Abstract
Histone metylering spiller en avgjørende rolle i ulike biologiske og patologiske prosesser, inkludert kreftutvikling . I denne studien, oppdaget vi at JARID2, et samspill komponent av Polycomb undertrykkende kompleks-2 (PRC2) som katalyserer metylering av lysin 27 av histon H3 (H3K27), var involvert i transformerende vekstfaktor-beta (TGF-ß) indusert epitelial -mesenchymal overgang (EMT) av A549 lungekreft cellelinjen og HT29 kolon kreftcellelinje. Uttrykket av
JARID2
ble økt i løpet av TGF-ß-indusert EMT av disse cellelinjer og knockdown av
JARID2
hemmet TGF-ß-indusert morfologiske konvertering av cellene i forbindelse med EMT.
JARID2
knockdown selv hadde ingen effekt i uttrykket av EMT-relaterte gener, men motvirkes TGF-ß-avhengige uttrykk endringer av EMT-relaterte gener som
CDH1
,
ZEB
familie og
mikroRNA-200
familien. Chromatin immunoutfellingsstudier analyser viste at JARID2 ble innblandet i TGF-ß-indusert transcriptional undertrykkelse av
CDH1 Hotell og
mikroRNA-200
familiens gener gjennom regulering av histon H3 metylering og EZH2 occupancies på sine regulatoriske regioner . Vår studie viste en roman rolle JARID2 protein, som kan kontrollere PRC2 rekruttering og histon metylering under TGF-ß-indusert EMT av lunge- og tykktarmskreft cellelinjer
Citation. Tange S, Oktyabri D, Terashima M, Ishimura A, Suzuki T (2014) JARID2 er involvert i Transforming Growth Factor-Beta-Induced Epitelial-Mesenchymale Overgang av lunge og tykktarmskreft cellelinjer. PLoS ONE 9 (12): e115684. doi: 10,1371 /journal.pone.0115684
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republic Of
mottatt: 16 september 2014; Godkjent: 25 november 2014; Publisert: 26.12.2014
Copyright: © 2014 Tange et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-i-Aid for Scientific Research C (tilskudd nummer 24.590.346 til TS) og forskning på innovative områder (tilskudd nummer 22.112.010 til TS) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lysin (K) metylering på den amino-terminale halen av histon H3 (K4, K9, K27 og K36) har dukket opp som et viktig post-translasjonell modifikasjon på grunn av sine spesifikke dynamikk for transkripsjonsregulering [1], [2]. Metylering av H3K4 har vært tett knyttet til aktiv transkripsjon mens metylering av H3K9 og H3K27 er undertrykkende merker for kromatin. Disse endringene er regulert av histon lysin metyltransferaser (kmts) og lysin demethylases (KDMs). Nyere studier har indikert at deregulering av disse enzymene kan bidra til den utviklingsmessige defekter og patogenesen av menneskelige sykdommer, inkludert kreft [1] – [3].
For å finne nye gener involvert i kreftutvikling, har vi utføres retrovirale insertional mutagenese i mus. Denne skjermen førte til isoleringen av hundrevis av kandidatkreftgener blant mange gener som koder for kmts og KDMs [4], [5]. Tidligere rapporterte vi at KDM5B /PLU1 /JARID1B, en H3K4 demetylase og en av kandidat onkogener, nedregulert uttrykk for
KAT5 Hotell og
CD82
gener for å øke celle invasjon [6] og undertrykt uttrykk for
mikroRNA-200 plakater (
MIR-200
) familie, og dermed fremme epitelial-mesenchymale overgang (EMT) av kreftceller [7]. Således våre studier viste at histon metyl-modifiserende enzymer ble involvert ikke bare i startfasen, men også i tumorprogresjon.
tumorprogresjon har vært assosiert med aktiveringen av EMT programmet som er indusert av ytre signaler slik som transformerende vekstfaktor-beta (TGF-P) [8], [9]. EMT er karakterisert ved endringene i epiteliale og mesenkymale genekspresjon. Spesielt, er avgjørende for EMT den nedregulering av E-cadherin. Flere transkripsjonelle repressorer som ZEB1 og ZEB2 er involvert i E-cadherin transkripsjonen undertrykkelse under EMT [10]. Den reversible egenskaper av EMT tyder på at epigenetisk reguleringen som DNA-metylering, histon modifikasjon og mikroRNA kan være involvert [11]. Det finnes flere aviser, inkludert vår studie som viser sammenhengen mellom E-cadherin undertrykkelse og funksjonen av histon metyl-modifiserende enzymer [7], [12], [13]. Imidlertid er rollen til histone metylering i EMT bare begynner å bli avdekket.
