Abstract
Bakgrunn
mikroRNA-200 familien deltar i vedlikehold av en epitelial fenotype og tap av dens uttrykk kan gi epitelial til mesenchymale overgang (EMT). Videre er tapet av ekspresjon av MIR-200 familiemedlemmer bundet til en aggressiv cancer fenotype. Regulering av MIR-200 familie uttrykk i normale celler og kreftceller er ikke fullt ut forstått.
metodikk /hovedfunnene
epigenetiske mekanismer delta i kontrollen av MIR-200c og Mir-141 uttrykk i både normale og kreftceller. En CpG øy nær spådd mir-200c /mir-141 transkripsjon start stedet viser en slående korrelasjon mellom MIR-200c og Mir-141 uttrykk og DNA metylering i både normale celler og kreftceller, som bestemmes av MassARRAY teknologi. CPG Øya er unmethylated i menneskelig MIR-200 /MIR-141 uttrykker epitelceller og i MIR-200C /MIR-141 positive tumorceller. CPG Øya er tungt denaturert i menneskelig MIR-200C /MIR-141 negative fibroblaster og MIR-200C /MIR-141 negative tumorceller. Museceller viser en lignende invers korrelasjon mellom DNA metylering og MIR-200c uttrykk. Anriking av givende histonmodifikasjonene, H3 acetylering og H3K4 trimethylation, er sett i normal MIR-200C /MIR-141-positive epitelceller, som bestemmes av kromatin immunoprecipitation koblet til real-time PCR. I kontrast, undertrykkende H3K9 dimetylering merker er til stede i normal MIR-200C /MIR-141-negative fibroblaster og MIR-200c /MIR-141 negative kreftceller og givende histonmodifikasjonene er fraværende. Den epigenetisk modifier narkotika, 5-aza-2′-deoxycytidine, reaktiverer MIR-200c /MIR-141 uttrykk som viser at epigenetiske mekanismer spiller en funksjonell rolle i deres transkripsjonen kontroll.
Konklusjon /Betydning
Vi rapporterer at DNA-metylering spiller en rolle i normal celletype-spesifikk ekspresjon av MIR-200c og MIR-141, og denne rollen vises evolusjonært konservert, siden lignende resultater ble oppnådd i mus. Avvikende DNA metylering av Mir-200c /141 CpG island er nært knyttet til deres upassende stanse i kreftceller. Siden MIR-200c klynge spiller en betydelig rolle i EMT, tyder våre resultater en viktig rolle for DNA metylering i kontroll av fenotypiske konverteringer i normale celler
Citation. Vrba L, Jensen TJ, Garbe JC, Heimark RL, Cress AE, Dickinson S, et al. (2010) Rolle for DNA Metylering i forskrift av MIR-200c og Mir-141 uttrykk i normale celler og kreftceller. PLoS ONE 5 (1): e8697. doi: 10,1371 /journal.pone.0008697
Redaktør: Catherine M. Suter, Victor Chang Cardiac Research Institute, Australia
mottatt: 13. oktober 2009: Godkjent: 21 desember 2009; Publisert: 13 januar 2010
Copyright: © 2010 Vrba et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Grants R01CA65662 til BWF støttet dette arbeidet. Senter Grants P30ES06694 og P30CA023074, og BIO5 tverrfaglig bioteknologi senteret på UA støttet Genomics Shared Service. J.C.G. og M.R.S. ble støttet av NIH U54 CA112970, DOD BCRP BC060444, og Office of Energy Research, Office of Health and Biological Research, USA Department of Energy under kontrakt DE-AC03-76SF00098. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mirnas er single-strandet, 20-24 nt lange RNA som regulerer genekspresjon på posttranskripsjonelt nivå. mirnas ofte målrette 3 «UTR av mRNA, og siden miRNA mål motivene ikke krever fullstendig homologi, kan hundrevis av mRNA mål eksisterer for hver miRNA. Nåværende anslag er at det er nesten 900 unike mirnas kodet i det menneskelige genom, og disse mirnas kontroll, delvis, uttrykk for mer enn en tredjedel av menneskets gener [1]. En rekke miRNA dysregulerte i human cancer har vist seg å ha onkogen eller tumorundertrykkende aktivitet [2], [3], [4]. Disse inkluderer miRNA arter som viser celletype spesifikke mønstre av uttrykk, hvorav noen er viktig i vedlikehold av cellen identitet [5], [6]. Disse typer miRNA er førsteklasses mål for epigenetisk kontroll, og tidlige studier av miRNA kontroll støtte denne muligheten [7], [8].
