Abstract
Bakgrunn
For å finne nye markører for å forbedre effektiviteten av kreft i bukspyttkjertelen (PC) diagnose den secretome av to PC-cellelinjer (BxPC-3 og MIA PACA-2) er profilert. UL16 bindende protein 2 (ULBP2), ett av proteinene som er identifisert i PC-celle secretome, ble utvalgt for evaluering som en biomarkør for deteksjon PC fordi dens mRNA-nivået ble også funnet å være signifikant forhøyet i PC-vev.
metoder
ULBP2 uttrykk i PC vev fra 67 pasienter ble undersøkt ved immunhistokjemi. ULBP2 serumnivåer i 154 PC-pasienter og friske kontroller 142 ble målt ved kulebasert immunoassay, og effekten av serum ULBP2 for PC-påvisning ble sammenlignet med den mye brukte serologiske PC-markør karbohydrat antigen 19-9 (CA 19-9).
Resultater
Immunohistokjemiske analyser viste en forhøyet uttrykk for ULPB2 i PC vev sammenlignet med tilstøtende ikke-kreft vev. I mellomtiden, serumnivåene av ULBP2 blant alle PC-pasienter (n = 154) og i tidlig stadium kreftpasienter var betydelig høyere enn i friske kontroller (
p
0,0001). Kombinasjonen av ULBP2 og CA 19-9 utkonkurrerte hver markør alene skille PC pasienter fra friske personer. Viktigere, en analyse av arealet under mottaker drift karakteristiske kurver viste at ULBP2 var bedre enn CA 19-9 i diskriminerende pasienter med tidlig stadium PC fra friske kontroller.
Konklusjoner
Kollektivt, vår resultatene tyder på at ULBP2 kan representere en ny og nyttig serum biomarkør for kreft i bukspyttkjertelen primærscreening
Citation. Chang YT, Wu CC, Shyr YM, Chen TC, Hwang TL, Yeh TS, et al. (2011) Secretome-Based Identifikasjon av ULBP2 som Novel Serum markør for kreft i bukspyttkjertelen Detection. PLoS ONE 6 (5): e20029. doi: 10,1371 /journal.pone.0020029
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 21 januar 2011; Godkjent: 10 april 2011; Publisert: May 20, 2011
Copyright: © 2011 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskuddene fra Taiwan National Science Council (NSC 96-2320-B-182-031-My3), Department of Health (DOH-99-TD-C-111-006), og Kunnskapsdepartementet (EMRPD180241 og EMRPD180091). Finansiører hadde ingen rolle i studie design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødelighet i USA med en 5-års overlevelse mindre enn 7% [1], [2]. I 2010 ble mer enn 43.000 nye PC tilfeller anslått til å utvikle og 36,800 dødsfall var forventet i USA [1]. I Taiwan er det rangert tiende blant kreftrelaterte dødsfall i 2008 og viser økt dødelighet i det siste tiåret [3]. På grunn av den tidlige spredning av PC og sen inntreden av åpenbare symptomer, er mindre enn 8% av PC pasientene diagnostisert ved den lokaliserte trinnet når et kirurgisk kur er mulig [1], [4], [5]. Følgelig er det et presserende behov for å utvikle bedre strategier for tidlig deteksjon av PC.
Nåværende tilnærminger for PC diagnose er i hovedsak basert på bildebehandling og endoskopiske metoder [6], som på grunn av retroperitoneal plasseringen av bukspyttkjertelen , har en begrenset sannsynlighet for tidlig diagnose [7], [8]. En økning i serumnivåer av karbohydrat antigen 19-9 (CA 19-9) har vært mye brukt for PC deteksjon; er imidlertid ikke tilstrekkelige til å både spesifisitet og sensitivitet denne tilnærmingen [6], [9], [10]. I tillegg til CA 19-9, har mer enn 40 proteiner blitt rapportert som potensielle serologiske biomarkører for PC deteksjon [11]. Dessverre har de fleste enten har begrenset spesifisitet og /eller sensitivitet, eller avvente validering med en stor-skala kohort av prøvene [11] – [17], til tross for bevis for at anvendelsen av en combinatory biomarkør panel forbedrer nøyaktigheten av PC diagnose [12] . Derfor oppdagelsen av nye og nyttige serummarkører kan rette forbedring av PC diagnose og /eller prognose.
