Abstract
Telomerase er nødvendig for ubegrenset levetid av kreftceller. De aller fleste av bukspyttkjertelen adenokarsinomer overuttrykke telomerase aktivitet og blokkerer telomerase kan begrense deres levetid. GRN163L (Imetelstat) er et lipid-konjugert N3 «→ P5» tio-fosforamidat oligonukleotid som blokkerer malen regionen av telomerase. Målet med denne studien var å definere effektene av langvarig GRN163L eksponering på vedlikehold av telomerer og levetiden for kreft i bukspyttkjertelen celler. Telomere størrelse, telomerase-aktivitet, og telomerase inhibering respons på GRN163L ble målt i et panel av 10 bukspyttkjertelcancercellelinjer. Cellelinjene viste store forskjeller i nivåene av telomerase aktivitet (46 ganger variasjon), men de fleste linjene hadde svært korte telomerer (2-3 kb i størrelse). GRN163L hemmet telomerase i alle 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer, med IC
50 fra 50 nM til 200 nM. Kontinuerlig GRN163L eksponering av CAPAN1 (IC
50 = 75 nM) og CD18-celler (IC
50 = 204 nM) resulterte i en initiell rask forkortelse av telomerer etterfulgt av opprettholdelse av ekstremt korte, men stabile telomerer. Kontinuerlig eksponering for stoffet til slutt førte til finanskrisen og et fullstendig tap av levedyktighet etter 47 (CAPAN1) og 69 (CD18) doublings. Krise I disse cellene ble fulgt av aktivering av en DNA-skade respons (γ-H2AX) og tegn på begge senescens (SA-β-galaktosidase-aktivitet) og apoptose (sub-G1 DNA-innhold, PARP spaltning). Fjerning av narkotika etter langvarig GRN163L eksponering førte til en reaktivering av telomerase og re-forlengelse av telomerer i den tredje uken i dyrking uten GRN163L. Disse funnene viser at levetiden for kreft i bukspyttkjertelen celler kan begrenses ved kontinuerlig telomerase hemming. Disse resultatene bør legge til rette for utformingen av fremtidige kliniske studier med GRN163L hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Burchett KM, Yan Y, Ouellette MM (2014) telomeraseinhibitor Imetelstat (GRN163L) begrenser levetiden for menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 9 (1): e85155. doi: 10,1371 /journal.pone.0085155
Redaktør: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, USA
mottatt: 19 juli 2013; Godkjent: 23 november 2013; Publisert: 07.01.2014
Copyright: © 2014 burchett et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en National Cancer Institute (NCI) SPORE tilskuddet (P50 CA127297) og NCI trening bevilgning (T32 CA09476). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. GRN163L og feilaktige oligo ble gitt gratis av Geron Corp (Menlo Park, California). Forfatterne ønsker å uttrykke sin takknemlighet for råd, tilbakemeldinger og ytterligere reagenser gitt til dem av Sergei Gryaznov, Robert Tressler, Ning Go og Katia Bassett fra Geron Corp. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling data og materialer.