MIR-200c og MIR-141 er medlemmer av MIR-200 familie og er viktige regulatorer av den epiteliale til mesenchymal overgang (EMT) [5], [9], [10], [11]. I tillegg til rollen som MIR-200c og MIR-141 i den fenotypiske omdannelsen av normale celler, feilregulering av normale mønstre av MIR-200c ekspresjon forekommer i flere typer kreftceller og er knyttet til tumorprogresjon [2], [6] , [12], [13], [14], [15]. Mekanismen som er ansvarlig for kontroll av MIR-200c-ekspresjon i både normale celler og kreftceller er ikke fullt ut forstått. I denne studien, viser vi at epigenetisk staten er nært knyttet til normal celletype bestemt uttrykk for MIR-200c og MIR-141, og dette epigenetisk tilstanden er dysregulerte i carcinoma celler, der tap av miR200c /141 uttrykk er knyttet til avvikende DNA metylering og histonmodifikasjonene. Til slutt fant vi at MIR-200c regulering av DNA metylering er evolusjonært konservert mellom mennesker og mus. Siden MIR-200c spiller en betydelig rolle i EMT, våre resultater tyder på at DNA metylering spiller en viktig rolle i kontrollen av fenotypiske konverteringer av normale celler og kreftceller.
Diskusjon
Mir
Resultater og -200 familie består av fem mirnas som er kodet innen to klynger. Hvert cluster koder et polycistronic genet. En klynge ligger på menneskets kromosom 1 og koder MIR-200b, MIR-200A, og MIR-429, mens den andre klyngen ligger på menneskelig kromosom 12, og koder MIR-200c og MIR-141. Våre små RNA bibliotek sekvense data (figur 1A) viser at MIR-200 familien er sterkt uttrykt i dyrkede normale menneskelige mammary epitelceller (HMEC) avledet fra tre forskjellige individer, mens isogene menneskelige mammary fibroblast celler (FB) mangler MIR-200 familieuttrykk (figur 1A). Det er tydelig fra de små RNA-biblioteket sekvenseringsdata (figur 1A) at de høyt uttrykte medlemmer av MIR-200 familie i HMEC er MIR-200c og MIR-141. Vi bekreftet ekspresjon av MIR-200c og MIR-141 i det samme sett av normale melkeprøver til real-time PCR, og deretter ekspandert disse resultatene til parene av epitelceller og fibroblaster fra prostata og hud, så vel (figur 1B, figur S1). I alle tilfeller, MIR-200c og MIR-141 ble sterkt uttrykt i epitelceller, men ble ikke uttrykt i fibroblaster.
A. MIR-200 familie uttrykk i henhold til massiv parallell sekvensering av små RNA bibliotekene fra et sett med tre isogene par av menneskelige mammary epitelceller (HMEC) og fibroblaster (FB). Ekspresjon av den mir-200b-200a-429 klynge lokalisert på humant kromosom 1, og ekspresjon av mir-200c-141 klynge lokalisert på det humane kromosom 12 er vist. Med gjennomsnittet av tellinger 63,829 ut fra 3.926.984 per bibliotek i HMEC danner MIR-200c 1,625% av alle små RNAer i disse cellene. B. Real-time PCR vurdering av MIR-200c uttrykk i normale celletyper. Det venstre panelet viser uttrykket av MIR-200c i de samme prøvene som panel A. Høyre panel viser uttrykk for MIR-200c i menneskelig prostata epitelceller (PREC), prostata stromal fibroblaster (PSF), menneskelig hud keratinocytter (Kcytes) og hud fibroblaster (HFF). Dataene er normalisert i forhold til la-7a, som uttrykkes ved ekvivalente nivåer mellom forskjellige prøver i henhold til de små RNA-sekvenseringsdata. Real time PCR-analyse av Mir-141 uttrykk i disse prøvene er gitt i Figur S1.