JARID2 er en av de Jarid proteiner som inneholder JmjC (Jumonji C) domene og tørre (AT-rik interaksjon domene) [2]. Imidlertid mangler JARID2 protein histon-demetylase aktiviteten som er karakteristisk for andre JmjC domeneproteiner fordi den har aminosyresubstitusjoner i den konserverte regionen [2]. JARID2 har blitt rapportert som tilbehør komponent av Polycomb undertrykkende kompleks-2 (PRC2) som regulerer viktige genuttrykksmønster under utvikling [14]. PRC2 inneholder kjerne subenheter: EZH2, SUZ12, EED og RBBP4 /7, og er ansvarlig for undertrykkende H3K27 metylering [15]. JARID2 ble vist å kontrollere PRC2 belegg og aktivitet på målgener i embryonale stamceller (ESCs) [16] – [19]. På den annen side er deregulering av PRC2 aktivitet antas å bidra til menneskelig utvikling kreft. EZH2, en enzymatisk komponent av PRC2, ble vist å være overuttrykt i metastatisk kreft, og uttrykket nivåer var assosiert med tumorprogresjon [20], [21]. Imidlertid er rollen til JARID2, et samspill komponent av PRC2, under progresjon av kreft er ukjent.
I denne studien undersøkte vi funksjonen av JARID2 i løpet av TGF-ß-indusert EMT av A549 lungekreft cellelinjen og HT29 kolon cancercellelinje. Vi fant ut at TGF-ß-avhengige uttrykk endringer av EMT-relaterte gener ble hemmet av
JARID2
knockdown og forsterket av
JARID2
overekspresjon. Mekanistiske undersøkelser antydet at JARID2 var involvert i TGF-ß-indusert transcriptional undertrykkelse av
CDH1 Hotell og
MIR-200
familiens gener gjennom modulering av histon H3 metylering.
Material og metoder
Plasmider
Den lille hårnål RNA (shRNA) -expressing retrovirus vektorer ble konstruert som beskrevet tidligere [6]. Følelsen tråd sekvensene av oligonukleotider var som følger:
JARID2
shRNA # 1, 5′-ccgggaaacaggtttctaaggtaaactcgagtttaccttagaaacctgtttcttttt-3 «
JARID2
shRNA # 2, 5′-ccgggcccaacagcatggtgtatttctcgagaaatacaccatgctgttgggcttttt-3 «
sekvensen av kontroll shRNA ble beskrevet tidligere [6]. Vi har bekreftet at ekspresjonen av
JARID2
ble nedregulert ved infeksjon av både
JARID2
shRNA-uttrykkende retrovirus, selv i nærvær av TGF-ß ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR ) og Western blot (S1 fig.). Vi bekreftet også at både
JARID2
shRNAs forårsaket de samme effektene i våre EMT studier (S2 fig.), Og dermed har vi presenterte data fra
JARID2
shRNA # 1 som et representativt resultat (beskrevet som JARID2 KD). Menneskelig
JARID2
cDNA ble merket med FLAG-6xHis-tag, og deretter klonet inn pDON-5 Neo plasmid (Takara) til å produsere retrovirus uttrykke JARID2.