Nylig ble secretome baserte tilnærminger har blitt mye brukt i identifisering av potensielle kreft biomarkører [18], [ ,,,0],19]. I den foreliggende undersøkelse, analyserte vi secretome av to PC-cellelinjer, BxPC-3 og MIA PACA-2 og evaluert ett av de identifiserte proteiner, UL16 protein 2 (ULBP2), som en potensiell PC biomarkør. Immunhistokjemisk farging Resultatene bekreftet de forhøyede nivåer av ULBP2 i PC vev sammenlignet med tilstøtende ikke-kreft kolleger. Bead-baserte immunanalyser ytterligere validert forhøyet serumnivå av ULBP2 i PC-pasienter versus friske personer. Viktigst, den kombinerte bruk av ULBP2 med CA 19-9 forbedret følsomhet og nøyaktighet av PC tidlig deteksjon i dette tilfelle kontrollstudien, noe som gir en lovende tilnærming til PC diagnose på et tidlig stadium.
Materialer og Metoder
pasientpopulasjonen og kliniske prøver
vevsprøver fra 67 PC-pasienter (median alder 64, range: 35-82) ble samlet i Chang Gung Memorial Hospital (CGMH), Lin-Kou, Taiwan. Vevsprøvene ble oppsamlet ved kirurgi, evaluert ved patologer, og som er lagret i den CGMH Tissue Bank inntil bruk. Serumprøver fra 154 PC pasienter (median alder, 70; range, 31-87) ble samlet i Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. Andre blodprøver, inkludert 142 serumprøver fra friske donorer (median alder, 58, range, 34-86), 25 plasmaprøver fra friske donorer (median alder, 54; range, 29-79), 28 serumprøver fra nasofaryngeal karsinom ( NPC) pasienter (median alder 46; range, 31-80), 29 serumprøver fra kolorektal kreft (CRC) pasienter (median alder 61; range, 30-83), og 30 plasmaprøver fra magekreft (GC) pasienter (median alder, 66, rekkevidde, 33-83), ble samlet i CGMH, Lin-Kou, Taiwan. Aliquoter av disse prøver ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Denne forskningen fulgte prinsippene i Helsinkideklarasjonen og alle fag undertegnet et informert samtykke godkjent av Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital eller Taipei Veterans General Hospital, Taiwan før deres deltakelse i denne studien, og for bruk av vev eller blodprøver innsamlet før behandling.
Cell kultur
PC cellelinjer BxPC-3, MIA PACA-2, PANC-en og ASPC-en ble kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (Hsinchu, Taiwan) . BxPC-3 og ASPC-1 ble opprettholdt i 10% føtalt bovint serum (FBS, Biological Industries, Israel) -supplemented RPMI-1640-medium (Invitrogen, CA, USA). MIA PACA-2 og PANC-1 ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Invitrogen) med 10% FBS, pluss 2,5% hesteserum (Biological Industries) og 10% FBS, respektivt. De fire cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 miljøet.
generasjon secretome datasett av kreftcellelinjer
De metodene som brukes for utarbeidelse av kreftcelle betinget media (CM) og secretome profilering ble beskrevet tidligere [20] og detaljert i materialer og metoder S1.
Public domain database søk etter uttrykk profiler av utvalgte mål gener
uttrykket profiler av utskilte proteiner i PC vev ble søkt i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Den GSE1542 datasettet ble valgt for å identifisere kandidat gener med forhøyet uttrykk nivåer i PC-celler [21]. Den GSE1542 datasettet inneholder genuttrykk profiler av pancreatic ductal celler isolert fra 24 pasienter med bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom og 25 givere med en normal bukspyttkjertel [21]. De midlere intensitet av hvert gen sonde hos friske og cancerøse grupper ble beregnet for å oppnå den Tumor /Normal (T /N) forhold; gener med T /N-forhold ≥2 ble ansett oppregulert kandidater. Blant dem, de med
p
-verdier mindre enn 0,05 beregnes ved å
t
-test ble videre valgt som de mest lovende kandidater for forhøyet uttrykk i kreftvevet.