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreftdød i den vestlige verden. Kreft i bukspyttkjertelen er en sykdom av lumske progresjon og høy dødelighet, med en 5-års overlevelse på bare 6%. I USA alene, anslagsvis 43,920 pasienter forventes å bli diagnostisert med sykdommen i 2012, og 37,390 pasienter er forventet å dø av det [1]. De aller fleste av disse tilfellene er bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer, som utvikler i kanalene i bukspyttkjertelen. Disse svært invasive svulster består av et rikt desmoplastic stroma, som er innebygd ondartede kreftceller som uttrykker markører for bukspyttkjertel duktale celler [2], [3]. For pasienter med pankreatisk duktus adenokarsinom, er den eneste kurative alternativ operasjon [3]. Standardprosedyren er en pancreaticoduodenectomy (eller Whipple prosedyre), en kirurgisk operasjon som fjerner hodet av bukspyttkjertelen, men deler den gjenværende vev. Dessverre, de fleste i bukspyttkjertelen kreftpasienter stede med inoperabel metastatisk eller lokalavansert sykdom. Faktisk bare 20% av pasientene har reseserbare tumorer på diagnosetidspunktet [3]. Men selv for de pasienter som gjennomgår kirurgi, er den samlede fem års overlevelse på bare 20%, som de fleste av disse pasientene vil få tilbakefall innen ett år etter operasjonen deres [3]. Det er derfor et kritisk behov for nye medikamenter som kan mer effektivt å målrette mot disse tumorceller og /eller reduserer forekomsten av tilbakefall. Telomerase-inhibitorer er blitt foreslått å være spesielt godt egnet for å hindre gjenvekst av gjenværende cancerceller etter konvensjonell cancerterapi [4], [5]. Ikke bare gjør de selektivt målet telomerase-positive kreftceller, men deres vekst hemmende effekter øke etter hvert som de målrettede cellene utføre et økende antall celledelinger. I denne studien har vi preget virkningene av en telomerase-hemmer, GRN163L, på celle levetid og overlevelse av et panel av bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
Telomerase er enzymet ansvarlig for vedlikehold av telomerer, avgjørende strukturer som cap og beskytter endene av lineære kromosomer. Humane telomerer er laget av tandem-kopier av (TTAGGG)
n DNA gjentar og av assosierte proteiner, som sammen danner en beskyttende tildekking kompleks [6], [7]. Dette cap beskytter kromosomendene fra degradering, interchromosomal fusjoner og blir anerkjent som dobbel-strandet (DS) DNA pauser, en form for DNA-skader [7], [8]. På grunn av problemer forbundet med replikasjonen av endene av lineære DNA-molekyler, de såkalte end-replikering problemer, telomerer forkorte hver gang humane somatiske celler dele, og denne slitasje som reduserer deres levetid [9]. Når den korteste telomere blir utildekket, blir en DNA-skade indusert respons som mobiliserer p53 og P16 /pRb trasé, som deretter virker sammen for å indusere senescens, en levedyktig tilstand av irreversibel quiescence [10], [11]. Hvis p53 og p16 /PRB trasé er deaktivert, vil cellene ignorere disse veksthemmende signaler, og vil fortsette å dele og forkorte deres telomerer. Til slutt, terminal telomerer forkortes føre til krise, et ikke-levedyktig tilstand assosiert med programmert celledød [10], [11]. Krise er utløst av tilbakevendende sykluser av telomer-telomere fusjoner, anaphase broer og kromosombrudd [12]. Når stede, kan telomerase forhindre induksjon av senescence og krise og utvide cellular levetid ved syntese og tilførsel av nye telomeric gjentar til telomerer. Telomerase er overalt tilstede i de tidlige stadier av menneskelig utvikling. Men ved tidspunktet for fødselen, er ekspresjonen av enzymet trykt og telomerase blir fraværende fra de fleste somatiske vev [13], [14], inkludert bukspyttkjertel [15], [16], [17]. Cancer prøver, i sterk kontrast til normalt vev, er nesten alltid positive for telomeraseaktivitet [18], inkludert pankreatiske ductal adenokarsinomer [15], [16], [17]. Oppdaget i mer enn 85% av krefttyper, uavhengig av tumortype, er telomerase en av de mest kjente markører for kreftceller [18]. Dessuten er dette uttrykk for telomerase i kreftceller som kreves for deres ubegrenset spredning eller udødelighet, et kjennetegn på kreft. Følgelig inhiberingen av telomerase i kreftceller fører til telomere slitasje og begrenser levetiden til disse cellene [19], [20], [21], [22]. Etter tilstrekkelig telomere slitasje har funnet sted, vil telomerase-inhibert cancerceller bukke under for enten begynnende alderdom eller apoptose, avhengig av det celledelte systemet. Denne avhengighet av telomerase fra deres ubegrenset vekst og den nesten universelle ekspresjon av telomerase i kreftceller gjør telomerase et attraktivt mål for cancerterapi. En potensiell ulempe er imidlertid forsinkelsene nødvendig før den målrettede kreftcellene har mistet tilstrekkelig telomerer for begynnende alderdom eller krise å bli indusert. Dette forsinket virkning kan være til hinder for deres anvendelse som et første linje for behandling av kreft, men for å hindre gjenvekst av restsykdom etter konvensjonell behandling, har telomerase-inhibitorer forventet å ha god terapeutisk potensial [4], [5].
