Abstract
Bakgrunn
Vitamin D er kjent for å spille en viktig rolle i kreft-forebygging. En av funksjonene i forbindelse med utbruddet av malignitet er heving av Cu (II) nivåer. Modusen av kreft-forebygging formidlet av kalsitriol, den biologisk aktive formen av vitamin D, er fortsatt i stor grad ukjent.
Metoder
Ved hjelp av eksogent lagt Cu (II) for å stimulere en malignitet som betingelse i en roman mobilsystemet av kanin Calcitriol belastet lymfocytter, vurdert vi lipidperoksidasjon, protein karbonyleringskatalysator, DNA-skade og påfølgende apoptose. Frie radikaler meklere ble identifisert ved hjelp av frie radikaler Fjerner og rollen til Cu (II) i reaksjonen ble belyst ved hjelp gelatorer av redoks aktive mobilnettet metallioner.
Resultater
lipidperoksidasjon og protein karbonylering ( markører for oksidativt stress), påfølgende DNA-fragmentering og apoptose ble observert på grunn av kalsitriol-Cu (II) interaksjon. Hydroksylradikaler, hydrogenperoksid og superoksid anioner mediere oksidativt stress som produseres i løpet av denne interaksjon. Blant cellulære redoks aktive metaller, ble kobber funnet å være ansvarlig for denne reaksjonen.
Konklusjon
Dette er den første rapporten impliserer Cu (II) og kalsitriol samhandling som årsak til selektive cytotoksiske virkningen av kalsitriol mot ondartede celler. Vi viser at denne interaksjonen fører til fremstilling av oksidativt stress på grunn av frie radikaler og påfølgende DNA-fragmentering, noe som fører til apoptose. En antatt mekanisme er presentert for å forklare denne biologiske effekten
Citation. Rizvi A, Hasan SS, Naseem I (2013) Selektiv cytotoksisk effekt og DNA Damage av Calcitriol-Cu (II) Samspill: Antatte Mechanism of Cancer Prevention . PLoS ONE 8 (9): e76191. doi: 10,1371 /journal.pone.0076191
Redaktør: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, USA
mottatt: 9. juni 2013, Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 27.09.2013
Copyright: © 2013 Rizvi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AR mottatt en UGC-csir Junior Stipendiat fra regjeringen i India. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vitamin D
3 er hentet fra mat (befestede meieriprodukter og fiskeoljer) eller dannes i huden fra 7-dehydrokolesterol av ultrafiolett bestråling. I leveren, vitamin D
3 blir hydroksylert i C-25 ved vitamin D-25-hydroksylase eller cytokrom P450 og danner 25-hydroksyvitamin D
3 (25 (OH) D
3). 25 (OH) D
3 blir så transportert til nyrene der i den proksimale nyretubuli er det hydroksylerte ved C-1 som resulterer i dannelsen av hormonelt aktiv fra vitamin D, 1,25-dihydroksyvitamin D
3 (1,25 (OH)
2D
3) eller kalsitriol, som er et essensielt næringsstoff som medierer en rekke metabolske prosesser [1]. Forskjellige linjer av bevis basert på farmakologien og
in vivo
dyremodellstudier viser at kalsitriol er et anti-cancer middel
in vivo product: [2], som virker ved å initiere apoptose og inhibering av veksten av flere ondartede cellelinjer [3]. Epidemiologiske studier viser at mindre eksponering for sollys og derav følgende lavere nivåer av kalsitriol øker risikoen for kreft og mediere progresjon av mange kreftformer, som inkluderer kreft i bryst, eggstokk, tarm, øsofagus, endetarmen, bukspyttkjertelen og blod [4,5]. Et stort utvalg av maligne celler som reagerer på varierende nivåer av kalsitriol viser den utbredte rolle av kalsitriol i å mediere anti-kreft effekt. Men den nøyaktige mekanisme ved hvilken anti-kreft-effekter av kalsitriol er berørt er ukjent.