mir-200c hårnål kodende sekvens og ca 300 bp av oppstrøms genomisk sekvens er CpG rik. Ifølge våre beregninger ved hjelp av programmet CpG Cluster [16] denne regionen er en svært statistisk signifikant CpG klynge (figur 2A). Dette CpG klynge (lengde 334 bp, GC% 68,56, O /E ratio 0,58, 21CpGs, p-verdi 8,44 × 10
-11) har egenskapene nær en CpG island definisjon basert på størrelse, GC innhold og CpG dinucleotide frekvens [17], så vel som dens plassering i forhold til transkripsjonsenheten [18]. I tillegg er denne regionen anses som et CpG øy basert på en nylig publisert probabilistisk definisjon [19]. Vi analyserte denne regionen som et mulig mål for epigenetisk kontroll.
A. Et diagram av den genomiske region av HSA-mir-200c. Den øverste linjen viser spesifikke fragmenter analysert ved MassARRAY. De røde fragmenter navngitt med CpG nettsider indikere fragmentene som DNA metylering data ble innhentet. Disse dataene er presentert panel B. Under dette er området analysert ved MassARRAY i forhold til det genomiske plassering (i blått), fulgt av området for real-time PCR-amplikon for kromatin immunoutfellingsanalyse (chip), og CpG øy identifisert av programmet CpGcluster. Regionene som koder for mir-200c og mir-141 hårnåler og den antatte transkripsjon start (TSS) region utledes fra den menneskelige EST orden på UCSC genom nettleser vises, og hver sirkel på dette sporet representerer posisjonen til en CpG dinucleotide. Det hersker nederst viser hvor på menneskelig kromosom 12 i henhold til menneskelige genom montering hg18. B. Oppsummering av 5-metylcytosin nivåene erholdt ved MassARRAY analyse av HSA-mir-200c CpG øy i prøvene karakterisert i figur 1B. Y-aksen viser prosent av cytosin metylering innenfor de enkelte CpG-enheter som er merket med x-aksen. CPG enheter i MassARRAY amplicon er nummerert i motsatt retning, med CpG 2 blir plassert innenfor MIR-200c kodende sekvens.
epigenetisk tilstanden i MIR-200c /141 CpG island viser klart og omfattende celletypespesifikke forskjeller mellom normale MIR-200C /141-positive og MIR-200c /141-negative celler. Vi brukte MassARRAY teknologi for å analysere DNA metylering tilstanden i mir-200c klynge CpG island (figur 2B). Resultatene viser at CpG nettsteder er unmethylated i tre separate stammer av MIR-200c /MIR-141-positive HMEC. I kontrast er alle CpG områder høyt metylert i isogen MIR-200c /MIR-141-negative fibroblast stammer. Invers korrelasjon mellom miRNA ekspresjon og DNA-metylering strekker seg til andre MIR-200c /MIR-141-positive /negative par av normale celler, så som prostata epitelceller og hud keratinocytter, og deres mesenchymale celle type motparter, prostata og hud-fibroblaster. Dermed er unmethylated Mir-200c klynge CpG øy i normal MIR-200C /MIR-141-positive epitelceller, som samtidig er tett metylert i sammenkoblede normal MIR-200C /MIR-141-negative fibroblaster (Figur 1b, 2b, Figur S2).
