Abstract
I det siste tiåret har en høy forekomst av somatiske mitokondrie DNA (mtDNA) mutasjoner observert, hovedsakelig basert på en brøkdel av molekylet, i ulike kreft vev; Likevel, noen av dem spørres grunn av problemer i datakvalitet. Selvfølgelig, uten en helhetlig forståelse av mtDNA mutasjonsprofil i kreftvev av en bestemt pasient, er det usannsynlig å avsløre den ekte forholdet mellom somatiske mtDNA mutasjoner og tumorigenesis. For å oppnå dette målet, er den enkleste måten å direkte sammenligne hele mtDNA genomet variasjon mellom tre vev (nemlig kreftvev, para-kreftvev, og fjern normal vev) fra samme pasient. Tatt i betraktning det faktum at de fleste av de tidligere studier på rollen av mtDNA i kolorektal tumor fokusert bare på D-løkke eller delvis segment av molekylet, i denne studien vi har samlet tre vevene (kreft, para-kreft og normale vev) henholdsvis rekruttert fra 20 pasienter med kolorektal svulsten og fullstendig sekvensert mitokondrie genomet av hver vev. Våre resultater viser en relativt lavere forekomst av somatiske mutasjoner i disse pasientene; intrigere, alle somatiske mutasjoner er i heteroplasmic status. Overraskende, er de observerte somatiske mutasjoner ikke begrenset til kreft vev, for para-kreft vev og fjerne normalt vev også havn somatiske mtDNA mutasjoner med en lavere frekvens enn kreftvevet, men høyere enn det som ble observert i den generelle befolkningen. Våre resultater tyder på at somatiske mutasjoner i mtDNA cancervev ikke kan bare forklares som en konsekvens av tumorigenesis; i mellomtiden, kan de somatiske mtDNA mutasjonene i normale vev reflektere en endret fysiologisk miljø hos kreftpasienter
relasjon:. Wang C-Y, Li H, Hao X-D, Liu J, Wang J-X, Wang W-Z, et al. (2011) Avdekke Profilen til Somatiske mtDNA mutasjoner i kinesiske pasienter med kolorektal kreft. PLoS ONE seks (6): e21613. doi: 10,1371 /journal.pone.0021613
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 15 mars 2011; Godkjent: 03.06.2011; Publisert: 28 juni 2011
Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science and Technology Committee of Yunnan-provinsen (2007C103M), og Natural Science Foundation of China National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i det siste tiåret har rollen som mitokondrie-DNA (mtDNA) mutasjon i tumorigenesis fått mye oppmerksomhet. En høy forekomst av somatiske mutasjoner mtDNA, for det meste i homoplastic, er blitt identifisert i nesten alle typer av cancervev [1], [2]. Likevel har forholdet mellom somatiske mtDNA mutasjoner og tumorigenesis blitt heftig debattert. Noen studier antydet at mtDNA somatiske mutasjoner sannsynlig resultat av de forhøyede reaktive oksygenarter (ROS) i tumorcelle [3], [4], [5], fordi de fleste av disse mutasjoner er T til C og G til en basis overganger [ ,,,0],1], [2], tilsvarende mutasjon mønster av oksydativ nedbrytning av DNA [6], [7]. Det ble også foreslått at noen endringer i mtDNA kan deaktivere funksjonen til mitokondrie respiratoriske kjeden og dermed bidra til tumor prosesjon [8], [9], [10], [11]. For eksempel, foreslått en ny studie som mtDNA mutasjoner som produserer den mangel i åndedretts kompleks I-aktivitet kunne bidra til tumorprogresjon ved å styrke den metastatiske potensiale av tumorceller [12]. I kontrast til noen studier antydet at somatisk mutasjon i tumorvev kan bare oppstå ved en tilfeldighet i tumor stamceller uten noen fysiologisk fordel eller tumorfremkallende krav [13], [14]. Faktisk, Vega og kolleger fant at mye av mtDNA mutasjoner påvist i svulsten var faktisk de vanligste polymorfismer eller mutasjons hotspots rådende i menneskelige befolkningen generelt, fører forfatterne å foreslå at disse somatiske mutasjoner er mer sannsynlig å være nøytral [15]. På samme måte ble de funksjonelle roller for noen av de identifiserte somatiske mutasjoner mtDNA spørres stor grad på grunn av problemene i datakvalitet [16], [17], [18]. Selvfølgelig er ytterligere bevis nødvendig for å belyse den eksakte rolle som somatiske mtDNA mutasjoner har spill i tumorigenesis.