En av de karakteristiske trekk ved malignitet er høyden av kobbernivåer [6-8]. Kobber er et viktig metallion funnet å være assosiert med kromatin DNA, spesielt med guanin [9]. Det er kjent at i ondartede celler, kan kobberkonsentrasjoner være forhøyet to til fem ganger, sammenlignet med de som er rapportert i normale celler [10]. Selv om den nøyaktige årsaken til heving i kobbernivåer i løpet av malignitet er fortsatt uklart, økes angiogenese antatt å være en mulig årsak [11].
I denne studien foreslår en fysiologisk sammenheng mellom kalsitriol og kobber i ondartede celler vi. Vi beskriver en antatt, Cu (II) -indusert, fri-radikal-mediert reaksjonsvei, noe som forklarer den selektive cytotoksiske virkning av calcitriol mot maligne celler. For å illustrere kalsitriol aktivitet, har vi brukt en mobilsystemet av kalsitriol belastet lymfocytter (kolonner). Vi viser at kolonner, når de utsettes for Cu (II) -ioner til å simulere miljøet i en malign celle, gjennomgå oksydativ skade og DNA-brudd, noe som til slutt fører til celledød. Siden kalsitriol, en i det vesentlige hydrofob art, påvirker DNA, et sterkt polart molekyl, presenterer vi en hypotese for å forklare samspillet mellom calcitriol og DNA. Basert på mutagenese, biokjemiske og strukturrelaterte data [12-18], diskuterer vi muligheten for at vitamin D reseptor (VDR) fungerer som en «adapter protein» som formidler denne prosessen. Vi bruker den nylig belyst strukturen av VDR og dets bindingspartner RXR (retinsyre X reseptor) [19] for å forklare vår hypotese. Så langt vi kjenner til, er den nåværende forsknings den første rapporten som viser at Cu (II) spiller en rolle i kalsitriol-mediert celledød.
Materiale og metode
Kjemi
Alle kjemikalier og enzymer som ble anvendt ble oppnådd fra Sigma Aldrich (USA). Alle løsninger ble utarbeidet samme dag og brukes umiddelbart.
Etisk erklæringen for dyreforsøk
Animal eksperimenter ble tillatt av Miljøverndepartementet og skog, Government of India under registreringsnummer ingen 714/02 /a /CPCSEA utstedt av komiteen for hensikten med kontroll og tilsyn med dyreforsøk (CPCSEA) datert 16.11.2002 og godkjent av institusjonelle etiske komité av Avdeling for biokjemi, Aligarh muslimske universitet, Aligarh, India (Order no: DNo1).
Utarbeidelse av Calcitriol overbelastet lymfocytter (Cols)
Femten mannlige albinokaniner som veier 1 + 0,1 kg ble kjøpt og tilfeldig delt inn i tre grupper på fem kaniner hver. Kaninene ble holdt i individuelle stål bur, og opprettholdt på standard kanin Chow og vann, forutsatt
ad libitum
, med 12 timers lys og mørke sykluser ved 25 ° C. Dyrene ble akklimatisert i en måned før begynnelsen av forsøket. Dyrene i gruppe mottok en 200 ng /g kroppsvekt av cholecalciferol oppløst i 1 ml etanol, intraperitonealt hver dag i en periode på to uker. Dyr i gruppe to fikk intraperitoneal injeksjon av 1 ml etanol (kjøretøykontroll) og dyrene i gruppe tre fungerte som kontroller. Etter to uker ble dyrene avlivet, og blodet ble oppsamlet i hepariniserte rør og fortynnet i ione-fritt fosfatbuffret saltvann (pH 7,0). Lymfocytter ble isolert ved anvendelse av Histopaque 1077 og cellene ble suspendert i RPMI 1640. nylig isolerte lymfocytter ble anvendt for alle forsøk.
Bestemmelse av intracellulær Calcitriol nivåer i kolonner
Isolerte lymfocytter ble lysert og celle lysatet ble ytterligere benyttet for å bestemme nivåer av kalsitriol, ved hjelp av en USCN og Life Sciences Inc. (Huston, Texas, USA) sett i overensstemmelse med produsentens instruksjoner.