menneskelig telomerase inneholder to vesentlige subenheter: proteinet hTERT (human telomerase revers transkriptase) og den lille kjernefysiske RNA HTR (human telomerase RNA). Den første gir katalytisk aktivitet og den andre inneholder en kort sekvens (5′-CUAACCCUAA-3 «) som tjener som et templat for syntese av telomeric repetisjoner [23]. Underlaget av telomerase er enkelt-strandet 3′-telomeric overheng som caps helt på slutten av alle telomerer. Enzymet virker som en revers transkriptase og benytter RNA HTR som et templat for syntese og tilsetning av telomeric DNA gjentar de 3′-telomeric overheng. For telomerase inhibering, malen regionen av human telomerase RNA (HTR) presenterer en tilgjengelig mål for oligonukleotid-baserte inhibitorer [4], [24]. Oligonukleotider som er utformet for å hybridisere til malen området kan anvendes for å inhibere aktiviteten av telomerase [25], [26]. Oligonukleotider med forskjellige kjemikaliesammensetninger har blitt testet og N3»-P5 «tio-fosforamidat oligonukleotider har gitt noen av de mest potente og selektive inhibitorer av telomerase [25], [27], [28]. Disse forbindelser er ikke-toksiske, vannoppløselige, nuklease-resistente og viser høy termisk stabilitet av dupleksene som er dannet med sitt komplementære RNA-tråder. GRN163L er andregenerasjons N3»-P5 «tio-fosforamidat telomerase inhibitor designet av Geron Corp (Menlo Park, California) [20]. Denne inhibitor, også kjent som Imetelstat, bærer en 5»-terminal palmitoyl-del konjugert til N3 « P5′ tio-fosforamidat ryggrad (5»-palmitat-TAGGGTTAGACAA-NH
2-3 «). GRN163L er fettløselige og krever ikke transfeksjon for cellulært opptak. Ved nanomolare konsentrasjoner inhiberer telomerase GRN163L i et stort spektrum av cancercellelinjer [20]. I oppfølgingsstudier, kunne langsiktig GRN163L eksponering begrense levetiden av dyrket kreftceller avledet fra glioblastom [29], multippelt myelom [30] og Barretts spiserøret adenokarsinom [31] samt brystkreft [32], [33], lunge [34] og lever [35] kreft. I musemodeller, kan inhibitoren hemmer veksten av transplantater i mus som produseres ved implantering av disse humane kreftceller [29], [30], [31], [33], [34], [35]. GRN163L er for tiden i kliniske studier hos pasienter med myelomatose (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01242930)., Essensiell trombocytemi eller polycytemi vera (NCT01243073), og primær eller sekundær myelofibrose (NCT01731951)
Effekten av telomerase hemming, enn si GRN163L, har aldri blitt undersøkt i kreft i bukspyttkjertelen, en av de dødeligste og mest gjentakende malignitet. I denne rapporten har vi testet effekten av GRN163L på et panel av 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Med IC
50 i nanomolar rekkevidde, GRN163L efficaciously hemmet telomerase i alle 10 cellelinjer. Kontinuerlig GRN163L eksponering av CAPAN1 og CD18-celler resulterte i en initiell rask forkortelse av telomerer etterfulgt av opprettholdelse av ekstremt korte, men stabile telomerer. Kontinuerlig eksponering for stoffet til slutt førte til finanskrisen og et fullstendig tap av levedyktighet etter 47 og 69 doublings hhv. Disse resultatene viser at kontinuerlig eksponering for GRN163L kan reversere den udøde fenotype av kreft i bukspyttkjertelen celler. Disse funnene bør legge til rette utformingen av fremtidige kliniske studier med GRN163L hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Material
Fetal bovin serum (FBS) var fra HyClone ( Logan, UT, USA). T4-polynukleotidkinase, ble proteinase K, Gentamycin, penicillin /streptomycin, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), RPMI-1640-medium, Iscoves modifiserte Dulbeccos medium og McCoys 5A medium anskaffet fra Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA). Restriksjonsenzymer AluI, MspI, HaeIII, Hinfl og RsaI var fra New England Biolabs (Ipswich, MA, USA), mens CfoI ble hentet fra Promega Corporation (Madison, WI, USA). Pattedyr proteasehemmer cocktail var fra Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, USA). Den Palmitoyl-konjugert N3 « P5′ tio-fosforamidat GRN163L oligo (5»-palmitat-TAGGGTTAGACAA-NH
2-3 «) og manglende samsvar oligo (5»-palmitat-TAGGTGTAAGCAA-NH
2-3 «; uoverensstemmelser understreket) ble levert av Geron Corporation (Menlo Park, CA, USA). N3 « P5» tio-fosforamidat oligonukleotidene ble oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS) for å lage 1 mM aksjer, som ble holdt frosset ved -80 ° C. Alle andre kjemikalier var fra Fisher Scientific (Pittsburgh, Pennsylvania, USA).