MIR-200c og Mir-141 uttrykk er tapt i ulike typer kreftceller [5], [11], [20], [21], og vi forsøkte å finne ut om dette tapet uttrykks var knyttet til epigenetiske forandringer i MIR-200c /MIR-141 CpG island. Vi analyserte 11 brystkreftcellelinjer, og i hvert tilfelle ble MIR-200c og MIR-141 uttrykk nært knyttet til DNA-metylering tilstand av CpG øya (figur 3A, figur S3). Syv av brystkreftcellelinjer testet ekspress MIR-200c og MIR-141 og hver har en unmethylated mir-200c CpG island. De andre fire brystkreftcellelinjer testet uttrykker ikke MIR-200c og MIR-141 og viser en tett metylert mir-200c CpG island. Et lignende bilde avtegner med hensyn til prostata kreft celler. Vi viser to prostatakreft cellelinjer (PC3 og PC3 B1) der tap av MIR-200c og Mir-141 uttrykk er knyttet til avvikende DNA metylering av mir-200c /141 CpG island (figur 3B Figur S3), og to prostata kreft cellelinjer (LNCaP og DU145) som beholder MIR-200c /MIR-141 uttrykk og en unmethylated mir-200c /141 CpG island. Til sammen indikerer disse resultatene at kreftceller avledet fra normal MIR-200c /MIR-141-positive epitelceller kan gjenskape celletype-spesifikk DNA-metylering mønster av MIR-200c /141 CpG øy sett i normal MIR-200c /MIR-141 -negative cellene, og at det avvikende DNA-metylering av den miR200c /141 CpG øy i disse kreftceller er forbundet med dens transkripsjonelle stanse i karsinomceller.
A. MIR-200c uttrykk og mir-200c CpG island metylering i elleve brystkreftcellelinjer. B. MIR-200c uttrykk og mir-200c CpG island metylering i fire prostata kreft cellelinjer. Den øvre delen av hver figur viser uttrykk for MIR-200c i kreftprøver som registreres av real-time PCR, normalisert til la-7a. Den nederste panelet viser metylering nivået på mir-200c CpG island region i de samme kreftprøver. Nivået av metylering av individuelle CpG enheter i MassARRAY amplicon vises som et varmekart med lavest metylering i gult og det høyeste metylering i blått. Y-aksen markerer de enkelte CpG enheter.
For å demonstrere den funksjonelle betydningen av epigenetisk tilstanden i MIR-200c /mir-141 CpG øy i kreftceller, utsettes vi kreftceller til epigenetisk modifiserende middel og DNA-metyltransferase-inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin (5-ADC). Mir-200c /MIR-141-negativ brystkreft cellelinjer MDA-MB-231 og BT549 og prostatakreft cellelinje PC3 ble behandlet med tre mikrometer 5-AdC i 96 timer og MIR-200c /141 uttrykk ble vurdert av real- time PCR. Figur 4 viser fem-AdC reaktivert MIR-200c uttrykk i alle tre kreftcellelinjer. Nivået på MIR-200c økt 4,3 ganger i MDA-MB-231 (p-verdi = 0,0004), 6,4 ganger i BT549 (p-verdi = 0,0107) og 4,2 ganger hos PC3 celler (p-verdi = 0,0072) . En lignende reaktivering av Mir-141 uttrykk (p-verdi 0,01) ble også observert i disse kreftcellelinjer etter 5-AdC behandling (figur S4). Disse dataene antyder at epigenetiske mekanismer delta i upassende undertrykkelse av MIR-200c /MIR-141 uttrykk i kreftceller.
Celler ble behandlet med 3 mikrometer 5-aza-2′-deoxycytidine i 96 timer. Nivået på uttrykk for MIR-200c ble målt ved real-time PCR. Gjennomsnittet av 4 uavhengige utvalg vises, feil søylene viser standard målefeilen. Verdiene ble normalisert til ubehandlede kontroller (100%). Figur S4 viser fem-aza-2′-deoxycytidine-mediert aktivering av MIR-141 i de samme prøvene.
histone modifisering state of the mir-200c klynge CpG island viser også celletype spesifikke forskjeller som er nært knyttet til uttrykket staten MIR-200c /141 i normale celler og kreftceller. Figur 5 viser resultatene av kromatin immunoutfellinger koplet til kvantitativ real-time PCR-analyse som ble brukt for å undersøke den histone modifikasjon tilstanden til MIR-200c /141 CpG øy i normale celler og kreftceller. CPG øya mir-200c /141 i de tre ulike stammer av MIR-200c /MIR-141-positive HMEC eksisterer i en transcriptionally kompetent stat; det er beriket for transcriptionally givende modifikasjoner av histon H3 acetylering (H3Ac) og lysin 4 trimethylation (H3TriMeK4), mens transcriptionally undertrykkende histone mark av histon H3 lysin 9 dimetylering (H3DiMeK9) er underrepresentert (figur 5). I motsetning til i isogen MIR-200c /MIR-141-negative mammary fibroblaster givende histonmodifikasjonene er fraværende, og det undertrykkende H3 lysin 9 dimetylering merket er til stede (figur 5). Tilsvarende brystkreft cellelinjer som hadde mistet MIR-200c /141 uttrykk tapt histon H3 acetylering og K4 trimethylation og kjøpte en undertrykkende histone tilstand, beriket for H3 lysin 9 dimetylering mark (figur 5). Ingen anrikning av trimethylation av histon H3 lysin 27 ble påvist i MIR-200c /141 CpG øy i de analyserte prøvene (figur S5). Til sammen resultatene fra analysene av MIR-200c /141 uttrykk, DNA metylering, og histon modifikasjons stater over en rekke av normale og kreftcelletyper viser en nær sammenheng mellom uttrykk for mir-200c /141 og epigenetisk staten deres tilhørende CpG island.