Western blot-analyse
proteiner i celleekstrakter og CM ble separert ved SDS-PAGE, overført på PVDF-membraner (Millipore, MA, USA), og probet med antistoffer mot transformerende vekstfaktor-β-indusert protein ig-h3 ( BIGH3) (1:1000 fortynning, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), ULBP2 (1:1000 fortynning, R D Systems, MN, USA) eller α-tubulin (1:10000 fortynning, Millipore). Proteiner av interesse ble påvist ved inkubasjon i 1 time med riktig pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology), og visualisert ved hjelp av et forbedret kjemiluminescens system (PerkinElmer, MA, USA).
Immunhistokjemi
immunhistokjemisk farging ble utført med antistoffer mot BIGH3 (1:100 fortynning, Santa Cruz Biotechnology) og ULBP2 (1:20 fortynning, R 2 = moderat; 1 = svak, 0, ingen celle-farging) og prosentandelen av cellefarging [3- , ≥90%; 2, 50-89%; 1, 10-49%; 0, 0-9%)]. De to scorene ble multiplisert og deretter delt på tre for å få sluttresultatet. Positiv farging ble definert som en sluttresultatet ≥0.67 [22], [23]
Serum analyserer
Serum BIGH3 og CA 19-9 nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA kit fra R . D systemer og Alpha Diagnostic (TX, USA), henholdsvis, i henhold til de respektive produsentens instruksjoner. For å bestemme serum ULBP2 konsentrasjon, ble in-house sandwich-ELISA og perlebasert immunologisk etablert i vårt laboratorium (se Materialer og metoder S1 for detaljer).
Statistisk analyse
Forskjeller i immunhistokjemiske score og serumnivåer av target proteiner mellom grupper ble testet ved hjelp av enten Wilcoxon test eller Kruskal-Wallis test. Sammenhenger mellom serumnivåer av target proteiner ble beregnet ved bruk av Pearson korrelasjon, og immunhistokjemiske score til parvise prøver fra samme fag ble sammenliknet med paret
t
-UNDERSØKELSER. Mottageroperatøren karakteristiske (ROC)-kurver ble konstruert ved plotting av følsomhet mot 1-spesifisitet og områdene under de ROC-kurven (AUC) ble analysert ved hjelp av Hanley og McNeil metode. Alle testene var tosidig, og en
p
-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle data ble behandlet ved hjelp av SPSS programvare versjon 13.0 (IL, USA).
Resultater
Secretome analyse av to bukspyttkjertelkreft cellelinjer
For å oppdage potensielle serum PC biomarkører, de utskilte proteiner av PC-cellelinjer ble analysert systemisk. Den skjematiske representasjon av flytskjemaet som brukes er vist på fig. 1A. Proteinene som er tilstede i 24 h serumfrie CM of BxPC-3 og MIA PACA-2-celler ble separert ved hjelp av SDS-PAGE visualisert ved Coomassie-blått-farging (fig. 1B, øvre panel), oppskåret i 40 fraksjoner, spaltet individuelt med trypsin og analysert ved C-18 reversfase-væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS /MS). Proteinet fargingsmønsteret av cellelysatet er også vist i parallell for å demonstrere at de utskilte proteiner ble anriket i CM, og dens mønster var helt forskjellig fra det som genereres av intracellulære proteiner (Fig. 1B, øvre panel). Fordelingen av cytosolisk protein, alfa-tubulin, ble videre undersøkt som en kontroll. Alfa-tubulin ble tydelig påvist i celleekstrakter, men ikke i den CM (fig. 1B, nedre panel), som indikerer at proteinene utvinnes fra CM var ikke på grunn av celledød.
(A), The strategi består av kreft secretome og vev tranacriptome analyse. (B), Proteinene (50 mikrogram) i CM og celleekstrakter (CE) av kreftceller ble vedtatt med 10% SDS-PAGE og farget med Coomassieblå (øvre panel) eller gikk immunoblot analyse med alfa-tubulin (nedre panel ). (C), immunoblotanalyse med anti-BIGH3 og ULBP2 antistoffer.