Cellelinjer
Cellelinjer brukt tidligere beskrevet av andre [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40], [41]. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Alle cellelinjer ble dyrket i medium supplert med 10% FBS og enten 50 ug /ml gentamycin eller 100 U /ml penicillin /streptomycin. Media som ble brukt var som følger: DMEM for de fleste cellelinjer (VA13, HeLa, HPAF, CD18, Hs766T, CAPAN1, MiaPaCa2, Panc1 og L3.6pl celler); RPMI-1640 medium for AsPC1 celler; Iscove modifiserte Dulbeccos medium for CFPAC1; og McCoys 5A medium for CAPAN2 celler.
telomere Size Analyse
Totalt genomisk DNA ble isolert fra frosne pellets av celler. I korthet ble cellene resuspendert i 2 volumdeler av en buffer inneholdende 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 25 mM EDTA (pH 8,0), hvoretter 0,4 mg /ml Proteinase K ble tilsatt. Natriumdodecylsulfat (SDS) ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,5% (w /v), og prøvene ble rotert over natten ved 50 ° C. Den neste dag ble prøver ble ekstrahert to ganger med Tris-buffer-mettet fenol og deretter en gang med vann-mettet CHCI
3. Deretter ble prøvene dialysert over natten ved 4 ° C mot to forandringer av TE-buffer (1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl, pH 8,0). Genomiske DNA-prøver ble lagret ved 4 ° C.
genomisk DNA (5-10 ug) ble digerert ved 37 ° C i 2-4 timer i 100 pl av en React-buffer (10 mM MgCl
2 og 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) med en cocktail av restriksjonsenzymer som ikke klarer å kutte telomeric DNA: Alul, CfoI, Haelll, HinfI, MspI, og Rsal (16 enheter hver). Fordøyde prøver ble applisert på en 25 cm lang 0,7% agarosegel i 0,5 x TBE-buffer (Tris-EDTA-borat), sammen med en ende-merket [
32P] -molecular vekt DNA markør. Elektroforese ble utført over natten ved 50 volt, hvoretter gelen ble overført til en 3 M papir og vakuum-tørket ved 60 ° C i en time. Gelen ble dyppet i 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 15 minutter, hvorunder 3 M papiret ble skrellet av. Gelen ble nøytralisert i 2 x 15 minutter i 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,4 og deretter overført til 6 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat, pH 7,0). Pre-hybridisering ble utført i 2 timer ved 30 ° C i en buffer inneholdende 5 x SSC, 5 x Denhardts oppløsning, 1 mM EDTA, 0,1% SDS (w /v) og 10 mM LiCl. Hybridiseringen ble utført i samme buffer ved 37 ° C natten over, ved bruk av 0,5-1,0 x 10
6 cpm /ml av en ende-merket [
32P] – (TTAGGG)
4 probe. Gelen ble pre-vasket i 5 x SSC (to ganger i 10 minutter hver ved 37 ° C) og deretter i 0,1 x SSC inneholdende 0,1% SDS (tre ganger i 10 minutter hver ved romtemperatur). Gel ble blottet tørr, dekket med Saran Wrap og utsatt for en phosphoImager kassett.
Median telomere størrelser ble estimert fra densitometrisk skanning av hvert kjørefelt. Signalintensitet først ble plottet som en funksjon av migreringsavstanden. Radiomerkede molekylvektmarkører ble brukt til å fremstille en kalibreringskurve som brukes til å beregne størrelse for hver avstand migrert. Telomer-signalintensitet ble deretter plottet som en funksjon av beregnet størrelse, heller enn avstanden (for eksempel figur S4). Median ble estimert som den størrelse som tilsvarte halvparten av den kumulative summen av alle signal intensiteter.
