandlede A549 celler (figur 2a). Den midlere hastighet av apoptose var 22%, og det var signifikant (p 0,001 Cochran-Mantel-Haenszel test). Økt sammenlignet med kontroll Ad-LacZ behandling
(a) Induksjon av apoptose etter
in vitro
Ad-REIC behandling som undersøkes i A549 celler ved hjelp av Hoechst 33342 farging. Den øvre panelet viser forekomsten av apoptotiske celler etter Ad-REIC behandling. Det nedre panel viser den apoptotiske hastighet på A549-celler etter den indikerte behandling. En total av 5 forskjellige områder ble undersøkt under et mikroskop for å bestemme den apoptotiske hastighet. En vesentlig forskjell ble observert (* p 0,001) mellom Ad-LacZ og Ad-REIC behandling. (Bar: 100 um) (b) Western blot-analyse for proteiner som er involvert i signaltransduksjon som utløses av Ad-REIC. Cellene ble høstet etter 48 timer etter transfeksjon med Ad-LacZ eller Ad-REIC ved 20 MOI. (C) H460 celler, som er motstandsdyktig mot adenovirus transduksjon, ble høstet etter 48 timer etter transfeksjon med Ad-LacZ eller Ad-REIC på 20, 100, og 200 MOI.
Effekten av rekombinant REIC /Dkk-3 protein på NSCLC cellelinjer ble undersøkt i 7 tilfeldig utvalgte cellelinjer (NCI-H522, NCI-H611, NCI-H1299, NCI-H1819, NCI-H2009, PC-9, og A549). MTS-analyse viste at REIC /DKK-3-protein ikke påvirke cellenes levedyktighet i de undersøkte cellelinjer når den administreres ved en konsentrasjon som strekker seg fra 1 til 200 ug /ml (data ikke vist).
Ekspresjon av GRP78 og CAR i respons til Ad-REIC terapi
Som prediktive faktorer av Ad-REIC følsomhet i NSCLC, vi undersøkte uttrykk for GRP78 og CAR; Disse uttrykk statusene ble korrelert med inhibisjon av cellelevedyktighet ved Ad-REIC i 13 cellelinjer. En tidligere studie rapporterte at overekspresjon av GRP78 inhiberte ER-spenning, som kan være motsatt korrelert med effekten av Ad-REIC. CAR uttrykk er tett forbundet med effekten av adenovirus-infeksjon, som kan være positivt korrelert med effekten av Ad-REIC. Western blotting ble utført, og ekspresjonsnivået ble kvantifisert som vist i tabell 1 og figur 1. Den median (område) av GRP78 og CAR uttrykk ble 0,24 (0,075 til 0,98) og 0,60 (0,080 til 2,1), respektivt. Basert på disse dataene, ble celler med en GRP78 uttrykk nivå mer enn 0,25 definert som høy CRP78 uttrykk, mens de med en GRP78 mindre enn 0,24 ble definert som lav GRP78 uttrykk. Når det gjelder CAR, ble 15 cellelinjer betydelig høy CAR uttrykk (mer enn 0,50) definert som høy CAR uttrykk, mens 10 cellelinjer de med betydelig lavt nivå av CAR uttrykk (under 0,20) ble definert som lav CAR uttrykk. GRP78 uttrykk var lav i åtte av de 13 Ad-REIC-sensitive celler (62%) og i fire av de 12 Ad-REIC-resistente celler (33%). CAR uttrykk var høy i 12 av de 13 Ad-REIC-sensitive celler (92%) og i tre av de 12 Ad-REIC-resistente celler (25%).
Neste, vi klassifisert cellelinjene inn tre kategorier basert på grp78 og CAR uttrykk statuser; celler med en lav GRP78 /High CAR uttrykk ble klassifisert som kategori A, ble de med lav GRP78 /Lav CAR eller Høy GRP78 /High CAR uttrykk klassifisert som kategori B, og de med høy GRP78 /Low CAR uttrykk ble klassifisert som kategori C. de høye sensitive celle priser var 100% i kategori A (8 av 8, 95% konfidensintervall [CI]: 63-100), 42% i kategori B (5 av 12, 95% KI: 15-72), og 0% i kategori C (0 av 5, 95% KI: 0-52) (tabell 2). Kategoriene var signifikant assosiert med følsomheten til Ad-REIC behandling (p 0,01).
JNK og GRP78 uttrykk hos NSCLC cellelinjer som ble behandlet med Ad-REIC
En vestlig blotting analyse viste signifikant uttrykk for REIC /Dkk-3 protein på 14 NSCLC cellelinjer som ble behandlet med Ad-REIC. I 9-cellelinjer infisert med 20 MOI, Ad-REIC behandling resulterte i fosforylering av JNK og oppregulering av GRP78 (figur 2b). I de andre cellelinjene 8, som var forholdsvis motstandsdyktig mot Ad-REIC, aktivering av JNK og GRP78 ble observert ved høyere MOI verdier (100 og 200 MOI) (figur 2c).