Behandling av lymfocytter
Lymfocyttene ble suspendert i et totalt volum på 3 ml PBS og inkubert i nærvær av Cu (II) (25 uM) i 2 timer. Reaksjonen ble også utført i nærvær av spesifikke metallion-chelatorer. Desferoxamine (50 uM) ble anvendt for å chelatere Fe (II) -ioner, histidin (50 uM) ble anvendt for å chelatere Zn (II) og bathocuprione og neucuprione (50 mM hver) ble anvendt for å chelat ekstracellulær og intracellulær Cu (II) -ioner. Fri radikalutvaskere (katalase 20 ug /ml, superoksid dismutase (SOD) 20 ug /ml, og tiourinstoff 0,1 mM) ble anvendt i et separat sett av reaksjoner; for å implisere rolle ROS i Cu (II) -mediert oksidativt stress. Et likt antall lymfocytter (1 x 10
8 + 10
3) ble anvendt i alle forsøk.
Cu (II) indusert lipidperoksidasjon i kolonner
tiobarbitursyre-reaktive substanser (TBARS) ble estimert i lymfocytter ved metoden ifølge Ramanathan et al. [20], med mindre modifikasjoner. Til 1,5 ml reaksjonsblanding, 0,5 ml 10% TCA (trikloreddiksyre) og 0,5 ml av 0,6 M TBA (2-tiobarbitursyre) ble tilsatt og blandingen ble inkubert i et kokende vannbad i 20 minutter. Absorbansen ble avlest ved 532 nm og konvertert til nano-mol TBA reaktive stoffer ved hjelp av den molare ekstinksjonskoeffisient.
Cu (II) indusert protein karbonylering i Cols
Behandlet lymfocytter ble lysert og mengden av karbonylgrupper som ble dannet ble bestemt [21]. En ml reaksjonsblandingen etter behandling ble blandet med 0,5 ml av 10 mM 2,4-dinitrofenylhydrazin i 2,5 M HCl. Blandingen fikk stå i 1 time ved romtemperatur og 0,5 ml 20% trikloreddiksyre ble tilsatt til røret. Røret ble etterlatt i en bøtte is i 10 minutter fulgt av sentrifugering ved 12.000 x g i 15 min. Supernatanten ble kastet, og proteinet pelleten ble vasket med etanol /etylacetat (1: 1 v /v) og oppløst i 2 ml 6 M guanidin (pH 2,3) og vortex-blandet. Karbonyl innholdet ble beregnet ved hjelp av den molare absorpsjonskoeffisienten av 22000 M
-1 cm
-1
Comet, Assay (enkelt celle Alkaline Gel elektroforese) av Cols
Comet assay ble utført ved anvendelse av fremgangsmåten som anvendes ved Singh et al. [22], med mindre modifikasjoner. Fullt frostede lysbilder ble forbelagt med 1,0% normal smelting agarose. Lymfocytter ble blandet med 90 ul av 1,0% lavt smeltepunkt agarose for å danne en cellesuspensjon og pipettert over det første lag og dekket med et dekkglass. Platene ble plassert på kjøleelementer i 10 minutter for å størkne agarose. Objektglassene ble forsiktig fjernet, og et tredje lag av 0,5% lavt smeltepunkt agarose ble pipettert. Glassene ble dekket med dekkglass og ble plassert på isposer å stivne. De dekkglass ble deretter fjernet og skinnene ble nedsenket i iskald lyseringsbuffer i en time. Etter at lysering, ble DNA lov til å slappe av i alkalisk elektroforetiske oppløsning (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 13). Elektroforese ble utført ved 4 ° C, i en feltstyrke på 0,7 V /cm og 300 mA. Glassene ble nøytralisert med iskaldt 400 mM Tris (pH 7,5), og farget med 75 ul etidiumbromid (20 mg /ml) og dekket med et dekkglass. Lysbilder ble scoret ved hjelp av et bilde analysesystem (Komet 5.5, Kinetic Imaging, Liverpool, UK) festet til en Olympus (CX41) fluorescerende mikroskop (Olympus Optical Co, Tokyo, Japan) og en COHU 4910 integrert CC kamera (utstyrt med 510-560 nm eksitasjon og 590 nm barriere filtre) (COHU, San Diego, CA, USA). Bilder av 25 celler ble analysert fra hvert tre eksemplarer lysbilde. Hale lengde (migrasjon av DNA fra kjernen i μmeters) var den parameteren brukes til å asses DNA-skader.