I denne studien har vi utført hele mitokondrielle genom screening for somatisk mutasjon i sammenkoblede kreft og ikke-kreft vev fra 20 pasienter med kolorektal kreft. Ved å bruke de samme kvalitetskontroll tiltak som vedtas i våre tidligere studier i komplett mtDNA sekvensering [19], [20], [21], [22], ønsker vi å få en dypere innsikt i profilen av mtDNA somatiske mutasjoner i tykk- kreft. Den direkte sammenligning av hele mtDNA sekvenser av de primære kreft, matchet para-kreft normale og fjerne normalt vev fra samme pasient, sammen med den strenge kontrollen datakvalitet, er vedtatt å avsløre en detaljert profil av mtDNA somatiske mutasjoner i både normal og tumorvev i samme pasient. Våre resultater viste at de observerte somatiske mutasjoner i våre prøver er mye mindre hyppig enn de tidligere studiene. Overraskende, alle de observerte somatiske mutasjoner er i heteroplasmic tilstand, en observasjon ganske forskjellig fra tidligere studier.
Resultat
En totalt 59 komplette mitokondrielle genom sekvenser av tre sammenkoblede vev fra 20 kolorektal kreft pasienter ble oppnådd i denne studien, og alle sekvenser er blitt deponert i GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) med deponeringsnummer GU392048-GU392106. Alle mtDNA variable områder av hvert vev har blitt vist på en skjematisk tre (figur 1), som kan gi en direkte sammenligning av hele mtDNA genomet variasjon mellom tre vev fra den samme pasienten, og således tillate å påpeke at somatisk mutasjon (er) i en pasient beleilig. Som vist i figur 1, seks av 20 pasienter utført mtDNA somatiske mutasjoner i sine cancervev, opptar en mye mindre andel (6/20; 30%) enn mange tidligere rapporter. For eksempel, Tan et al. funnet 27 somatiske mutasjoner i 14/19 (74%) pasienter bryst [23]; Zhu et al. funnet 45 somatiske mutasjoner ved 35 nukleotid-posisjon i 14/15 (93%) brystkreftpasienter [24]; i Polyak et al. (1998), 7/10 (70%) kolorektal kreft saker ble vist å bære en til tre mutasjoner.
Haplogroup navnene er satt sammen grenene bestemme plasseringen av de tilsvarende forfedrenes haplotyper. Varianter (rekonstruert mest parsimoniously) på uforstyrret grener er oppført vilkårlig i stigende rekkefølge. Suffikser «A, C og T» indikerer transversions, «ins» indikerer en nukleotid innsetting; «C /T, A /C, og A /G» foreslår heteroplasmic mutasjoner, «d» indikerer en sletting. Tilbakevendende varianter er understreket. Lengde variant av C-veiene rundt posisjonene 310 og 16 189 er ikke vist på figuren. Suffikser «C, CP, og CN» i prøvenavn indikere «kreftvev, para-kreftvev og normalt vev» hhv.
I alt er det 18 somatiske mutasjoner ble oppdaget i 59 vevsprøver som studeres (figur 1 og tabell S1), og alle de somatiske mutasjoner oppstår bare på terminalen grener av fylogenetiske treet, og ingen haplotype-shift ble observert. Med unntak av RNA-gener (inkludert Srna og tRNA), er disse somatiske mutasjons områder spredt over hele mtDNA genomet, som virker helt forskjellig fra den mutasjonen spekteret observert hos pasienter med mitokondriale sykdommer [25], [26]. Nærmere bestemt syv mutasjoner finner i D-løkke region, mens de resterende 11 lokalisere i protein-kodende regioner. Blant de 11 koding-regionen somatiske mutasjoner, bare to (dvs. G4532A og A9275G) er synonyme overganger som forekommer på to ustabile områder; mens resten ni mutasjoner alt er ikke-synonyme erstatninger som finner i posisjonene 6718, 14288, 15332, 15447 og 15276, hvorav de fleste er evolusjonært svært konservert etter sammenlignet med mitokondrielle genomer fra 13 ulike arter virveldyr (Tabell S1). Ved ytterligere evaluere bevaring av disse fem mutasjons nettsteder blant totalt publiserte 3.635 komplette mitokondrielle genomsekvenser fra generelle befolknings våre resultater viste at alle de fem områdene er sterkt konservert blant de generelle befolknings også (tabell S1). Overraskende, til tross for den høye bevaring av området 6718, heteroplasmic variasjon 6718A /G viser i både kreft og para-cancer normale vev av Pasient 1, øke muligheten for at para-kreft normalt vev er sannsynligvis blitt invadert av kreftcellene . Faktisk er et lignende mønster ble observert i Pasient 3, hvor dens kreft og para-kreftvev har samme heteroplasmic variasjonen 16365C /T. Denne observasjonen, igjen, understreker særlig nødvendigheten av å inkludere den fjerne normalt vev for analyse.