Virkning av Ad-REIC på NSCLC svulster i et xenotransplantasjon modell
Vi undersøkte effekten av Ad-REIC på veksten av A549 celler
in vivo
. En uke etter transplantasjon, når tumorvolumet nådde 50 til 100 mm
3, 1 x 10
9 plaque-dannende enheter av Ad-REIC eller Ad-LacZ i 100 ul PBS eller 100 ul av PBS alene var injisert intratumorally. Tumorene vokste progressivt i PBS og Ad-lacZ-behandlingsgruppene i løpet av den påfølgende 24-dagers observasjonsperioden. I motsetning til dette tumorvekst i Ad-REIC behandlingsgruppe var signifikant (p 0,001 ved gjentatte målinger ANOVA). Undertrykket i løpet av observasjonsperioden (figur 3a, b)
(a) Det gjennomsnittlige volum av subkutane xenografttumorer ble beregnet for 5 mus i hver gruppe. Det ble observert en signifikant forskjell mellom resultatene av Ad-REIC og Ad-LacZ behandling (* p 0,001 ved gjentatt måling av ANOVA). (B) Utseende av svulstene på tidspunktet for offer etter behandling med PBS, Ad-LacZ, og Ad-REIC.
Diskusjoner
I denne studien fant vi at Ad-REIC var direkte effektive i mer enn halvparten av NSCLC cellelinjer som ble undersøkt, uavhengig av sine kjente driver endringer som
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner. Et dyr xenograft modell viste også den terapeutiske effekten av Ad-REIC. Anti-tumoreffekten til Ad-REIC avhenger av ER-spenning-mediert JNK-aktivering lastet ved overproduksjon av REIC /DKK-3-protein, noe som resulterer i induksjon av apoptose [14], [20]. Aktivering av JNK, som er en viktig skritt i induksjon av ER stress og apoptose ved Ad-REIC, ble observert ved 20 MOI i NSCLC-cellelinjer. På den annen side ble anti-tumor effekt av rekombinant REIC /DKK-3 proteinet ikke observert, som i andre typer av kreftformer som tidligere ble undersøkt. Opprinnelig REIC /Dkk-3 ble identifisert som en sekretorisk protein og ble antatt å utøve en fysiologisk funksjon, men dens celleoverflaten reseptor og dens rolle som en sekretorisk protein har ikke blitt identifisert.
Vi definerte 20 MOI som en lav MOI verdi og 200 MOI som en høy MOI verdi fordi den normale menneskelige fibroblast cellelinje OUMS-24 ikke ble hemmet ved 20 eller 200 MOI av Ad-REIC, mens ondartede cellelinjer ble hemmet når MOI verdien ble hevet til 100 og 200 MOI i cellelinjer hvor Ad-REIC hadde vært ineffektive ved 20 MOI. I NSCLC, Ad-REIC var effektiv på en lav MOI verdi i mer enn halvparten av de cellelinjer som ble testet. Tatt i betraktning det resultat at 211H ble hemmet bare ved en høy MOI verdi, kan Ad-REIC være mer effektive i NSCLC enn i mesothelioma.
Pasient valg basert på de molekylære egenskapene til kreftceller er et viktig tema for å maksimere terapeutisk effekt og minimere negative effekter. For dette formålet, har vi fokusert på GRP78 uttrykk og CAR uttrykk nivåer. GRP78 er et medlem av familien Hsp70, som fungerer som en ER stress-signale regulator [21]. En tidligere studie viste at overekspresjon av GRP78 dratt resistens mot et bredt utvalg av kjemoterapeutiske midler i forskjellige typer celler [22]. Vi viste også at ervervet resistens klone av PC-3 celler til Ad-REIC etablert etter gjentatt eksponering for Ad-REIC utstilt et høyt uttrykk nivå av GRP78, sammenlignet med foreldre PC-3 celler [13]. Teoretisk skal Ad-REIC være effektiv for tumorceller definert som kategori A og ikke så effektiv for de som er definert som kategori C. Selv om sensitive celler i kategori B ble identifisert, alle 8 celler i kategori A svarte på Ad-REIC behandling. Resultatene antydet at uttrykket statusene GRP78 og CAR i svulster kan være nyttig som biomarkører for tilpasset Ad-REIC behandling hos NSCLC mens ytterligere bekreftelse er nødvendig med en stor skalert etterforskning ved hjelp av ulike typer cellelinjer.
Som en nylig tema for kreftbehandling lunge, EGFR-TKI har vist seg å være effektiv for behandling av
EGFR
-mutant NSCLCs. Imidlertid ervervet resistens mot EGFR-TKI etter TKI behandling er et problem som må overvinnes. I denne studien, våre resultater viste at effekten av Ad-REIC mot ervervet EGFR-TKI-resistente celler var lik som mot foreldre celler, noe som tyder på at Ad-REIC kan være nyttig etter oppkjøpet av motstand mot EGFR-TKI.