Cell kultur og transfeksjon
A549 humane lungekreft-cellelinje og HT29 human koloncancer cellelinje ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Y. Endo (Cancer Research Institute, Kanazawa Univ.) og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% FBS, 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin (Sigma) ved 37 ° C i 5% CO2. For EMT induksjon, ble A549-celler behandlet med 1 ng /ml TGF-P (R 0,01 sammenligning å kontrollere). (F) Western blot ble utført for å påvise ekspresjon av JARID2 proteiner i løpet av TGF-ß-indusert EMT. Som en kontroll, ble anti-GAPDH-antistoff som brukes til å vise at like mengder av proteiner ble lastet på gelen.
knockdown av JARID2 hemmet morfologiske forandringer av cellene indusert av TGF-ß
å belyse funksjon JARID2 i EMT, undersøkte vi om knockdown av
JARID2
ville påvirke EMT prosessen indusert av TGF-ß. A549 celler ble infisert med kontrollretrovirus eller retrovirus uttrykke
JARID2
shRNA, og infiserte celler ble behandlet med eller uten TGF-ß. Etter TGF-ß behandling, ble kontrollcellene dispergeres, langstrakt og antok en fibroblast-lignende utseende forbundet med EMT (fig. 2A).
JARID2
knockdown selv ikke endre celleformer betydelig, men hemmet morfologiske endringer av celler indusert av TGF-ß (Fig. 2A). Neste utførte vi immunfluorescens analyse ved bruk av et antistoff mot E-cadherin, en epitelial cellemarkør. Ubehandlede kontroll A549-celler viste heterogen E-cadherin farging, og dette farging ble nesten borte i TGF-ß-behandlede celler som beskrevet tidligere (Fig. 2B) [23]. Som vist på fig. 2B, E-cadherin farging ble klart påvist i
JARID2
knockdown celler behandlet med eller uten TGF-ß, noe som tyder på at den epiteliale eiendom kan opprettholdes i
JARID2
knockdown cellene selv etter TGF-ß behandling. Vi videre undersøkt statusen aktin i cellene ved TRITC-konjugert phalloidin flekker, siden aktin omorganisering skjer under EMT prosessen [8]. I motsetning til ubehandlede kontrollceller, TGF-ß dramatisk indusert aktin fiberdannelse er typisk for EMT (Fig. 2C). Men i
JARID2
knockdown celler, vi ikke observere aktin fiberdannelse selv i nærvær av TGF-ß (Fig. 2C).
(A) Cell morfologiske endringer av A549 celler etter TGF-ß behandling. A549-celler ble infisert med retrovirus som uttrykker kontroll shRNA eller
JARID2
shRNA (beskrevet som
JARID2
KD) uten eller med ved behandling av 1 ng /ml TGF-ß i 48 timer. (B) immunfluorescens bilder av celler som viser lokalisering av E-cadherin. Panelene av A549 celler med samme ordning med (A) ble farget med anti-E-cadherin antistoff og med DAPI. (C) Fluorescens bilder av celler som viser omorganisering av aktin cytoskjelettet ved farging med TRITC-phalloidin (Actin) og med DAPI. Skala barer: 20 mikrometer
Vi har også undersøkt om
JARID2
knockdown ville føre til tilsvarende effekter i en annen EMT modell.. Vi har brukt en human koloncancercellelinje, HT29, fordi den svarer til TGF-ß for EMT [7]. For uttrykk for
JARID1A
,
JARID1B
,
JARID1C Hotell og
JARID1D
, QRT-PCR viste at bare
JARID1B
uttrykk var signifikant økt etter behandling av 5 ng /ml TGF-ß (fig. 3B). Ekspresjonen av
JARID1D
ble ikke påvist i HT29-celler, fordi
JARID1D
-genet befinner seg på Y-kromosomet og HT29-celler er avledet fra en kvinnelig pasient tykktarmskreft. QRT-PCR og Western blot viste at
JARID2
uttrykk ble også økt i HT29 celler etter TGF-ß behandling (Fig. 3D og 3E). Som vist på fig. 4, TGF-ß behandlings indusert morfologiske endringer, forsvinning av E-cadherin farging og dannelsen av aktin spenning fiber i HT29-celler.
JARID2
knockdown seg selv ikke føre til vesentlige endringer i forhold til å kontrollere celler, men motvirkes disse TGF-ß-indusert fenotyper (Fig. 4). Til sammen disse resultatene indikerte at knockdown av
JARID2
motvirket TGF-ß-indusert morfologiske endringer og cytoskeletal rearrangements av A549 og HT29 kreftceller som er karakteristiske for EMT.