Cu (II) indusert apoptose i Cols
Behandlet lymfocytter ble smurt på en ren, etanol sterilisert glass slide, og ble farget med Leishmans flekken. Apoptotiske celler ble visuelt scoret i tre tilfeldig valgte visuelle felt i henhold til kriteriene for Hasan et al. [23] med en Nikon kikkert sammensatt mikroskop.
Statistisk analyse
Verdiene uttrykkes som gjennomsnitt + SEM fra tre uavhengige forsøk. Data ble analysert ved Tukey test etter en enveis analyse av varians (ANOVA) ved anvendelse av GraphPad Prism 5,01 (California, USA). Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved P 0.05
Resultater
Cellular modell for å studere ex-vivo interaksjons av kalsitriol og kobber
Som nevnt ovenfor kalsitriol er kjent for å formidle anti-kreft effekt. Det har blitt rapportert at Cu (II) er også signifikant forhøyet i ondartede celler. For å studere effektene av kalsitriol-Cu (II) interaksjon, har vi utviklet et modellsystem basert på lymfocytter. Calcitriol overbelastning av lymfocytter ble oppnådd via intraperitoneal injeksjon av calcitriol-forløper kolekalciferol, som gjennomgikk omdannelse til kalsitriol, inne i dyret system. Etter kolekalciferol injeksjon, ble det observert at Calcitriol nivåer i isolerte lymfocytter ble forhøyet med 25,52% (figur 1). Cu (II) nivåer ble økt med
in vitro
tilskudd av isolerte, Cols med Cu (II). Analyser for lipidperoksidasjon, protein karbonylering og DNA-skade som en følge av kalsitriol-Cu (II) interaksjon ble utført på den isolerte lymfocytt-systemet.
Nivåer av kalsitriol i kalsitriol belastet lymfocytt (kolonner) lysater og kontroll lymfocytter. Verdier uttrykt som gjennomsnitt + SEM (n = 3) * P. 0,001 i forhold til kontroll og kjøretøy kontroll
Cu (II) indusert lipidperoksidasjon i Cols
Calcitriol har vist seg å føre oksidativt stress. En av konsekvensene av oksidativt stress er peroxidation av cellulære lipider [20]. Derfor ble lipidperoksydasjon anvendt som en markør for å vurdere oksidativt stress som en funksjon av kalsitriol nivåer. Høyde i Calcitriol nivåer førte ikke til betydelige lipidperoksidasjon i Cols (figur 2). Imidlertid eksponering av kolonner for Cu (II) -ioner førte til en markert økning i lipid-peroksydasjon (figur 2). For å bestemme om lipidperoksidasjon er en Cu (II) -spesifikk virkning, eller hvis andre redoks-aktive divalente metallioner, så som Fe (II) og Zn (II) medierer lipidperoksidasjon i nærvær av kalsitriol, chelatorer av Fe (II ) og Zn (II) -ioner (desferoxamine og histidin, henholdsvis) ble tilsatt til isolerte kolonner. Det ble observert at fjerning av Fe (II) og Zn (II) ikke forårsaker signifikant inhibering av lipidperoxidasjon (figur 2). Som en kontroll, ble chelatorer av Cu (II) innføres for å teste den spesifikke rollen til Cu (II) i å forårsake oksidativt stress i kolonner. Det ble observert at signifikant inhibering av lipidperoxidasjon ble oppnådd ved fjerning av Cu (II) (figur 2). For å identifisere plasseringen av Cu (II) basseng (intracellulær versus ekstracellulære) som formidler lipidperoksydering, er effekten av Cu (II) chelatorer med forskjellige permeabiliteter membran ble testet på lipidperoksidasjon i isolerte kolonner. Det er viktig å merke seg at bathocuprione, som er en membran-ugjennomtrengelig Cu (II) chelator, ikke hemme lipidperoksydasjon så effektivt som neucuprione, en membran-gjennomtrengelige kobber chelateringsmiddel (figur 2). Det er antydet at det intracellulære lageret av Cu (II) medierer lipidperoksidasjon gjennom interaksjoner med kalsitriol. Det ble observert at eksogent tilsatt Cu (II) i kontroll (losses lymfocytter) induserte ikke signifikant lipidperoksidasjon (figur 2). Som peroxidation er forårsaket av aktiviteten til agenter for oksidativ skade, ble frie radikaler (SOD, katalase og thiourea) som brukes for å fastslå identiteten til de frie radikaler som er involvert i Cu (II) -calcitriol indusert oksidasjon hendelser. Effektiv inhibering av Cu (II) indusert lipidperoksidasjon i isolerte kolonner ble observert med SOD, katalase og tiourea (figur 2). Det antydes at superoksid anion, hydrogenperoksid og hydroksyl radikaler, ryddet vekk henholdsvis SOD, katalase og tiourea, megle Cu (II) indusert lipidperoksidasjon.