Etter å ha søkt med Mascot algoritme og sette en cutoff på 95,0% peptid sannsynlighet og 95,0% protein sannsynlighet i Stillas programvare, 1011 og 1141 proteiner med flere (≥2) peptid treff ble funnet i BxPC-3 og MIA Paca-2 CM, henholdsvis (Pidestaller S1 og S2), noe som resulterer i 1427 ikke-redundante og 725 overlapping proteiner.
generasjon kandidat biomarkør liste for PC deteksjon
for å innskrenke kandidatlisten, ble uttrykk nivåer av de vanlige 725 proteiner i bukspyttkjertelen duktale cellene undersøkt i en matrise-basert analyse publisert av Ishikawa et al. [21], hvor sammenlignet de genekspresjon i bukspyttkjertel ductal celler avledet fra 24 bukspyttkjertel ductal adenokarsinom pasienter og 25 givere med en normal pankreas (Fig. 1A). Denne analysen viste at 10 av de 725 proteinene var signifikant oppregulert (≥2-fold over-ekspresjon,
p
0,05) i pankreatisk duktalt karsinom, sammenlignet med ikke-tumor pankreatiske ductal celler (tabell 1). Blant dem har ceruloplasmin blitt bekreftet å være overuttrykt i PC-vev [24], og forhøyede serumnivået av ERO1-lignende protein alfa har blitt rapportert i PC-pasienter sammenlignet med friske kontroller [17], noe som indikerer at den kombinerte analysen av secretome og transkriptom er en mulig strategi for å oppdage nye kandidat PC markører.
Overuttrykte ULBP2 og BIGH3 i PC vev
Vi fokuserer vår oppmerksomhet på ULBP2 og BIGH3 som potensielle PC markører (tabell 1) fordi en annen matrise-basert analyse hadde også vist at deres mRNA nivåer ble signifikant økt i PC vev [25], og heller ikke hadde ennå ikke blitt studert i PC. Vi bekreftet nærvær av BIGH3 og ULBP2 i CM oppsamlet fra PC fire cellelinjer (BxPC-3, MIA PACA-2, PANC-1 og ASPC-1) ved hjelp av Western blot-analyse (Fig. 1C). Ytterligere immunhistokjemiske analyser viste positiv farging for BIGH3 og ULBP2 på 41,9% (13/31) og 100,0% (67/67), henholdsvis, av PC vevssnitt. Inspeksjon av hvert vev seksjon som inneholder både ikke-kreft og kreft ductal vev viste høyere ekspresjon av begge proteinene i cancervev enn i de ikke-kreft motstykker i de fleste vev seksjoner undersøkt (Fig 2A. Støtte figurer S1 og S2). De immunhistokjemiske score av både proteiner i tumorvev var statistisk høyere enn i ikke-kreft kolleger: 0,54 ± 0,46 kontra 0,14 ± 0,27 for BIGH3 (
p
0,0001) og 2,71 ± 0,49 versus 1,89 ± 0,74 for ULBP2 (
p
0,0001) (figur 2B.). Videre analyser viste at deres uttrykk nivåer i tumorvev ikke var statistisk assosiert med alder, kjønn, histologisk grad, samlet tumor stadium, eller tumor-node-metastaser (TNM) klassifisering av kreft i bukspyttkjertelen (Pidestaller S3 og S4).
(A), Immunhistokjemisk farging for BIGH3 (venstre panel) og ULBP2 (høyre panel) i paret pericancerous tilstøtende ikke-kreft (nedre panel) og tumor (øvre panel) vev. Scale bar, 100 mikrometer. Original forstørrelse, × 400. (B), Box-plot analyse av immunhistokjemisk farging score i sammenkoblede tilstøtende ikke-kreft (AN) og tumorvev. Boksen viser 25
th og 75
th persentiler av dataområdet; den midterste linjen viser median; den stiplede linjen viser den midterste 90% fordeling.