Intriguingly, som vist i figur 1, er rettet inn mtDNA somatiske mutasjoner er ikke begrenset bare til tumorvev, for vi gjorde har observert noen somatiske mutasjoner i de normale vev i pasienter 1, 3, 8, 14 og 20. Nærmere bestemt, synes overgang 14 288 til å være en tilbakevendende mutasjonssetet, fordi det vises i tre pasienter som tilhører ulike haplogrupper. Denne ikke-synonyme mutasjon presenterer bare i normale vev hos pasientene. Den 14288 nettstedet i seg selv er ikke konservert på tvers av ulike arter, men ser ut til å være ganske konservert blant befolkningsgrupper; om denne mutasjonen har funksjonell effekt er ukjent.
I Pasient 14, side 16 093 i kreftvev er homoplastic C, mens det i para-kreft normal og fjernt normalt vev dette nettstedet skifter å være heteroplasmic som C /T. Dette mønsteret ble bekreftet av DHPLC analyseresultat: i kreftvev C14 nettstedet 16093 viser en enkelt topp, mens i para-kreft normale og fjerne normalt vev det viser dobbel topp (figur 2). Av notatet er at nettstedet 16 093 i seg selv er et hot spot i den generelle befolkningen og mutasjon på dette området har også blitt funnet i normalt vev av kreftpasienter i andre studier [27]. Lignende fenomen også skjedd med Pasient 20, hvor bare fjernt normalt vev næret somatisk mutasjon (nemlig., A9275G). Disse mtDNA somatiske mutasjoner kan være irrelevant for tumorigenesis vurderer sin opptreden i normalt vev.
Direkte sekvensering viser at nucleotide området 16093 viser en homoplastic C i kreftvev, mens i para-kreft normal og fjernt normalt vev dette nettstedet er i heteroplasmic status av T /C. DHPLC analysen bekreftet sekvense Resultatet i vev C14 det viser en enkel topp, mens i CP14 og CN14 det viser dobbel topp
Diskusjoner
Hittil har de fleste av de tidligere studiene på. rollen av mtDNA i kolorektal tumor fokusert bare på D-løkke eller delvis segment av molekylet [28], [29], [30], [31], har bare noen få rapporter fokusert på mutasjons profil på sin hele genomet (Polyak et al., 1998). For å få mer innsikt i forholdet mellom mtDNA og tykktarms svulst, i denne studien har vi rekruttert tre vev (kreft, para-kreft og normalt vev) samplet fra 20 pasienter med kolorektal svulst; ved å sekvensere hele mtDNA genomet fra hvert vev og sammenligne mutasjons forskjellen mellom tre vev fra samme pasient, vår studie avdekket en relativt lav mutasjonsfrekvens og heteroplasmic status for alle de observerte somatiske mutasjoner. Disse observasjonene er ganske forskjellig fra tidligere studier, understreker kompleksiteten i etiologien av tykktarms svulst.
Siden de fleste av pasientene (12/20) under studien ikke havna noen mtDNA somatisk mutasjon i sine kreft vev, en forklaring kan være at det er endring i atom genomet som har bidratt til den tumorigenesis i prøvene uten å involvere noen mtDNA endringer. Hyppigheten av mtDNA somatiske mutasjoner (6/20; 30%) ble observert i vår nåværende studien, som er sammenlignbare med de tidligere resultatene på brystkreft (2/10; 20% [22]), men er signifikant lavere (p 0,05 ) enn de tidligere observasjoner, spesielt de på kolorektal tumor. For eksempel Polyak et al. funnet at 7/10 (70%) kolorektale tumorpasienter utføres en til tre mutasjoner [32]. Det er mulig at det somatiske mutasjonsfrekvens kan variere mellom ulike etniske populasjoner eller korrelerer med kreft stadier; teste denne muligheten ville kreve en systematisk utforming av studien i nær fremtid. Alternativt blir mye lavere forekomst av somatiske mutasjoner som observeres i vårt studium mest troverdig tilskrives de strenge kvalitetskontrollen som ble tatt i bruk i løpet av datagenerering og analyse. Faktisk, når de potensielle problemene fant frem i tidligere studier ved hjelp av et fylogenetisk tilnærming [18] ble ekskludert, hyppigheten av somatiske mutasjoner vil deretter avta betraktelig.