(A) Spenning (B) Kjøretøy kontroll (C ) Cu (II) (25 pm) [tilsatt til ikke kalsitriol lastet, kontroll-lymfocytter] (D) Calcitriol overbelastning (E) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) (F) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Bathocuprione (50 uM) (membran ugjennomtrengelig Cu (II) chelator) (G) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Neucuprione (50 uM) (membran som er gjennomtrengelig Cu (II) chelator) (H) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Desferoxamine (50 uM) (Fe (II) chelator) (I) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + histidin (50 uM) (Zn (II) chelator) (J) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + SOD (20 ug /ml) (K) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Katalase (20 ug /ml) (L) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Tiourea (0,1 mM). Verdier uttrykt som middel + SEM (n = 3). P 0,05 sammenlignet med kontroll og kolonner med Cu (II) (25 pm). Alle inkubasjoner ble utført i 2 timer ved 37º C.
Cu (II) indusert protein karbonylering i Cols
Protein karbonyleringsprosess er en konsekvens av oksidativt stress og samspillet av frie radikaler med aminosyre-sidekjeder. Således protein karbonylering tjener som en markør for oksidativt stress som oppdages av et biologisk system. Utsette kolonner til Cu (II) -ioner ga en markert økning i den totale protein karbonylering. Chelaterende intracellulær Zn (II) og Fe (II) ikke å påvirke protein karbonylering mens chelaterende Cu (II) fra systemet resulterte i en markert reduksjon i det totale karbonyl-innhold. Tilstedeværelsen av fri radikalutvaskere (SOD, katalase og tiourinstoff) i systemet resulterte i en markert reduksjon i det totale proteininnhold karbonyl (figur 3).
(A) Spenning (B) Kjøretøy kontroll (C) Cu (II) (25 pm) [tilsatt til ikke kalsitriol lastet, kontroll-lymfocytter] (D) Calcitriol overbelastning (E) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) (F) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Bathocuprione (50 uM) (membran ugjennomtrengelig Cu (II) chelator) (G) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Neucuprione (50 uM) (membran som er gjennomtrengelig Cu (II) chelator) (H) Calcitriol overbelastning + Cu (II) ( 25 pm) + Desferoxamine (50 uM) (Fe (II) chelator) (I) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + histidin (50 uM) (Zn (II) chelator) (J Calcitriol overbelastning) + Cu (II) ( 25 pm) + SOD (20 ug /ml) (K) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Katalase (20 ug /ml) (L) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Tiourea (0,1 mM). Verdier uttrykt som middel + SEM (n = 3). P 0,05 sammenlignet med kontroll og kolonner med Cu (II) (25 pm). Alle inkubasjoner ble utført i 2 timer ved 37º C.