Serum nivåer av BIGH3 og ULBP2 i PC-pasienter
For å vurdere potensialet i BIGH3 og ULBP2 som serum PC markører, vi undersøkte deres nivåer i sera fra PC pasienter (n = 154) og friske kontroller (n = 142). Vi målte serum BIGH3 nivåer ved hjelp av et kommersielt ELISA-sett og bestemte serum ULBP2 nivåene ved hjelp av en kule-basert immunoassay utviklet i vårt laboratorium som er i stand til å detektere de vanligvis meget lave nivåer av serum ULBP2 (mindre enn 1 ng /ml) som ikke kunne bli måles nøyaktig ved hjelp av in-house våre sandwich ELISA. Våre kule-baserte immunologisk analyse kan nøyaktig bestemmelse av ULBP2 nivåer over et område på 4,3 pg /ml til 31,9 ng /ml (figur Hjelpemiddel S3). Vi fant at serumnivåene av ULBP2, men ikke BIGH3, ble signifikant forhøyet i PC-pasienter sammenlignet med de i de friske kontroller: 1,87 ± 1,67 versus 1,29 ± 0,49 mg /ml for BIGH3 (
p
= 0,328; fig 3A) og 200,2 ± 168,6 versus 51,4 ± 64,6 pg /ml for ULBP2 (
p
. 0,0001, fig. 3B). Ved hjelp av en grenseverdi på 60 pg /ml for ULBP2, fant vi at sensitivitet og spesifisitet verdier for kreft påvisning var 83,8% og 73,9%, henholdsvis. Serum BIGH3 og ULBP2 nivåer ble ikke statistisk korrelert med alder, kjønn, histologisk grad, samlet tumor stadium, eller TNM klassifisering av PC i denne case-control studie (Støtte tabell S5). Disse funnene tyder på at ULBP2 kan være en roman serum markør for PC deteksjon.
serumnivåer av BIGH3 (A), ULBP2 (B), og CA 19-9 (C) ble målt i 154 bukspyttkjertelen kreftpasienter (PC) og 142 friske kontroller (Ctrl). Data er presentert som Box plott. (D), analyser ROC kurve av evne til BIGH3, ULBP2, CA 19-9, og de to-markør panel bestående ULBP2 og CA 19-9 å diskriminere PC pasienter fra kontroller.
The effekten av ULBP2 og CA 19-9 til PC screening
serum nivåer av CA 19-9, en dag brukt serum PC biomarkør, ble i tillegg analysert i de samme prøvene. Vi fant ut at serum CA 19-9 nivåene var høyere i PC-pasienter enn hos friske kontroller (63,4 ± 24,4 versus 28,3 ± 20,2 U /ml,
p
0,0001, figur 3C.); som ULBP2 ble CA 19-9 nivåer ikke korrelert med clinicopathological egenskaper (Støtte tabell S5). Videre analyser viste at det ikke var noen sammenheng mellom de to molekylene i pasientens kohort (r = 0,061,
p
= 0,453 ved Pearson korrelasjon; Støtte figur S4). Ved 40 U /ml, den grenseverdi som er i bruk for PC screening, sensitivitet og spesifisitet verdier for CA 19-9 var 84,4% og 74,6%, henholdsvis. Spesielt, søker en grenseverdi på 60 pg /ml for ULBP2, var vi i stand til å diskriminere 21 av 24 PC-pasienter med CA 19-9 nivåer 40 U /ml fra friske individer. I tillegg 24 av 36 friske personer med CA 19-9 nivåer 40 U /ml kunne være lenger skilles fra pasienter basert på ULBP2 nivåer. 60 pg /ml
Nytten av ULBP2 og CA 19 -9 som deteksjon markører ble ytterligere undersøkt ved å bruke en ROC-kurve analyse. Denne analysen viste at ULBP2 (AUC = 0,862; 95% konfidensintervall [CI], 0,821 til 0,904) utført litt bedre enn CA 19-9 (AUC = 0,856; 95% CI, 0,809 til 0,902) som en screening markør (Fig. 3D). Viktigst, en logistisk regresjonsmodell [26] har vist at den diagnostiske kapasiteten av kombinasjonen av ULBP2 og CA 19-9 var større enn den for hver markør alene (AUC = 0,910; 95% CI, 0,877 til 0,943, Fig. 3D) . Sammen er disse resultatene indikerer at ULBP2 kan være et nyttig serum PC markør, spesielt når det brukes sammen med CA 19-9.