QRT-PCR-analyse ble utført for å påvise uttrykk for
JARID1A product: (A),
JARID1B plakater (B),
JARID1C product: (C) og
JARID2 product: (D) i HT29 celler før og etter behandlingen av 5 ng /ml TGF-ß (12 h, 24 h, 48 h og 72 h) (*,
P
0,01 sammenligne å styre; **,
P
0,05 sammenligne å styre). (E) Western blot ble utført for å påvise ekspresjon av JARID2 proteiner i løpet av TGF-ß-indusert EMT. Som en kontroll, ble anti-GAPDH-antistoff som brukes.
(A) Celle morfologiske forandringer av HT29-celler etter TGF-ß behandling. HT29-celler ble infisert med retrovirus som uttrykker kontroll shRNA eller
JARID2
shRNA (beskrevet som
JARID2
KD) uten eller med ved behandling av 5 ng /ml TGF-ß i 72 timer. (B) immunfluorescens bilder av celler som viser lokalisering av E-cadherin. Panelene av HT29 celler med samme ordning med (A) ble farget med anti-E-cadherin antistoff og med DAPI. (C) Fluorescens bilder av celler som viser omorganisering av aktin cytoskjelettet ved farging med TRITC-phalloidin (Actin) og med DAPI. Skala barer: 20 mikrometer
knockdown av JARID2 påvirket endringene i uttrykket av EMT-relaterte gener indusert av TGF-ß
EMT er preget av endringene i epiteliale og mesenchymale markør. genekspresjon [8]. Dermed har vi analysert uttrykk for en epitelial markør,
CDH1 /E-cadherin
, og mesenchymale markører,
FN1 /Fibronectin Hotell og
vimentin
i
JARID2
knockdown celler. QRT-PCR viste at TGF-ß redusert uttrykk for
CDH1 /E-cadherin
mRNA i A549 celler (Fig. 5A) som tidligere rapportert [23].
JARID2
knockdown selv hadde ingen effekt på
CDH1
uttrykk, men hemmet undertrykkelse av
CDH1
indusert av TGF-ß (Fig. 5A). For
FN1 /Fibronectin Hotell og
vimentin
som uttrykk ble oppregulert av TGF-ß,
JARID2
knockdown motvirket effekten av TGF-ß (Fig. 5B og 5C ). Disse resultatene antydet at
JARID2
knockdown hemmet genuttrykket program av TGF-ß-indusert EMT i A549 celler.
QRT-PCR-analyse ble utført for å påvise uttrykk for
CDH1 /E-cadherin product: (A),
FN1 /Fibronektin plakater (B),
vimentin product: (C),
ZEB1 product: (D),
ZEB2
(E),
MIR-200a product: (F),
MIR-200c product: (G) og
JARID1B product: (H) i A549 celler infisert med retrovirus uttrykker kontroll shRNA eller
JARID2
shRNA med eller uten behandling av 1 ng /ml TGF-ß i 24 timer (*,
P
0,01 sammenligne å styre). (I) Western blot ble utført for å påvise ekspresjon av E-cadherin, Fibronektin, vimentin, ZEB1, ZEB2, fosforylert SMAD3 (P-SMAD3) og GAPDH proteiner ved hjelp av de tilsvarende antistoffer.
I løpet av EMT prosess, har det blitt rapportert at ekspresjon av E-cadherin er regulert av transkripsjons repressorer som ZEB1 og ZEB2 [10]. Dermed har vi analysert uttrykk for ZEB familie transkripsjon repressors i
JARID2
knockdown celler. Som vist på fig. 5D og 5E, TGF-ß behandling oppregulert uttrykk for
ZEB1 Hotell og
ZEB2
i A549 celler.
JARID2
knockdown seg ikke påvirke uttrykket av
ZEB1 Hotell og
ZEB2
betydelig, men hemmet TGF-ß avhengig økning av både transkripsjoner (fig. 5D og 5E ). Dette funnet førte oss til å undersøke muligheten for at effekten kan skyldes regulering av
MIR-200
familie av microRNAs.
MIR-200
familien har blitt rapportert å hemme ZEB1 og ZEB2 spesielt under EMT [24], [25]. Dermed har vi undersøkt om
JARID2
knockdown ville påvirke uttrykket av to representative miRNAs,
MIR-200a Hotell og
MIR-200c
. I samsvar med tidligere rapporter [24], TGF-ß behandling resulterte i redusert uttrykk for
MIR-200a Hotell og
MIR-200c
i A549-celler (fig. 5F og 5G).