Cu (II) indusert cellulær DNA-skader i Cols
Generering av frie radikaler som forårsaker DNA-skade, noe som fører til apoptose [ ,,,0],24]. Én av egenskapene til apoptose er brudd i DNA i fragmenter, som blir detektert av en komet assay. Det ble observert at kalsitriol overbelastning i lymfocytter resulterte i DNA-skade, som ble betydelig forbedret ved inkubasjon av kolonner med Cu (II) (figur 4A, 4D). For ytterligere å bestemme spesifisiteten av Cu (II) i mediering av DNA-skade, ble den membran som er gjennomtrengelig Cu (II) -chelator neucuprione utnyttet. Inkubasjon av isolerte kolonner med neucuprione betydelig hemmet DNA-skader, implicating intracellulær Cu (II) som deltaker i kalsitriol-mediert DNA-skader (figur 4B, 4D). Involvering av andre toverdige kationer i kalsitriol-mediert DNA-skader i lymfocytter ble testet med desferoxamine og histidin, som ikke hemmer DNA-skade, utelukker involvering av Fe (II) og Zn (II) i prosessen (figur 4B, 4D ). Inhibering av DNA-skade ved SOD, katalase og tiourea innebærer at DNA-skade er forårsaket av superoksid anion, hydrogenperoksyd og hydroksylradikaler (figur 4C, 4D).
(A) DNA-skade i kontroll lymfocytter, vehikkelkontroll lymfocytter, kolonner og kolonner med Cu (II) (25 mikrometer). Verdier uttrykt som middel + SEM (n = 3) ** P 0.001as i forhold til kontroll og kjøretøy kontroll, P 0.001 når * og ** sammenlignes). (B) fjerning av Cu (II) og DNA-skade. Kolonner med Cu (II) (25 pm) + neucuprione (Neo) (50 uM) (membran som er gjennomtrengelig Cu (II) chelator), desferroxamine (Desf) (50 uM) (Fe (II) chelator), histidin (His) (50 uM) ( Zn (II) chelator) Verdier uttrykt som middel + SEM (n = 3) * P 0,001 sammenlignet med kontroll og kolonner med Cu (II) (25 pm). (C) kolonner med Cu (II) (25 pm) ble inkubert sammen med superoksid dismutase (SOD) (20 ug /ml), katalase (CAT) (20 ug /ml) og tiourea (Thio) (0,1 mM) Verdier uttrykt som middelverdi + SEM (n = 3). (D) Representative bilder av Comet Assay (1) Kontroll (2) Kjøretøy Kontroll (3) Cols (4) Cols + Cu (II) (25 pm) (5) Cols + Cu (II) (25 pm) + Neo (50 uM) (6) kolonner + Cu (II) (25 pm) + Desf (50 uM) (7) kolonner + Cu (II) (25 pm) + sin (50 uM) (8) kolonner + Cu (II) (25 pm) + SOD (20 ug /ml) (9) kolonner + Cu (II) (25 pm) + Cat (20 ug /ml) (10) kolonner + Cu (II) (25 pm) + Thio (0,1 mM). * P 0,001 sammenlignet med kontroll og kolonner med Cu (II) (25 pm). Alle inkubasjoner ble utført i 2 timer ved 37º C.
Cu (II) indusert apoptose i kolonner
Apoptose er karakterisert ved morfologiske endringer innenfor cellen. Kjerner av apoptotiske celler er karakterisert ved dannelse av distinkte apoptotiske legemer og kjerne fragmentering. Eksponering av kolonner til Cu (II) -ioner resultert i en markert økning i antallet av apoptotiske celler. Fjernelse av kobber fra systemet reduseres det totale antall apoptotiske celler, mens chelatering av andre redoks-aktive divalente metallioner (Zn (II) og Cu (II)) hadde ingen betydelig innvirkning apoptose. Fri radikalutvaskere hell redusert antall av apoptotiske celler og derved tydelig implicating rollen av reaktive oksygenarter i Cu (II) induserte apoptose av kolonner (figur 5).
(A) Kjøretøy kontroll Kontroll (B) (C ) Cu (II) (25 pm) [tilsatt til ikke kalsitriol lastet, kontroll-lymfocytter] (D) Calcitriol overbelastning (E) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) (F) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Bathocuprione (50 uM) (membran ugjennomtrengelig Cu (II) chelator) (G) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Neucuprione (50 uM) (membran som er gjennomtrengelig Cu (II) chelator) (H) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Desferoxamine (50 uM) (Fe (II) chelator) (I) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + histidin (50 uM) (Zn (II) chelator) (J) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + SOD (20 ug /ml) (K) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Katalase (20 ug /ml) (L) Calcitriol overbelastning + Cu (II) (25 pm) + Tiourea (0,1 mM). Verdier uttrykt som middel + SEM (n = 3). P 0,05 sammenlignet med kontroll og kolonner med Cu (II) (25 pm). Alle inkubasjoner ble utført i 2 timer ved 37º C.