Selv om adenovirus vektorer som bærer passende tumorsuppressorgener, slik som REIC /Dkk-3, har et stort potensial for kreft genterapi, har de ikke målrette spesifisitet og derfor kan også infisere normale celler i nærheten av kreftceller . Forfatterne rapporterte at infeksjonen av normale humane fibroblaster (NHF) med Ad-REIC ikke føre til apoptose av NHF seg selv, men i stedet indusert produksjon av interleukin (IL) -7. Når Ad-REIC-infiserte NHF ble blandet med ubehandlede kreftceller, og blandingen ble transplantert inn i mus, ble veksten av kreftceller i betydelig grad undertrykkes, noe som tyder på en indirekte tumor-suppressive virkning av Ad-REIC mediert av IL-7 [20] . Disse funnene viser at mis-målrettede infeksjon av kreft stromaceller av Ad-REIC aktiverer immunsystemet ved produksjon av IL-7. I tillegg til forfatterne rapporterte at REIC /DKK-3-protein spilte en cytokin-lignende rolle i monocytt differensiering til dendrittiske-celle-lignende funksjoner
in vitro
og at infiltrasjon av CD11c- og CD8-positive (dendrittiske og drapsmann T cellemarkører, henholdsvis) celler ble observert i løpet av de behandlede svulster
in vivo
. I forsøket ved hjelp av en ortotopisk prostatatumormodell med pre-etablerte lungemetastase, antallet metastatiske lungetumorer betydelig redusert etter injeksjonen av Ad-REIC i den primære tumorstedet i tillegg til inhibering av veksten av ortotopiske prostata tumorer, noe som tyder at anti-kreft immun oppregulering av Ad-REIC behandling i primærtumor nettsider utløste anti-tumor effekter selv ved fjernt tumor stedet [16]. Disse fakta antyder sterkt at REIC /DKK-3 viser en indirekte anti-tumor effekt gjennom anti-tumor immunsystem som er en viktig faktor ved behandling av metastatisk sykdom. Fordi Ad-REIC har både direkte og indirekte virkninger på kreftbehandling, kan det bli en kraftig terapeutisk alternativ som en «one-kule, to arms» anti-cancer agent spesielt for NSCLCs, som ofte metastaserer til andre organer.
i forhold til klinisk bruk, fordi våre data tyder på at CAR og GRP78 uttrykk statuser i kreftceller forutsi respons fra Ad-REIC behandling, bør Ad-REIC behandlingen fortrinnsvis utføres for pasienter som er kategorisert som høy følsom gruppe i tidlig fasen av behandlingen med en lav dose Ad-REIC. For pasienter med tumor celler avslører middels eller dårlig effektivitet med lavdose Ad-REIC, bør det være for sent fase i sin behandling med høy dose Ad-REIC. For disse pasientene bør kostnadseffektivitet for behandling og klinisk utfall vurderes nøye. Som for administrasjon strategi, kan lokale administrasjonen være å foretrekke fremfor systemisk administrasjon for å minimere negativ effekt i kliniske situasjoner. Vi har tidligere bekreftet i mus modell som Ad-REIC kan bli utbredt i kroppene etter intratumoral lokal administrasjon og lokal administrasjon var effektiv ikke bare direkte, men også indirekte gjennom immunsystemet effekt [16], [23]. I tillegg kunne intrapleural lokale administrasjonen være en annen administrasjon strategi for pasienter med ondartet pleural effusjon. Det har blitt rapportert at den intrapleural administrering av adenovirus-mediert genterapi er en nyttig metode for generering av anti-tumor immunresponser i ondartet mesothelioma og metastatisk pleural effusjon i flere kliniske studier [24], [25].
Avslutningsvis viste vi at Ad-REIC indusert JNK-aktivering og påfølgende apoptose i NSCLC-celler, uavhengig av den type som er kjent molekylære forandringer eller følsomheten til EGFR-TKI. Denne studien antyder at Ad-REIC har en terapeutisk potensial for NSCLC, og uttrykket statusene GRP78 og bil kan være en prediktor for Ad-REIC terapi.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
heatmap bilde av mRNA uttrykk for
REIC /Dkk-3
genet. MRNA uttrykk nivået av
REIC /Dkk-3
genet ble hentet fra UCSC Cancer Genome Browse, som er fritt tilgjengelig offentlig database (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (vi lastet ned data den 16. juli 2013), viste at
REIC /Dkk-3
genekspresjon ble redusert i flertallet av undersøkte prøver av begge (a) lunge adenokarsinomer og (b) plateepitelkarsinom, sammenlignet med normal lunge vev.
doi: 10,1371 /journal.pone.0087900.s001 product: (PDF)
Metode S1.
Støtte informasjon for cellelinjer og Western blot analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0087900.s002 plakater (DOC)