Bestemmelse av relativ telomeraseaktivitet
Telomerase-aktivitet ble målt ved anvendelse av en ikke-radioaktiv modifikasjon av TRAP-analysen (Telomeric Gjenta Amplification Protocol), ifølge Herbert
et al
. [42]. Analysen ble utført ved hjelp av trapes telomerase deteksjon kit (kat # S7700, Millipore, Billerica, MA), erstatte [
32P] -merket TS oligo med en Cy5-konjugert TS oligo (5′-Cy5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 «; Integrerte DNA Technologies, Coralville, IA). Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner, bortsett fra at: 1) last fargestoff ikke inneholde xylencyanol; 2) PCR ble utført i 33 sykluser; 3) gel ble skannet direkte uten tørking. Halvreaksjoner ble separert på en 10% polyakrylamid /0,5 x TBE-gel i 165 minutter ved 200 volt, hvoretter skanning av gelen ble utført ved anvendelse av en Molecular Dynamics tyfon Imager System (Molecular Dynamics). Analysen omfatter en indre standard (ITAS) som brukes til å normalisere signalene for forskjeller i PCR effektivitet. Med Imagequant-programmet (Molecular Dynamics), ble telomerase-aktivitet beregnet fra forholdet mellom intensiteten av telomeric produkter enn det av ITAS. For å sammenligne nivåene av telomeraseaktivitet mellom cellelinjer, ble seriefortynninger (50, 100, 200, 500 celler /analyse) av hver linje analysert i parallell for telomeraseaktivitet (telomerase produkter /ITAS ratio). Plotting telomeraseaktivitet som en funksjon av celletall, ble dataene fra hver linje innbygging av minste kvadraters regresjon til en lineær kurve. Helningen av hver kurve og 95% konfidensintervaller kan deretter bli brukt for å sammenligne relative nivåer av telomeraseaktivitet.
Bestemmelse av IC
50 for GRN163L
IC
50 bestemmelser ble utført i 96-brønners plater. Celler ble sådd ut i 5 x 10
4 /brønn, lov til å festes, og deretter eksponert i tre paralleller til en variabel dose av GRN163L (0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 4000 nM) eller feilaktige oligo (0, 4000 nM). Tjuefire timer senere ble cellene vasket tre ganger med 100 ul iskald fosfat-bufret saltvann (PBS), og deretter lysert i 50 ul av 1 x CHAPS-buffer (trapes kit). Lysis ble utført ved gynge på is i 30 minutter, hvoretter 96-brønns plate ble frosset. Dagen for analysen, ble platen tint og prøvene ble fortynnet 01:20 på en ny plate ved hjelp av is-kald 1 x CHAPS-buffer (sluttkonsentrasjon = 50 celler /mL). To mikroliter av hver fortynnet prøve (100 celler) ble deretter analysert som beskrevet ovenfor ved bruk av ikke-radioaktive TRAP-analyse. Telomeraseaktivitet (telomerase produkter /ITAS forhold) ble beregnet for hvert datapunkt, ble deretter uttrykt som en prosent av den gjennomsnittlige verdien av de ubehandlede prøver (n = 3), og ble deretter rapportert på spredningsdiagram som en funksjon av log [ ,,,0],GRN163L]. Med Sigmaplot versjon 11,0, ble datapunkter deretter tilpasset ved ikke-lineær regresjon til en 2-parametter sigmoid kurve (Prosent telomerase = D + (100 D) /(1 + 10
((log [GRN163L] -log [IC50 ]) * 1,59)), der D er minimal restaktivitet), som vi estimerte verdien og 95% konfidensintervall av loggen [IC
50].