Tillatte histone merkene representert ved acetylering av histon H3 (H3Ac) og trimethylation av lysin 4 av histon H3 (H3TriMeK4) samt den undertrykkende histone mark dimetylering av lysin 9 av histon H3 (H3diMeK9 ) ble analysert ved hjelp av kromatin immunoprecipitation koblet til real-time PCR av regionen beskrevet i figur 2A. HMEC prøvene er vist i grønt, er isogene FB prøver vises i rødt, og to MIR-200-negative brystkreftcellelinjer er i blått. Y-aksen viser fold berikelse av hver histone tegn over inngangs DNA i mir-200c CpG island.
Til slutt, vi søkt å finne ut om epigenetisk regulering av MIR-200c uttrykk i normale celler er konservert evolusjonært, resonnement at DNA metylering bundet kontroll av MIR-200c uttrykk på tvers av pattedyrarter vil gi ytterligere eksperimentell støtte for epigenetisk kontroll av celle-type spesifikke uttrykk for MIR-200c. Hele genomiske klynge innehold mir-200c og mir-141 er godt konservert mellom de humane og mus genom. I likhet med den menneskelige mir-200c /141 genomisk region, inneholder musen mir-200c /141 genomisk region også en CpG island (Figur 6A, lengde 325 bp, GC% 66,77, O /E ratio 0,58, 19 CPGs, p-verdi 1,06 × 10
-10). For å bedømme en mulig rolle for DNA-metylering i kontroll av MIR-200c /141 hos mus, CpG metylering og miRNA ekspresjon ble analysert i mus epitelceller (epidermis av SKH-1 mus og keratinocytt-cellelinjer 308 og 6R90) og musefibroblaster ( cellelinjer NIH 3T3, NIH 3T6, og NR6). En MassARRAY amplikon ble utviklet for å analysere DNA-metylering tilstanden i mus mir-200c /141 region homolog med den analysert i human (figur 6A). Påfallende lignende resultater for Mir-200c ble funnet mellom humane celler og museceller. Mus keratinocytter uttrykte betydelige nivåer av MIR-200c, mens musefibroblastere ikke uttrykke påvisbare nivåer av MIR-200c (figur 6B). DNA metylering analyse av MassARRAY avdekket at Mir-200c-positive keratinocytter viste minimal DNA metylering i mir-200c CpG island, mens MIR-200C-negative musefibroblastere viste omfattende DNA metylering av alle CpG områder i regionen (figur 6B) . Den betydelige bevaring i DNA-sekvensen, mønstre av celletype-spesifikk DNA-metylering, og de tilknyttede MIR-200C uttrykk mønstre mellom de humane og muse genomer, som er atskilt med 75 millioner år med evolusjon [22], gir bevis for at epigenetiske mekanismer spiller en funksjonell rolle i kontrollen av MIR-200c uttrykk.