egnethet ULBP2 og CA 19-9 til PC tidlig deteksjon
Vi så evaluert egnetheten ULBP2 som en tidlig deteksjon markør av PC ved å teste serum ULBP2 nivåene i pasienter med tidlig stadium primære tumorer (TNM-T1 /T2), ingen lymfeknutemetastase (TNM-N0), og ved begynnelsen av generell tumor trinn (stadium I-II). Vi fant ut at serum ULBP2 nivåene var signifikant høyere hos pasienter med tidlig stadium primære tumorer (205,7 ± 184,3 pg /ml,
p
0,0001, n = 34), ingen lymfeknutemetastase (191,6 ± 155,2 pg /ml,
p
0,0001, n = 57), og på et tidlig samlet tumor stadium (181,2 ± 158,8 pg /ml,
p
0,0001, n = 106) enn hos friske kontroller (51,4 ± 64,6 pg /ml, n = 142; 4A fig.). Serum CA 19-9 nivåer ble også forhøyet i de tidlige stadiene av primærtumor (56,3 ± 26,9 U /ml,
p
0,0001), lymfeknutemetastase (62,1 ± 25,5 U /ml,
p
0,0001), og generell tumorstadium (60,7 ± 24,4 U /ml,
p
0,0001) sammenlignet med friske kontroller (28,3 ± 20,2 U /ml, n = 142,) ( fig. 4B). ROC kurve gjort ytterligere viste at ULBP2 var mer passende enn CA 19-9 for kresne friske kontroller fra pasienter med PC diagnostisert som TNM-T1 /T2 (AUC = 0,854 [95% CI, 0,778 til 0,930] versus AUC = 0,796 [95% CI, 0,690 til 0,901]), TNM-N0 (AUC = 0,866 [95% CI, 0,811 til 0,920] versus AUC = 0,841 [95% CI, 0,764 til 0,917]) eller stadium I /II (AUC = 0,846 [95% CI, 0,798 til 0,895] versus AUC = 0,839 [95% CI, 0,782 til 0,896] fig. 4C). Enda viktigere, kombinasjonen av de to markørene var bedre for å skille mellom friske personer og TNM-T1 /T2- (AUC = 0,883; 95% CI, 0,816 til 0,949), TNM-N0- (AUC = 0,893; 95% CI, 0,841 til 0,946), eller stadium I /II-PC-pasienter (AUC = 0,897; 95% CI, 0,856 til 0,937) enn enten markør (fig 4C) alene.. Disse resultatene antyder at ULBP2 er et potensielt nyttig serum markør for PC tidlig deteksjon, spesielt i forbindelse med CA 19-9.
Serum nivåer av ULBP2 (A) og CA 19-9 (B) i friske kontroller ( Ctrl) ble sammenlignet med dem hos pasienter med tidlig stadium PC. Data er presentert som Box plott. (C), analyser av evne til ULBP2 (sort linje), CA 19-9 (stiplet linje), og en kombinasjon av begge proteiner (tykk linje) for å diskriminere tidlig stadium PC-pasienter fra kontroller ROC-kurve.
Blood ULBP2 nivåer hos pasienter med andre krefttyper
for å teste om ULBP2 er også en markør for andre ondartede sykdommer, vi bestemt ULBP2 nivåer i blodet av pasienter med CRC, NPC, og GC. Vi fant ut at serum ULBP2 nivåer tendert til å være høyere hos pasienter som lider av NPC (65,5 ± 74,3 pg /ml,
p
= 0,122, n = 28) sammenlignet med friske kontroller (51,4 ± 64,6 pg /ml) og var moderat, men betydelig høyere i CRC pasienter (70,6 ± 73,8 pg /ml,
p
= 0,038, n = 29, fig. 5A); plasmanivået av ULPB2 var ikke signifikant forskjellig mellom friske personer (86,1 ± 101,2, n = 25) og GC pasienter (78,1 ± 79,7 pg /ml, n = 30,
p
= 0,673, Fig. 5B). Men serum ULBP2 nivåer ble påfallende forhøyet i PC-pasienter sammenlignet med de i CRC (200,2 ± 168,6 versus 70,6 ± 73,8 pg /ml,
p
0,0001) og NPC (200,2 ± 168,6 versus 65,5 ± 74,3 pg /ml,
p
0,0001) pasienter (fig 5a).. Den observasjon at ULBP2 nivået var uforandret, eller bare marginalt forhøyet i to andre gastrointestinale cancere, CRC og GC, antyder at ULBP2 kan representere en relativt spesifikk markør PC.
(A) Serum ULBP2 nivåene i friske kontroller (Ctrl ) ble sammenlignet med dem hos pasienter med nasofaryngeal carcinom (NPC, n = 28) og kolorektal karsinom (CRC, n = 29). (B), Plasma ULBP2 nivåer i kontroller (Ctrl, n = 25) ble sammenlignet med de i mage kreftpasienter (GC, n = 30).