Diskusjoner
I denne studien, gir vi foreløpige bevis for at kalsitriol-Cu (II) samhandling er viktig i forårsaker DNA-skade , som kan føre til apoptose. Siden det er blitt vist at Cu (II) er til stede bundet til genomisk DNA [9], og det er hevet i maligne celler [6-8], Cu (II) ble testet som kandidat metall for å aktivere kalsitriol kjemi.
som er beskrevet her studiene teste rollen av kalsitriol-Cu (II) interaksjon på lipidperoksydering, protein karbonylering og DNA-skade, tre indikatorer for oksidativt stress og påfølgende apoptose. For pro-oksydant aktivitet, er dannelse av reaktive oksygenforbindelser, fra kalsitriol nødvendig. Flere pro-apoptotiske narkotika [25,26], plante avledet molekyler [24,27] og vitamin C [28], handle for å skade DNA av metall ion mediert Fenton kjemi.
Vi foreslår en antatt mekanisme ( Figur 6 A) ved hvilken kalsitriol kan interagere med DNA bundet Cu (II) til å utøve sine pro-oksiderende effekt. Metylengruppen av kalsitriol aksepterer et elektron fra Cu (II) og av en rekke dobbeltbinding rearrangementer og autolyse av vann danner hydroksylradikaler. Disse hydroksyradikaler kan enten kombineres med hverandre og føre til produksjon av hydrogenperoksyd eller kan alternativt samvirke med Cu (I) og føre til produksjon av Cu (II), for derved å etablere et redoks-syklus.
( A) Fremstilling av hydroksylgruppene radikaler, superoksyd-anioner og hydrogenperoksyd fører til DNA-skade, og følgelig celledød. (B) Hetero-dimer av VDR (grønn) og RXR (oransje) som viser avstand mellom calcitriol bindingssetet og bundet DNA. Øvre panel: Vis normal til aksen av bundet DNA. Nedre panel: Se langs aksen av bundet DNA. Calcitriol (mørk grønn staver og kuler) bundet til VDR, utgjør den frie radikaler produksjonssted, blir separert fra DNA-molekylet ved ~ 39 Å. For referanse, er retinsyre bundet til RXR også vist. Den dobbelt-trådet DNA-molekyl er vist som tynne sorte /blå pinner. Avstandsmålinger og figur forberedelse ble utført i PyMol (www.pymol.org) ved hjelp av koordinater av VDR /RXR hetero-dimer [Orlov et al. EMBO J. 2012] vennlig levert av B. Klaholz.
Hydrogenperoksid gang dannet, kan videre reagere med Cu (II) som fører til homolytisk /hetrolytic sammenbrudd, som danner enda mer hydroksylradikaler, og Cu (II) er redusert til Cu (i). Alternativt superoksid anion kunne reagere med vann og danne enda mer hydrogenperoksyd.
Siden intracellulær kobber er bundet til DNA, og kalsitriol er kjent for å gå inn i kjernen, produksjon av frie radikaler og hydrogenperoksid ved den foreslåtte mekanisme, vil etter all sannsynlighet, finne sted i umiddelbar nærhet av DNA som fører til DNA-skade. Hydroksylradikaler synes å spille en viktig rolle i generering av oksidativt stress, ettersom tiourea, kan en potent scavenger av hydroksylradikaler forhindre både lipidperoksidasjon og DNA-skade betydelig. Det er også viktig å merke seg at den membran som er gjennomtrengelig Cu (II) chelator, neucuprione hemmer også lipidperoksidasjon, protein karbonylering, DNA-skade og apoptose, eventuelt ved chelatering, og dermed gjør det DNA bundet kobber utilgjengelig for reaksjon med kalsitriol.
for å utelukke involvering av de andre store redoks-aktive metaller som finnes i biologiske systemer, Fe (II) og Zn (II) ble testet. Forsøk med chelatorer av Fe (II) og Zn (II) førte ikke til inhibering av kalsitriol-mediert lipidperoksidasjon, protein karbonylering, DNA-skade og apoptose i kolonner. Det er derfor konkludert med at Cu (II) vekselvirker spesifikt med kalsitriol å mediere DNA-skade som fører til apoptose. Kalsitriol utledes for å spille en rolle i aktivering av apoptose i et Cu (II) rikt miljø, slik som det som observeres i ondartede celler, som kan virke som en forsvarsmekanisme for å kontrollere ondartet cellevekst.