A. Diagram av musen MMU-mir-200c genomisk intervall. Den øverste linjen viser området analysert av MassARRAY. Regionene som koder for de hårnåler av mir-200c og mir-141 og den antatte transkripsjon start (TSS) utledes fra musen EST sporet vises på UCSC genom nettleser vises, og hver sirkel på dette sporet representerer plasseringen av en CpG dinucleotide. I likhet med den menneskelige HSA-mir-200C, inneholder mus MMU-mir-200c et CpG island, identifisert av programmet CpG Cluster. Det hersker nederst viser hvor på musen kromosom 6 i henhold til genom montering MM9. Genene er kodet på (-) tråd. B. museceller viser en lignende celletype bestemt mønster i MIR-200c ekspresjon til menneskeceller, og dette uttrykket er knyttet til DNA-metylering tilstand av CpG øya. Det venstre panelet viser uttrykket av MIR-200c i mus epitelceller (308, 6R90, SKH-en epidermis) og mus fibroblast cellelinjer (NIH 3T3, NR6, NIH 3T6) som oppdages av real-time PCR. Høyre panel viser metylering nivået på mir-200c CpG island region i de samme muse prøvene. Nivået av metylering av individuelle CpG enheter i MassARRAY amplicon vises som et varmekart med lavest metylering i gult og det høyeste metylering i blått. X-aksen angir de enkelte CpG-enheter. CpG enheter innenfor MassARRAY amplicon er nummerert i motsatt retning, med CpG en blir plassert innenfor MIR-200c kodende sekvens.
I sammendraget, våre funn gir flere linjer med bevis for at epigenetiske mekanismer er involvert i regulering av MIR-200c /141 uttrykk i både normale celler og kreftceller. For det første er det et konsistent invers korrelasjon mellom ekspresjonssystemer og DNA-metylering tilstander i normale humane og musecelletyper, så vel som humane bryst og prostata cancercellelinjer. For det andre, forskjellige histone koder eksisterer mellom MIR-200c /141 uttrykke og ikke-uttrykke celler som nøyaktig gjenspeiler uttrykket og DNA metylering stater. Tredje, avlaster epigenetisk modifiserings 5-aza-2′-deoxycytidine undertrykkelse av MIR-200c /MIR-141 i kreftcellelinjer. For det fjerde, koblingen mellom DNA-metylering og uttrykk tilstander skjer på tvers pattedyrarter, siden det er sett i human og mus. Samlet utgjør disse funnene tyder på at MIR-200c /141 er et evolusjonært konserverte epigenetiske labile miRNA klynge.
feilregulering av MIR-200c og MIR-141 forekommer i flere krefttyper [5], [11], [ ,,,0],20], [21], [23], [24], [25], [26], og dette feilregulering innebærer et kompromiss av den epigenetisk tilstand av CpG øy forbundet med MIR-200 ° C og miR141. Resultatene tyder på at disse karcinomaceller kan ko-opt
de novo
DNA-metylering trasé som er involvert i epigenetisk kontroll av normale celletypespesifikke gener, slik som de som styrer epigenetisk tilstand av MIR-200c /MIR-141 . En lignende tilsynelatende co-alternativet celletype spesifikk DNA metylering trasé av kreftceller er også sett i proteinkodende gener, for eksempel
maspin Hotell og
14-3-3 sigma product: [27] , [28]. Sammen disse resultatene tyder på at veier som er ansvarlig for etablering og vedlikehold av normale celletypespesifikke DNA metylering stater kan bli forstyrret under kreftutvikling.