JARID2
knockdown seg ikke påvirke uttrykket, men hemmet nedregulering av begge microRNAs indusert av TGF-ß (fig. 5F og 5G). Neste vi undersøkte uttrykk for
JARID1B
i
JARID2
knockdown celler, fordi
JARID1B
ble funnet å være oppregulert etter TGF-ß behandling og for å bli innblandet i EMT [7]. Som vist på fig. 5H,
JARID2
knockdown seg ikke påvirke uttrykket av
JARID1B
betydelig, men hemmet TGF-ß avhengig økning av
JARID1B
karakterutskriften.
Vi analyserte også endringer i protein uttrykk for noen av EMT-relaterte genprodukter i A549-celler.
JARID2
knockdown kansellert TGF-ß avhengig reduksjon av E-cadherin protein og økning av fibronektin, vimentin, ZEB1 og ZEB2 proteiner (Fig. 5i), som gjorde oss i stand til å bekrefte QRT-PCR resultater. Neste vi prøvde å undersøke om TGF-ß signalveien ville bli svekket eller ikke i
JARID2
knockdown celler ved å oppdage de fosforylerte SMAD3 proteiner etter TGF-ß behandling [9]. Som vist på fig. 5I, de fosforylerte SMAD3 proteinene ble indusert av TGF-ß og deres nivåer var lik i kontrollceller og
JARID2
knockdown celler. Dette resultatet indikerer at aktivering av nedstrøms SMAD3 transkripsjonsfaktor av TGF-ß signalet ikke ville bli forstyrret av
JARID2
knockdown. Dessuten bekreftet vi effekten av
JARID2
knockdown i reguleringen av EMT-relaterte gener i en annen cancercellelinje, HT29 (fig. 6). QRT-PCR viste at
JARID2
knockdown samme måte hemmet TGF-ß-indusert forandringer av
CDH1 /E-cadherin
,
FN1 /Fibronektin
,
ZEB1
,
MIR-200a
,
MIR-200c Hotell og
JARID1B
uttrykk i HT29 celler (fig. 6A-F), og Western blot gjort oss i stand til å bekrefte QRT -PCR resultater (fig. 6G). Disse resultatene sammen antydet at JARID2 ikke påvirker aktiveringen av nedstrøms transkripsjonsfaktorer av TGF-ß-signal, men var involvert i TGF-ß-avhengig transkripsjonsregulering av EMT-relaterte gener i A549 lungekreft cellelinjen og HT29 kolon kreftcellelinje.
QRT-PCR-analyse ble utført for å påvise uttrykk for
CDH1 /E-cadherin product: (A),
FN1 /Fibronektin plakater (B),
ZEB1
(C),
MIR-200a product: (D),
MIR-200c product: (E) og
JARID1B product: (F) i HT29 celler infisert med retrovirus uttrykker kontroll shRNA eller
JARID2
shRNA med eller uten behandling av 5 ng /ml TGF-ß i 24 timer (*,
P
0,01 sammenligne å styre; **
P
0,05 sammenligne å styre). Uttrykket av
vimentin Hotell og
ZEB2
var opprinnelig lav eller ikke påvist i HT29 celler. (G) Western blot ble utført for å påvise ekspresjon av E-cadherin, Fibronectin, ZEB1 og GAPDH proteiner ved hjelp av de tilsvarende antistoffer.
JARID2 er innblandet i transkripsjonen regulering av CDH1 og MIR-200 familie gen av TGF-ß gjennom konvertering av histon H3 metylering
JARID2 er en viktig kofaktor PRC2 enzymkompleks som katalyserer metylering av H3K27 [14], [15] og er involvert i transcriptional undertrykkelse i ESCs [16] – [19]. Dermed har vi undersøkt metylert status av histon H3 på de regulatoriske regioner av
CDH1 Hotell og
Mir-200
familie gener, som ble transcriptionally trykt under TGF-ß-indusert EMT, med kromatin immunpresipitering ( chip) assay. Genetisk,
MIR-200
familien er gruppert i to polycistronic enheter:
MIR-200b /200a /429 Hotell og
MIR-200C /141 product: [26]. Etter immunoprecipitation, primersettene plassert oppstrøms fra transkripsjonsstartsider av
CDH1
genet og to mikroRNA klynger ble brukt i kvantitativ PCR [7].