SA-β-galaktosidase aktivitet
celler ble sådd ut ved en tetthet på 10
4 celler /brønn i en 24-brønns plate. Den neste dag ble cellene fiksert og underkastet histokjemisk farging for human senescens-assosiert β-galaktosidase-aktivitet. Fiksering og farging ble utført som beskrevet tidligere [43]. Uten et fasekontrast-filter, både de positivt (blå) og negativt (ufargede) fargede celler ble tellet under mikroskop. Ved å kombinere data fra ti separate felt, ble prosenten av blå celler tabulert fra en total på minst 200 telles cellene.
vekstkurver
celler ble sådd i en tetthet på 3 x 10
5 celler per 150 mm skål. Medikamenter (PBS kjøretøy, 1 uM GRN163L, 1 pM ikke samsvarer oligo) ble tilsatt så snart cellene ble festet (etter 4-8 timer). Cellene ble dyrket i 7 dager, der perioden ferske narkotika ble lagt hver 2-3 dager. Etter en uke av vekst, ble cellene trypsinert og tellet, og antallet populasjonsdoblinger utført av hver prøve ble beregnet på nytt. Cellene ble deretter belagt på samme opprinnelige tetthet for en uke med vekst, mens de resterende celler ble satt til side for enten DNA eller for å gjøre frosne aksjer. Celler ble holdt i kultur inntil fullstendig tap av de GRN163L-behandlede kulturer.
Western Blot analyse
Adherente celler ble vasket to ganger med is-kald fosfat-bufret saltvann (PBS), innhøstet etter skraping i en lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1% pattedyr-proteaseinhibitor cocktail, og hver av de følgende kinase /fosfatase-inhibitorer: 1 mM na
3VO
4, 50 mM NaF, 5 mM natriumpyrofosfat, 10 mM natrium-2-glycerofosfat, og 1 uM mikrocystin. Flytende celler ble oppsamlet ved sentrifugering, hvoretter cellene ble lysert i den samme lyseringsbuffer. Kombinert flytende og adherente celler fra den samme fatet ble flash-frosset og lagret ved -80 ° C. Proteiner ble kvantifisert ved anvendelse av Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad). Prøver (80-100 ug /brønn) ble separert på 4-20% gradient SDS-PAGE-geler (Bio-Rad) og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). Blokkering trinn og inkubasjoner med antistoffene ble utført i TBS-T (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7,6) inneholdende enten 5% fett-fri tørrmelk eller 5% bovint serumalbumin (når bruker phospho-spesifikke primære antistoffer). Vasker ble gjort ved hjelp av TBS-T. Signaler ble påvist ved hjelp av SuperSignal West Pico kit (Thermo Scientifics). Antistoffer brukt omfattet mot H2AX (kaninantiserumet, katt # 07-627) og γH2AX (fosfor-Ser139, mus monoklonalt, klone JBW301) var fra Upstate. Anti-PARP1 antistoff (mus monoklonalt, klone c-2-10) var fra Calbiochem /EMD Biosciences, mens anti-aktin antistoff (geitepolyklonalt, sc-1616) var fra Santa Cruz Biotechnology. Sekundære antistoffer som ble brukt var pepperrotperoksidase-konjugert antistoff mot mus, kanin eller geit IgG (Jackson Immunoresearch).
flowcytometrisk analyse
heftende celler ble samlet ved trypsinering fulgt av sentrifugering. Flytende celler ble oppsamlet ved sentrifugering. Kombinerte adherente og flytende celler ble resuspendert i PBS, fiksert ved tilsetning av etanol til 80%, og deretter lagret ved -20 ° C. Tjue tusen faste celler ble farget med propidium jodid og analysert for DNA-innhold i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av en FACS Calibur instrument (Beckon Dickinson, Mansfield, MA, USA).
Immunofluorescensanalyse av Telomerer
celler dyrket på dekkglass ble vasket i PBS og fiksert i metanol: aceton [01:01] ved -10 ° C i 15 minutter. Etter en vask i PBS, ble prøver blokkert ved RT i 30 minutter i PBS inneholdende 10% hesteserum. Etter en vask i PBS, ble prøvene inkubert ved 4 ° C over natten sammen med det primære antistoff i PBS inneholdende 2% hesteserum. Etter tre 5 minutters vaskinger i PBS ble prøvene inkubert ved RT i 1 time med det sekundære antistoff i PBS inneholdende 2% hesteserum. Etter tre 10 minutter vasker i PBS, ble prøvene montert i Vectashield vanskelig inneholder DAPI. Bilder ble visualisert på en Zeiss 510 Meta Confocal Laser Scanning Microscope. Primære antistoffer ble brukt var et kanin anti-TRF2 (H-300, Santa Cruz) og muse anti-y-H2AX antistoff (klon JBW301, Upstate). Sekundære antistoffer var en FITC-konjugert esel anti-kanin antistoff og et Cy5-konjugert esel anti-mus antistoff, både fra Jackson Immunoresearch.