Siden MIR-200c og miR141 spille en viktig rolle i EMT og derfor celleidentiteten forstyrrelse av mekanismene som styrer celletype spesifikk DNA metylering mønstre under kreftutvikling kan trolig påvirke uttrykket av MIR-200c og miR141 og gi fenotypisk plastisitet til kreftceller. Støtte for denne muligheten kommer fra fenotyper av kreft celler analysert i denne studien. Alle fire av brystkreft cellelinjer som mistet MIR-200c og Mir-141 uttrykk har en abnormt metylert mir-200c /141 CpG island, og hver av disse cellelinjene viser en mesenchymale fenotype [11], [29]. I motsetning til de brystkreftcellelinjer som uttrykker Mir-200c og MIR-141 og har en unmethylated CpG island vise en epitelial fenotype [11], [29]. Et lignende bilde avtegner i prostata kreft cellelinjer. De PC3 celler som har mistet MIR-200c og Mir-141 uttrykk, vise et abnormt denaturert CpG island og en mesenchymale fenotype, mens LNCaP og Du145 beholde MIR-200c og Mir-141 uttrykk og en epitelial fenotype [11], [30] . Disse resultatene tyder på at DNA-metylering kan styre de fenotypiske endringer observert i kreftceller.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
begrenset levetid pre-stasis HMEC fra prøver 184 (sats D), 48R (batch T), og 240L (batch B), ble avledet fra reduksjon mammoplasty vev av kvinner i alderen henholdsvis 21, 16, og 19. Celler ble initiert som organoids i primær kultur i serumholdig M85 medium supplert med oksytocin (Bachem) ved 0,1 nM, og opprettholdt i M87A medium supplert med oksytocin og koleratoksin ved 0,5 ng /ml [31]. Fibroblaster fra prøver 184, 48 og 240 L ble oppnådd fra den samme reduksjon mammoplasty vev og ble dyrket i DMEM /F12 med 10% FBS og 10 ug /ml insulin [31] og ytterligere dyrket i DMEM /F12 med 10% FBS. Prostata epitelceller ble erholdt fra Clonetics (San Diego, CA), og føtale hud keratinocytter fra celle Applications (San Diego, CA.) og ble dyrket i henhold til produsentens bruksanvisning. Menneskelig forhud fibroblaster (HFFS) ble opprettholdt og kultivert ved Arizona Cancer Center Cell Culture Shared Service. Menneskelige prostata stromal fibroblaster (PSF) ble dyrket som beskrevet tidligere [32]. Brystkreft cellelinjer BT549, HS578T, MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, UACC893, UACC1179, UACC2087, og UACC3199 ble dyrket som beskrevet tidligere [33] , [34]. Prostatacancer cellelinjer PC3, PC3 B1, LNCaP og DU145 [35], [36], [37] ble opprettholdt i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum supplementert med 100 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Mus keratinocyt cellelinjer 308 og 6R90 ble dyrket som beskrevet [38], mus fibroblast cellelinjer NIH 3T3 NIH 3T6 og NR6 [39], [40], [41] ble opprettholdt i DMEM-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum. SKH-1 mus epidermis prøver ble fjernet fra flytende nitrogen snap frosset rygghuden ved å skrape på tørris.
miRNA bibliotek forberedelse, sekvensering og analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol. Den lille RNA-fraksjonen ble renset på en 15% polyakrylamid-urea gel. En preadenylated adapter ble ligert til 3′-enden av de små RNA, etterfulgt av rensing av ligerings produktet på en 15% PAA-ureagel. En Illumina spesifikk 5 «adapter ble ligert, og produktet ble renset på en 10% PAA-ureagel. Liten RNA med avsnørede adaptere ble revers transkribert til DNA ved hjelp av en RT primer med Illumina bestemt forlengelse. cDNA ble så PCR-amplifisert ved å bruke Illumina spesifikke primere og PCR-produktet ble renset på en 3% agarosegel. Små RNA bibliotekene ble sendt inn for Illumina sekvense å NCGR (Santa Fe, New Mexico). Leser fra Illumina GAII ble kartlagt til hg18 menneskelige genom settet med program Novoalign (www.novocraft.com). Utgang fra Novoalign ble videre analysert i R (https://www.r-project.org). Tellingene av individuelle mirnas ble normalisert for gjennomsnittlig bibliotek størrelse (3,926,984 teller).
Nukleinsyre isolasjon
RNA ble isolert ved hjelp av enten Trizol (Invitrogen) eller RNeasy Mini kit (Qiagen) og kvantifisert ved absorpsjonsmålinger ved 260 nm. Genomisk DNA ble isolert ved hjelp av DNeasy blod og vev Kit (Qiagen) og kvantifisert spektrofotometrisk.
Real-time PCR påvisning av miRNA
Real-time PCR deteksjon av microRNAs ble utført i prinsippet som beskrevet [42]. Revers transkripsjon ble utført ved bruk av TaqMan revers transkripsjon Reagenser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Real-time PCR ble utført på en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ved hjelp av Perfecta SYBR Grønn SuperMix, Low ROX (Quanta biovitenskap, Gaithersburg, MD, USA) med en 95 ° C denaturering for 3 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 45 sekunder. Forskjeller i ekspresjon ble bestemt ved den komparative Ct metoden beskrevet i ABI bruksanvisningen i forhold til la-7a. Primer sekvenser er oppført i tabell S1.