Diskusjoner
CA 19 -9 er ansett som den mest praktisk serum PC markør [27], [28]. Imidlertid, fordi CA 19-9 er også forhøyet i andre gastrointestinale sykdommer, inklusive pankreatitt, hepatitt, galleobstruksjon, og andre gastrointestinale cancere [9], [27], [28], er dets spesifisitet ikke pålitelig. Videre er det ikke uttrykkes i individer med Lewis a-b-genotype [29], og dårlig differensiert PC ser ut til å produsere mindre CA 19-9 enn moderat eller brønn differensierte-kreft [28], og dermed begrenser dens deteksjonsfølsomhet. Klart, identifisering av nye PC-markører som omgås disse begrensningene vil være en velkommen utvikling.
I denne studien brukte vi en integrert tilnærming, kombinert analyser av PC celle secretome og transkriptom å identifisere nye PC markør kandidater, og gi den første bevis for at ULBP2 er en potensiell ny kandidat serum markør for PC diagnose. ULBP2 ble overuttrykt i PC-celler sammenlignet med tilstøtende ikke-cancerøse vev (fig. 2). Bead-baserte immunanalyser utført med mer enn 150 serumprøver fra PC-pasienter viste at serumnivåene ULBP2 ikke bare diskriminert pasienter fra friske donorer, men også vist stort potensiale for PC tidlig deteksjon (fig. 3 og 4). Selv om flere potensielle serum PC-markører er blitt rapportert, har meget få har vist seg å være overlegen i forhold til CA 19-9 [30], [31]. Viktigere, vår sammenligning av serum ULBP2 med CA 19-9 i denne case-control studie viste at serum ULBP2 er bedre enn CA 19-9 som en tidlig diagnostisk markør (Fig. 4). Dette funnet er spesielt viktig i lys av det faktum at de fleste PC-pasienter dør innen ett år fordi de ikke blir diagnostisert før kreften har nådd et avansert stadium [1]. Den diagnostiske og prognostiske potensialet ULBP2 i en klinisk setting må bekreftes ved hjelp av en større serie av serumprøver. Dessuten har flere kandidater som er oppført i tabell 1 ikke blitt studert i detalj for PC, men deres uttrykk nivåer kan bli undersøkt i PC vev ved hjelp av menneskelig Protein Atlas (HPA) database, som inneholder immunhistokjemiske (IHC) flekker profiler av 10118 proteiner i en rekke kreft og ikke-kreft vev basert på 13154 antistoffer (versjon 7.1, https://www.proteinatlas.org/) [32]. Vi har søkt 8 proteiner i HPA-databasen og funnet 5 av dem ble påvist i mer enn 50% av PC-seksjoner undersøkt. Noteworthily, ble alfa-oppløselig NSF feste protein, annexin A11, og ERO1-lignende protein alfa uttrykt i mer enn 50% av PC-seksjoner med moderat til sterk IHC-farging (Hjelpemiddel tabell S6). Disse tre proteiner kan representere potensielle PC biomarkører som garanterer videre etterforskning.
En konsensus coalesced rundt ideen om at effektiv og nøyaktig deteksjon av tidlig stadium kreft vil trolig stole på markør paneler som besitter bedre spesifisitet og sensitivitet enn hver markør alene [26], [33]. Som bemerket ovenfor, er CA 19-9 i dag brukes til PC deteksjon, men dets anvendelse som en primær screening middel er problematisk. Derfor, en markør panel som kombinert CA 19-9 med andre nyttige markører, for eksempel ULBP2, kan forbedre evnen til å oppdage og overvåke kreft. En kombinasjon av begge merkene evinced en forbedret diagnostisk effektivitet sammenlignet med tradisjonell tilnærming ved hjelp av CA 19-9 alene, spesielt med hensyn til påvisning av tidlig stadium PC (Fig. 4).