Påvisning av ALT av kvantitativ PCR
Påvisning av telomeric C -RICH sirkler indikerer ALT ble utført som beskrevet av Reddel gruppen [44]. I tre paralleller, ble 20 ul reaksjoner inneholdt 32 ng genomisk DNA, 0,2 mg /ml bovint serumalbumin, 0,1% Tween-20, 4 mM ditiotreitol (DTT), 7,5 deler Φ29 DNA-polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA) , 1 x Φ29 DNA-polymerase-buffer og 1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Polymerase-reaksjoner ble inkubert ved 30 ° C i 8 timer, etterfulgt av 65 ° C i 20 minutter. Reaksjoner ble dot blottet på en nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Etter UV-kryssbinding, ble membranen hybridisert over natten til en [
32P] -merket (TAACCC)
4 sonde. Hybridisering og vasker ble utført som beskrevet i telomere størrelse analyse seksjonen (se ovenfor)
Resultater
telomerlengde og Telomerase aktivitet varierer mellom bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Et panel. 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble preget for telomere lengde og relative telomerase aktivitet. Genomisk DNA isolert fra hver linje ble fordøyd med en cocktail av 4 bp kuttere, vedtok agarosegel og utsatt for
in situ
hybridisering til en [
32P] -merket (TTAGGG)
4 probe . Signaler avdekket en flekk av telomeric fragmenter, som varierer i størrelse fra 1 til 7 kbp (figur 1A). Densitometrisk analyse tillot bestemmelse av medianstørrelsen av den telomeric signal for hver cellelinje (figur 1B). AsPC1 hadde de korteste telomerer (median = 2,2 kb), mens CAPAN2 og Panc1 hadde de lengste (median = 3,5 og 3,7 kb, henholdsvis). I noen av linjene, spesielt CAPAN1 og CFPAC1, telomere distribusjon var bifasisk. I disse linjene, en overflod av korte telomerer side om side med en liten brøkdel av mye lengre telomerer ( 5 kb). Forvent for CAPAN2 og Panc1, alle linjene hadde svært korte bulk telomerer, med median størrelser 2,2 til 2,8 kb. Som en sammenligning, telomerer i den normale humane bukspyttkjertel er mellom 9 og 15 kb i lengde, avhengig av alderen av giverne [45].
A) telomere størrelsesmålinger. Genomisk DNA ble spaltet med restriksjonsenzymer, oppløses ved elektroforese i agarosegeler og detekteres ved in situ hybridisering til [
32P] – (CCCTAA)
4. B) Kvantifisering av telomer-størrelse. Gel i A ble skannet og intensiteten av hvert kjørefelt ble plottet som en funksjon av telomer-størrelse, som beskrevet i Materialer og Metoder seksjon. Median telomere størrelse ble beregnet som den størrelse som svarer til halvparten av den kumulative sum av de intensiteter. C) Påvisning av telomeraseaktivitet av TRAP-analysen. Celleekstrakter som inneholder 300 celler hver ble analysert ved hjelp av en Cy5-merket TS oligo underlaget. Etter PCR med samme oligo og en telomeric comeback primer, ble produktene løst ved elektroforese og oppdaget med en Typhon PhosphoImager. Buffer var lysebuffer bare. ITAS, Internal Telomerase analysen Standard. D) Kvantifisering av relativ telomerase aktivitet. Relativ telomerase-aktivitet ble beregnet som forholdet mellom intensiteten av telomerase stige over intensiteten av ITAS. Hver måling er gjennomsnitt ± S.D. av triplikate prøver (n = 3). Telomeraseaktivitet i hver linje er uttrykt som en prosent av HeLa-celler aktivitet.