Forbløffende nok alle de somatiske mutasjoner er identifisert her er i heteroplasmic, som er helt forskjellig fra de tidligere observasjoner. Spesielt, noen av somatisk mutasjon heteroplasmic også til stede i de normale vev i kreftpasienter. Tilsvarende, Taylor og medarbeidere har også funnet mtDNA somatiske mutasjoner i normalt vev i kolorektale tumorpasienter, og de fleste av disse mutasjonene var heteroplasmic [33]. For å vurdere om de heteroplasmic mtDNA somatiske mutasjoner påvist i normale vev av kreftpasienter er et vanlig fenomen, undersøkte vi hyppigheten av heteroplasmic mtDNA somatiske mutasjoner i de generelle menneskelige populasjoner (omfavner totalt 4738 mtDNA genomsekvenser hentet fra litteraturen). Vårt resultat viser at hyppigheten av individer som bærer heteroplasmic somatisk mtDNA mutasjon (er) er mindre enn 4%, noe som tyder på at heteroplasmy i mtDNA fra den generelle befolkningen er et sjeldent fenomen, i hvert fall når oppdaget ved direkte DNA-sekvensering metoden [34], [ ,,,0],35], [36]. Da vi nøye gjennomgått tidligere studier av mtDNA mutasjon i forskjellige tumortyper og fant at heteroplasmic somatiske mtDNA mutasjoner ble også observert i de normale vev av kreftpasienter [9], [22], [27], [33], [37] , med en betydelig høyere frekvens (38,6%) enn i den generelle befolkningen (3,2%; p 0,001), men fortsatt lavere enn i kreftvev (52,9%; p 0,05) (tabell S2). Siden hver enkelt er karakterisert ved en blanding av beslektede mitokondrielle haplotyper, og utbredt heteroplasmy i mtDNAs av forskjellige normale humane vev har blitt observert [27], [38], [39], [40]. Det er sannsynlig at den observerte forskjell i frekvenser for heteroplasmic mutasjonene mellom normalt vev fra kreftpasienter og den generelle befolkning (vanligvis innta sin perifert blod) er knyttet til heteroplasmy mellom forskjellige vev. Alternativt kan økt heteroplasmic mutasjonsfrekvens, både kreft og matchet normalt vev i kreftpasienter i forhold til den generelle befolkningen (tabell S2), kan skyldes en endret fysiologisk miljø (kanskje forhøyet nivå av ROS, eller noen andre ukjente mutagener). For eksempel, Goodwin et al. (2008) fant at både tumor og matchede normale vev fra prostata kreftpasienter som oppviser betydelig høyere ekspresjon av spermin oksidase [41], som har vært knyttet til økt ROS og DNA-skade [42], [43], versus vev fra prostata sykdoms- gratis pasienter.
i ettertid har tidligere undersøkelser vist at mtDNA mutasjon med potensial funksjonelle effekten kan bidra til tumor prosesjon [8], [12]. I denne studien, de identifiserte somatiske mtDNA mutasjoner i kodende region som alle ligger i evolusjonært svært konserverte områder. Det synes derfor mulig at disse somatiske mutasjoner, enskjønt alle i heteroplasmic, kan ha spilt noen rolle i å påvirke funksjonen av respiratoriske kjeden og således har noen biokjemiske funksjonell effekt til sin vertscelle. Men tatt i betraktning at de fleste av pasientene ikke havnen somatiske mutasjoner i cancervev, hvorvidt den funksjonelle effekten av disse somatiske mutasjoner er nødvendige for vertscellen er ukjent. Når det gjelder de somatiske mtDNA mutasjoner stede i normalt vev, bør de reflektere en endret mikromiljø for mtDNA. Hvorvidt disse mutasjonene, samt samspillet med den endrede mikromiljøet, kan øke følsomheten for en celle til tumorigenesis er ukjent.