Fordi JARID2 kan rekruttere PRC2 komplekset til kromatin i ESCs [16] – [19], må vi først analysert transcriptionally undertrykkende tri-metylert H3K27 (H3K27me3) status i A549 celler. På de regulatoriske regioner av
CDH1
,
MIR-200b /200a /429 Hotell og
MIR-200c /141
gener, nivåene av H3K27me3 ble betydelig økt etter TGF ß-behandling (fig. 7), som ble korrelert med den transkripsjonelle undertrykkelse av disse genene. På den annen side er transkripsjonelt aktive H3K4me3 merker vesentlig redusert på disse regulatoriske områder av TGF-ß (fig. 7). Enda viktigere, observerte vi den forbedrede rekruttering av EZH2, en katalytisk subenhet av PRC2 komplekse, på følgende regulatoriske områder etter TGF-ß-behandling (fig. 7). Disse resultatene antydet at TGF-ß-indusert rekruttering av EZH2 på de regulatoriske regioner kan være ansvarlig for transkripsjons undertrykkelse i A549 celler.
JARID2
knockdown seg selv ikke føre til noen endringer av histon metylering og EZH2 occupancies på disse områdene. Videre TGF-ß behandling i
JARID2
knockdown celler resulterte ikke i økningen av H3K27me3, reduksjon av H3K4me3 og økningen av EZH2 rekruttering (Fig. 7). Denne observasjonen ble korrelert med hemming av TGF-ß-avhengige transcriptional undertrykkelse av
CDH1 Hotell og
Mir-200
familie gener i
JARID2
knockdown-celler (fig. 5A, 5F og 5G). Vi kunne ikke oppdage rekruttering av endogent JARID2 protein på de regulatoriske regioner av Chip analysen med anti-JARID2 antistoff, muligens på grunn av sin lave reaktivitet for immunoprecipitation. Men disse resultatene antydet at JARID2 var ansvarlig for TGF-ß-indusert transcriptional undertrykkelse av
CDH1 Hotell og
Mir-200
familie gener under EMT av A549 celler og at dens funksjon var knyttet til regulering av rekruttering av EZH2 på kromatin for histone metylering. Som en kontroll eksperiment, utførte vi ChIP analysen på regulatoriske regionen urelaterte
GAPDH
genet i A549 celler. Det var ingen signifikante endringer i H3K27 og H3K4 metylering og EZH2 occupancies på regulatoriske regionen
GAPDH
genet ved JARID2 knockdown og /eller TGF-ß behandling (S3 fig.). Dette indikerte at JARID2-mediert endringer av histon H3 metylering og EZH2 rekruttering kan være spesifikke for målgener regulert av JARID2 og TGF-ß, som ble korrelert med spesifisitet av transkripsjonsregulering.
ChIP analyser av H3K27me3, H3K4me3 og EZH2 på de regulatoriske regioner av
CDH1 product: (A),
MIR-200b /200a /429
(B) og
MIR-200C /141
gener (C ) på A549-celler er vist. De occupancies denaturert histoner eller EZH2 protein på regionene ble analysert ved kvantitativ PCR (*,
P
0,01 sammenligne å styre; **
P
0,05 sammenligne å styre) .
videre har vi også undersøkt effekten av
JARID2
knockdown i status for histon H3 metylering og EZH2 rekruttering på de regulatoriske regioner av
CDH1 Hotell og
MIR-200
familie gener i en annen kreftcellelinje, HT29 (fig. 8). ChIP analyser avslørte at
JARID2
knockdown samme måte hemmet TGF-ß avhengig økning av H3K27me3 og EZH2 occupancies og reduksjon av H3K4me3 på følgende regulatoriske områder (Fig. 8). Disse JARID2-medierte effekter ble ikke observert på regulatoriske regionen GAPDH-genet (S4 fig.). Derfor er disse resultatene sammen antydet at JARID2 var nødvendig for TGF-ß avhengige endringer av histon H3 metylering og EZH2 rekruttering på de spesifikke målgener under TGF-ß-indusert EMT prosessen med A549 og HT29 kreftcellelinjer.