Ved hjelp av en ikke-radioaktiv TRAP-analyse (Telomeric Vend Amplifikasjon Protocol), ble grunnlinje telomerase-aktivitet målt kvantitativt i hver cellelinje. Fellen analysen bruker PCR å forsterke produkter av telomerase forlengelse (Telomerase stige) sammen med en intern telomerase assay standard (ITAS). Telomeraseaktivitet kvantifiseres som forholdet mellom intensiteten av telomerase stige over at av de ITAS. Figur 1C viser et representativt eksempel på en TRAP-målingen ble utført på panelet, med samme antall celler fra hver linje. Store forskjeller i den relative intensiteten av ITAS og telomerase stigen ble observert, indikerer store forskjeller i baseline telomerase aktiviteter. For å oppnå mer nøyaktige målinger av telomerase-aktivitet, ble serielt fortynnede prøver av hver linje samtidig analysert og sammenlignet med HeLa-celler. Densitometrisk analyse tillot beregning av referanse telomeraseaktivitet for hver linje (figur 1D). Bukspyttkjertelkreft cellelinjer hadde nivåer av telomerase aktivitet som varierte fra 0,5% (CD18) til 23% (AsPC1) av den for HeLa-celler. Fire linjer (L3.6pl, MiaPaCa2, HPAF, AsPC1) var en del av en gruppe med høyere nivåer av telomerase (15,8 ± 4,8 prosent av HeLa). Seks linjer (CD18, Panc1, Hs766T, CFPAC1, CAPAN1, CAPAN2) var en del av gruppen som viser 10 ganger lavere nivåer av telomerase (1,53 ± 1,1% prosent av HeLa). En 46-fold forskjell i telomerase aktivitet ble registrert mellom AsPC1 (høyest aktivitet) og CD18 (lavest aktivitet) celler. Ingen korrelasjon ble funnet mellom størrelsen på telomerer og nivå av telomerase aktivitet (figur S1 A).
Telomerase hemmende GRN163L i bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Deretter undersøkte vi telomerase hemmende effekter av GRN163L i hver av de 10 pankreatiske kreftcellelinjer. I hver linje, ble telomerase-aktivitet målt ved 24 timer etter tilsetning av økende konsentrasjoner av GRN163L til cellene (n = 3 for hver dose). Figur 2A viser resultatene av denne analysen i HPAF celler. Densitometrisk analyse av TRAP gel tillatte målinger av relativ telomeraseaktivitet, som deretter kan bli uttrykt som en funksjon av GRN163L konsentrasjon. Disse dose-responskurver ble tilpasset ved ikke-lineær regresjon for å muliggjøre beregning av en IC
50 for hver linje. Figur 2B viser 95% intervall av trygghet for verdien av IC
50 i hver linje. Alle 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer svart på GRN163L, med IC
50 som varierte fra 50 nM til 200 nM. Den minst sensitive linjen var CD18 (IC
50 = 204 nM) og de mest responsive de var CFPAC1 og MiaPaCa2 (IC
50 = 52 nM, begge deler). Vi så ingen korrelasjon mellom referanse telomeraseaktivitet og responsen av cellelinjene til GRN163L, som målt ved deres respektive IC
50 (figur S1B).
A) dose-responskurve av telomerase inhibering av GRN163L . HPAF-celler ble behandlet i tre eksemplarer med økende konsentrasjoner av GRN163L (50 nM til 4 uM). Tjuefire timer senere, ble telomerase-aktivitet målt ved hjelp av TRAP-analysen. Prøvene ble behandlet med noen medikament ble satt til 100%. B) IC
50 i hver linje for inhibering av telomerase ved GRN163L. Dose-respons-kurver ble utført som i panel A. Ikke-lineær kurvetilpasning tillot beregning av en IC
50 for hver linje. Resultatene er uttrykt som IC
50 (midten bar) og 95% intervall på tillit (flankerer barer).
Effekter av kronisk GRN163L Exposure på spredning og Cellular Levetid
To bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble valgt for å studere effektene av langvarig eksponering for GRN163L: CAPAN1 og CD18. Kan sammenlignes med de fleste av linjene i undersøkelsen, CAPAN1 og CD18 hadde begge relativt korte telomerer (2-3 kb) og lavt nivå telomerase aktiviteter (0,5-1% av HeLa-celler). centrifugation.
doi:10.1371/journal.pone.0085155.s005
(TIF)
Acknowledgments
GRN163L