Totalt forstå forholdet mellom mtDNA somatiske mutasjoner og tumorigenesis er en utfordrende oppgave, fordi strategier som direkte estimering celle skjebner eller hvem som er detaljert prosessen med begge hendelsene er fortsatt upraktisk in vivo. Ved direkte sammenligning av mtDNA genom variasjon i tre sammenkoblede vev fra samme pasient, kan vår studie gir en omfattende profil av somatisk mtDNA mutasjon i tumor pasient. En lav frekvens somatisk mtDNA mutasjon ble identifisert i colorectal pasienter og alle mutasjonene var heteroplasmic. I mellomtiden, kan noen av somatiske mutasjoner som kan være tilstede i det normale vev som indikerer at disse somatiske mutasjoner er ikke en følge av tumorgenese, og det kan reflektere en endret fysiologisk miljø for mtDNA i tumor pasient.
Materialer og Metoder
kliniske prøver
til sammen 59 vevsprøver ble oppsamlet i denne studien, blant de primære kolorektal kreft vev (C1-C10), tilsvarende para-kreft normale vev (CP1-CP10) og fjernt normalt vev (CN1-CN10), som ble tatt fra 20 kinesiske pasienter med tykktarmskreft under operasjonen med informert samtykke. Kreftvev ble bekreftet av HE-farget lysbilder av den frosne delen etter operasjonen, mens para-kreft normalt vev ble hentet fra det normale vevet rundt kreft, og fjern normalt vev er minst 5 cm fra kanten av kreftvev. Alle pasientene ble klinisk diagnostisert med stadium I (T1-T2, N0, M0) tykktarmskreft i henhold til den kliniske standard for kategorien av kreft [44]. Siden store målet med vår studie er å finne den subtile forskjellen mellom kreft og de matchet normalt vev fra utsiktspunktet mitokondrielle genom, ble bare kolorektal normalt vev (inkludert para-kreft og fjerne normalt vev) fra samme pasient derfor tatt i betraktning. Para-kreft normalt vev var ikke tilgjengelig for Pasient 19. Studien ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen.
DNA amplifisering og sekvense
Totalt genomisk DNA ble henholdsvis hentet fra para- kreftvev, primært kreftvev og fjernt normalt vev ved hjelp av standard fenol /kloroform metoden. Hele mtDNA genomer ble amplifisert og sekvensert som beskrevet i vår tidligere studier [19], [20], [21], [22]. Sekvenseringsdata ble redigert og justert ved bruk av DNASTAR programvare (DNAStar Inc., Madison, Wisc.), Og mutasjoner ble bedømt i forhold til den reviderte Cambridge referansesekvensen (rCRS) [45]. Fylogenetisk status for hver mtDNA ble bestemt i henhold til den rekonstruerte østasiatiske mtDNA fylogeni [20], [46], og deres relasjoner ble illustrert ved hjelp av en skjematisk fylogenetisk tre (figur 1).
Kvalitetskontroll
For å unngå potensielle problemer og feil observert i de publiserte mtDNA sykdoms studier [18], [47], [48], [49], en streng kvalitetskontroll procedure [19], [20], [21 ] ble benyttet i løpet av prøvehåndtering og datagenerering. I tillegg til fullt unngå kunstig rekombinasjon utløst av prøven mix-up eller forurensning [18], [50], hver vevsprøve ble forsterket og sekvensert individuelt som vi har gjort før [22].
Fastsettelse av heteroplasmy av DHPLC
For den observerte heteroplasmic mutasjon under direkte DNA-sekvensering, vi ytterligere bekreftet det ved denaturering væskekromatografi (DHPLC) (figur 2).
Hjelpemiddel Informasjon
Table S1.
Somatiske mtDNA mutasjoner identifisert i 20 colorectal pasienter
doi: 10,1371 /journal.pone.0021613.s001 plakater (DOC)
Tabell S2. Host Sammenligning av frekvensen av individer som bærer heteroplasmic mtDNA mutasjoner i normalbefolkningen og hos kreftpasienter
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0021613.s002 plakater (DOC)
Takk
Vi er takknemlige for alle deltakerne i denne forskningen. Vi ønsker også å erkjenne Shi-Fang Wu og Chun-Ling Zhu for deres hjelp i eksperimenter. Vi takker de anonyme anmeldere for nyttige kommentarer til den tidligere versjonen av manuskriptet.