Resultater beskrevne i denne studien gi innsikt i Calcitriol-Cu (II) -DNA interaksjoner. I denne forbindelse er det viktig å merke seg at kalsitriol, et hydrofobt molekyl som interagerer med Cu (II) og DNA, som begge er sterkt polar. Som et lipid derivat, Calcitriol partisjoner i lipidbilagene. I tilfelle av en direkte interaksjon mellom calcitriol og den polare arter, er det viktig at en adaptermolekyl bringer kalsitriol i nærheten av DNA og DNA bundet Cu (II). Et slikt molekyl er vitamin D-reseptor (VDR). Det er godt dokumentert at VDR lokaliseres i kjernen [29], og binder seg selektivt til både calcitriol og DNA. For effektiv oksidativ skade romlig nærhet mellom kalsitriol og DNA (sammen med bundne Cu (II) -ioner) er nødvendig. For det andre VDR knockout mus har vist seg å være ekstremt følsomme for kjemiske karsinogener. Innen 60 dager etter eksponering, 88% av VDR null mus eksponert for den kjemiske kreftfremkallende DMBA utviklet kreft [30]. VDR null mus har vist seg å være meget følsomme overfor kjemisk induserte lukemia og eksperimentelle VDR ablasjon fører til økt hud og melkekjertlene tumuroginesis [30] som angir en tydelig rolle av VDR i styring av prosessen for carcinogenesis. Det har blitt bevist at VDR uttrykk positivt korrelerer med svulst undertrykkelse [30]. En modell av den fulle lengde VDR struktur, i kombinasjon med bindingspartneren retinsyre-reseptor (RXR), er rapportert gjennom Cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) rekonstruksjon nylig [12]. Det er av betydning å merke seg at den VDR hengselregionen har vist seg å være fleksibel, og denne fleksibiliteten er avgjørende for funksjonen til full-lengde polypeptidet [13-16]. Calcitriol molekyl er funnet å være atskilt fra det bundne DNA-molekylet ved en avstand på ca. 39 Å i VDR struktur (figur 6B). Vi hypoteser at VDR molekylet kan gjennomgå en konformasjonsendring langs hengsel, figur 6B (øvre panel), som bringer det bundne DNA i nærheten av kalsitriol [18].
Det faktum at kalsitriol er en proxidant i maligne celler er blitt demonstrert ved Koren et al. [31], som viste at i MCF-7 cellelinje, glutation nivåene øker ved eksponering til kalsitriol, som er en indikator på øket ROS generasjon. Narvaez og Welsh [32] har vist at kalsitriol induceded apoptose av maligne celler er avhengig av frie radikaler generasjon. Den satsing av maligne celler til kalsitriol-mediert apoptose ble vist å være caspase-uavhengig, noe som indikerer at kalsitriol-mediert apoptose av maligne celler er utført av ikke-klassiske reaksjonsveier. Vår non enzymatisk, kobber indusert, ROS mediert mekanisme som fører til uopprettelig DNA-fragmentering kan være en av flere faktorer som bidrar til apoptotisk død av ondartede celler ved eksponering for kalsitriol.
Takk
SSH takker Purdue University for anlegg. Forfatterne er takknemlige til professor M. Mushfiq og Dr. Saltanat Raza av Institutt for kjemi, AMU, som hjalp trene reaksjonsmekanismen. AR ønsker å takk Khursid Alam Khan (Dept of Wildlife Sciences, AMU) for sin støtte, mens dette arbeidet pågikk. Professor Bruno Klaholz av IGBMC (Frankrike) gitt koordinatene som brukes til å generere strukturen av VDR.