Selv om ULBP2 har blitt rapportert som en vev og serum prognostisk markør for eggstokkreft [34] og føflekkreft [35], henholdsvis, mener vi at ULBP2 har fortsatt potensial som et relativt konkret og nyttig serum test for PC diagnose. En rekke linjer av bevis støtter denne: (a) ULBP2 serum /plasmanivåene ble ikke signifikant forhøyet i GC, CRC eller NPC pasienter sammenlignet med friske individer i denne studien; (B) Li et al. har rapportert at ULBP2 var ikke påvises i sera av eggstokkreft pasienter [34]; (C) Paschen et al. viste at ULBP2 var ikke målbar i mer enn 20% av testet i sera fra melanom pasienter, spesielt i tidlig stadium pasienter [35]; og (d) ULBP2, i motsetning til CA 19-9, synes ikke å være uttrykt på lavere nivåer i dårlig differensiert PC enn i moderat eller godt differensiert kreft (Pidestaller S4 og S5). Imidlertid vil evaluering av ULBP2 som en bukspyttkjertelkreft markør krever stor-skala mot-screening, spesielt ved bruk av serumprøver fra pasienter pankreatitt.
ULBPs og den store histocompatibility komplekse klasse I-relaterte kjede (MIC) er celleoverflate ligander for NK og T-celle-uttrykt immunoreceptor (NKG2D) som sjelden uttrykt av normale celler, men vises i et bredt spekter av maligniteter [36], [37]. Disse ligander kan aktivere naturlige killer (NK) og cytotoksiske T-celler ved å binde til den NKG2D, og deretter bidra til celle-mediert cytolyse og clearance av kreft [38], som tyder på at tumorceller som overuttrykker disse ligandene er mer utsatt for celle-mediert immun overvåkning. Faktisk har MIC uttrykk blitt beskrevet som en indikator for bedre prognose i CRC-pasienter [39], og frigjøring av NKG2D ligander fra tumorceller har tidligere vært påvist som en ny kreft immunoevasion mekanisme [40], [41]. Det er nylig blitt foreslått at proteolytisk utstøtingen av ULBP2 fra tumorceller er mediert av matriks-metalloproteaser (MMP), og kan svekke immunogenisiteten av tumorceller [41]. Via secretome analysen i denne studien, kan flere MMPs, inkludert MMP-1, -7, -9, -11, -13, -14, og -28 påvises i CM fra PC-cellelinjer (Hjelpemiddel Tabeller S1 og S2) . Videre forhøyet ekspresjon av MMP-7, -8, -9 og -11 er blitt beskrevet i PC-vev; to av disse, MMP-7 og MMP-11, er sterkt assosiert med dårlig prognose kreft [42]. Disse observasjonene kollektivt tyder på at forhøyet serum ULBP2 nivåer i PC-pasienter kunne reflektere involvering av proteolysespalting av MMP løslatt fra kreften selv. Ved å aktivere NK og cytotoksiske T-celle-mediert immunitet, eliminering av ULBP2 løselig form kan være en effektiv terapeutisk strategi i PC. Dette spennende mulighet garanterer videre etterforskning.
I konklusjonen, vi her rapporterer at ULBP2 serumnivåer i PC-pasienter er betydelig høyere enn hos friske kontroller. Kombinasjonen av ULBP2 og CA 19-9 utkonkurrerte hver markør alene skille PC pasienter fra friske personer. Enda viktigere, en analyse av arealet under ROC-kurven viste at ULBP2 var overlegne i forhold til CA 19-9 i diskriminerende pasienter med tidlig stadium kreft i bukspyttkjertelen fra friske kontroller. Dermed kan ULBP2 representerer en ny og nyttig serum biomarkør for primær screening for kreft i bukspyttkjertelen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Påvisning av BIGH3 uttrykk i 31 kreft i bukspyttkjertelen vev ved immunhistokjemi.
doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s001 product: (PDF)
Figur S2.
Påvisning av ULBP2 uttrykk i 67 kreft i bukspyttkjertelen vev ved immunhistokjemi.
doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s002 product: (PDF)
Figur S3.
Standardkurve av ULBP2 bestemt ved kulebasert immunologisk analyse utviklet i huset.
doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s003 product: (PDF)
Figur S4.
Korrelasjon av serum ULBP2 og serum CA 19-9 nivåer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s004 product: (PDF)
Tabell S1.
Liste av proteiner identifisert i BxPC-3 kondisjonert medium.
doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s005 product: (PDF)
Tabell S2.
Liste over proteiner identifisert i MIA PACA-2 kondisjonert medium.
doi: 10,1371 /journal.pone.0020029.s006 product: (PDF)
tabell S3.
Sammenheng mellom clinicopathological funksjoner og BIGH3 uttrykk i vevssnitt fra 31 bukspyttkjertelen kreftpasienter.