CpG island prediksjon
CpG øyer ble spådd å bruke programmet CpGcluster [16]. Dette programmet bruker en statistisk metode for å søke etter regioner med betydelig berikelse av CpG dinukleotider stedet parametre innenfor et glidende vindu. Vi setter terskelen til 50 (median avstand) og p-verdi kuttet til 10
-8.
DNA metylering analyse av MassARRAY
DNA metylering analyse av MassARRAY ble utført som beskrevet [ ,,,0],43]. Primer sekvenser er oppført i tabell S1.
5-aza-2′-deoxycytidine behandling
Celler ble behandlet med 3 mikrometer 5-aza-2′-deoksycytidin (Sigma, St. Louis, MO , USA) i 96 timer som tidligere beskrevet [44].
Chromatin immunoutfelling
Chromatin immoprecipitation (chip) analyse ble utført som tidligere beskrevet [33], [45], [46] med antistoffer mot acetylert histon H3 (# 06-599, Millipore), trimetylert histon H3 K4 (# 05-745, Upstate), dimethylated histon H3 K9 (CS200587, Millipore), og trimetylert histon H3 K27 (# 07-449, Millipore ). Like mengder (1 ng) av chip og innspill DNA ble brukt for real-time PCR-analyse. Primere ble utviklet for bruk med Human Universal Probe Bibliotek Set (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Real-time PCR ble utført på en ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ved hjelp av Perfecta qPCR SuperMix, Low ROX (Quanta biovitenskap, Gaithersburg, MD, USA) med en 95 ° C denaturering for tre minutt etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 45 sekunder. Primer sekvenser er oppført i tabell S1.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Real-time PCR vurdering av Mir-141 uttrykk i normale celletyper. Det venstre panelet viser uttrykket av MIR-141 i tre isogene par av mammary epitelceller (HMEC) og mammary fibroblaster (FB). Høyre panel viser uttrykk for MIR-141 i menneskelig prostata epitelceller (PREC), prostata stromal fibroblaster (PSF), menneskelig hud keratinocytter (Kcytes) og huden fibroblaster (HFF). Dataene er normalisert i forhold til la-7a, som uttrykkes ved konsekvent nivåer mellom forskjellige prøver i henhold til de små RNA-sekvenseringsdata
doi.: 10.1371 /journal.pone.0008697.s001
(0,13 MB TIF)
Figur S2.
DNA metylering av mir-200c CpG island omvendt korrelerer med MIR-200c uttrykk i normale humane prøver. Denne figuren oppsummerer data som er vist i figur 1B og 2B. Den øvre panelet viser uttrykket av MIR-200c oppdaget av real-time PCR. Den nederste panelet viser metylering nivået mir-200c CpG island region i de samme humane prøver. Nivået av metylering av individuelle CpG enheter i MassARRAY amplicon vises som et varmekart med lavest metylering i gult og det høyeste metylering i blått. Y-aksen markerer de enkelte CpG enheter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0008697.s002 plakater (0,19 MB TIF)
Figur S3.
Real-time PCR vurdering av Mir-141 uttrykk i bryst og prostata kreft cellelinjer. Det venstre panelet viser uttrykket av MIR-141 i elleve menneskelige brystkreftcellelinjer. Høyre panel viser uttrykk for MIR-141 i fire menneskelige prostata kreft cellelinjer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0008697.s003 plakater (0,14 MB TIF)
Figur S4.
MIR-141 uttrykk i kreftcellelinjer inn ved 5-aza-2′-deoxycytidine behandling. Celler ble behandlet med 3 uM 5-AdC i 96 timer. Graden av ekspresjon av MIR-141 ble målt ved hjelp av sanntids-PCR. Gjennomsnittet av 4 målinger vises, feil søylene viser standard målefeilen. Verdiene ble normalisert til ubehandlede kontroller (100%)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0008697.s004 plakater (0,06 MB TIF)
Figur S5.
Histone H3 K27 trimethylation state of the mir-200c CpG island.