ChIP analyser av H3K27me3, H3K4me3 og EZH2 på de regulatoriske regioner av
CDH1 product: (A),
MIR-200b /200a /429 plakater (B) og
MIR-200c /141
gener (C) i HT29-celler er vist. De occupancies denaturert histoner eller EZH2 protein på regionene ble analysert ved kvantitativ PCR (*,
P
0,01 sammenligne å styre; **
P
0,05 sammenligne å styre) .
over-uttrykk for JARID2 forbedret TGF-ß-avhengig transkripsjonsregulering av EMT-relaterte gener
for å utvide vår forståelse for regulering av EMT av JARID2, undersøkte vi effekten av
JARID2
over-uttrykk i A549 celler. Over-uttrykk for
JARID2
ble bekreftet ved QRT-PCR og Western blot og nivået på over-uttrykt
JARID2
ble ikke vesentlig endret før og etter TGF-ß behandling (S5 fig.) . Da vi undersøkte uttrykk for
CDH1 /E-cadherin
,
FN1 /Fibronektin
,
vimentin
,
ZEB1, ZEB2, MIR-200A Hotell og
MIR-200c
i A549 celler med
JARID2
over-uttrykk.
JARID2
over-uttrykk i seg selv ikke viste noen betydelige endringer i uttrykket av EMT-relaterte gener, men forsterket effekten av TGF-ß i uttrykket av EMT-relaterte gener (Fig. 9A-G). I
JARID2
over-uttrykker celler, uttrykk for
CDH1, MIR-200a Hotell og
MIR-200c
ble undertrykt mer av TGF-ß, og uttrykk for
FN1
,
ZEB1 Hotell og
ZEB2
ble aktivert mer av TGF-ß (fig. 9A-G). Vi bekreftet også at
JARID2
over-uttrykk forbedret TGF-ß avhengig reduksjon av E-cadherin protein og økning av fibronektin, vimentin, ZEB1 og ZEB2 proteiner (Fig. 9 H). Resultatene indikerte at over-uttrykk for
JARID2
forsterkes TGF-ß-avhengig transkripsjonsregulering under EMT prosessen med A549 celler.
QRT-PCR-analyse ble utført for å påvise uttrykk for
CDH1 /E-cadherin product: (A),
FN1 /Fibronektin plakater (B),
vimentin product: (C),
ZEB1 product: (D),
ZEB2 product: (E),
MIR-200a product: (F) og
MIR-200c product: (G) i A549 celler infisert med kontrollretrovirus eller retrovirus uttrykke
JARID2
med eller uten behandling av TGF-ß i 24 timer (*,
P
0,01 sammenligne å styre; **
P
0,05 sammenligne å styre; ***
P
0,05 sammenligne å styre pluss TGF-ß). (H) Western blot ble utført for å påvise ekspresjon av E-cadherin, Fibronektin, vimentin, ZEB1, ZEB2 og GAPDH proteiner ved hjelp av de tilsvarende antistoffer.
Det neste vi prøvde å undersøke om
JARID2
over-uttrykk i A549 celler vil påvirke metylert status av histon H3 og rekruttering av EZH2 på de regulatoriske regioner av
CDH1
,
MIR-200b /200a /429 Hotell og
MIR-200c /141
gener av Chip analyse. På disse regulatoriske regioner,
JARID2
over-uttrykk i seg selv ikke endrer nivåene av H3K27me3 og H3K4me3 betydelig, men forsterket effekten av TGF-ß på begge modifikasjoner (Fig. 10), som ble korrelerte godt med uttrykk nivåer av
CDH1
og
MIR-200
familie gener. Videre
JARID2
overuttrykk selv hadde liten effekt i EZH2 occupancies, men forbedret EZH2 rekruttering på følgende regulatoriske regioner etter TGF-ß behandling (Fig. 10). Vi kunne også påvise økt rekruttering av FLAG-merket JARID2 proteiner på regionene bare i nærvær av TGF-ß (Fig. 10).
