Abstract
deregulert Rho GTPases Rac1 og Cdc42 har blitt oppdaget i ulike tumorer, inkludert prostata og Rac protein uttrykk øker betydelig i prostatakreft. RAC og Cdc42 trasé fremme ukontrollert spredning, invasjon og metastatiske egenskaper humane kreftceller. Vi syntetiserte den nye forbindelsen AZA1 basert på strukturell informasjon fra den kjente Rac1 inhibitor NSC23766. I denne studien undersøkte vi effekten av hemming av disse banene ved AZA1 på prostata tumorigenicity ved å utføre prekliniske studier med en xenograft mus modell av prostatakreft. I androgen-uavhengig prostatacancerceller, AZA1 inhiberte både Rac1 og Cdc42 men ikke RhoA GTPase-aktivitet på en doseavhengig måte og blokkerte cellulær migrasjon og proliferasjon. Cyclin D1 uttrykk betydelig redusert etter Rac1 /Cdc42 hemming i prostatakreftceller. AZA1 behandling også nedregulert PAK og AKT aktivitet i prostatakreftceller, forbundet med induksjon av den pro-apoptotiske funksjon av BAD av undertrykkelse av serin-112 fosforylering. Daglig systemisk administrasjon av AZA1 for 2 uker redusert vekst av menneskelige 22Rv1 prostata tumorxenotransplantater hos mus og forbedret overlevelse av tumorbærende dyr betraktelig. Disse data tyder på en rolle AZA1 i blokkering Rac1 /Cdc42-avhengig cellesyklusprogresjon, kreftcellemigrering og økning av kreftcelle apoptose involverer nedregulering av den AKT og PAK signalveien i prostatakreftceller. Vi foreslår derfor at en liten-molekyl hemmer målretting Rac1 /Cdc42 Rho GTPase signalveier kan brukes som en ny behandling for pasienter med avansert prostatakreft
Citation. Zins K, Lucas T, Reichl P, Abraham D, Aharinejad S (2013) En Rac1 /Cdc42 GTPase Spesifikke småmolekylær hemmer undertrykker vekst av primære humane Prostate Cancer xenografter og forlenger overlevelse hos mus. PLoS ONE 8 (9): e74924. doi: 10,1371 /journal.pone.0074924
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 07.08.2013; Publisert: 11.09.2013
Copyright: © 2013 Zins et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. PREMIE prosjekt nummer~~POS=HEADCOMP: Z080347; Østerrike Wirtschaftsservice Ges.m.b.H (AWS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den ledende årsak til kreft og andre ledende årsak til kreft dødsfall hos menn [1]. Selv om screening for prostatakreft har blitt bedre, vil 10-20% av pasientene diagnostisert med lokalavansert eller metastatisk sykdom, mens andre vil gå videre til tross for kirurgi, stråling og androgen-deprivasjon terapi [2], [3]. Derfor forblir avansert prostatakreft et betydelig helsevesenet problem og identifisering av nye målrettede behandlingsformer med fokus på molekylære signalveier er viktig for å bedre terapeutisk intervensjon.
Rho GTPases som Rac, Cdc42 og RhoA signaliserer proteiner som regulerer cytoskjelettet organisasjon, cellecyklusprogresjonen, celleoverlevelse og migrasjon bidrar direkte til tumorvekst og progresjon [4]. Cdc42 spiller også en viktig rolle i kontrollen av cellevandring [5]. Rho GTPases eksistere enten som inaktive, BNP-bundet skjemaer eller aktive, GTP-bundet skjemaer som bestemmer de cellulære funksjoner i Rho GTPases [6]. Rho GTPase aktivitet kan bli påvirket av differensial aktivering av Rho GTPase regulere signalveier eller varierende mengder av Rho GTPase regulatoriske molekyler som Rho GTPase-aktive guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs) [4]. Deregulerte Rho GTPases har blitt oppdaget i ulike proliferative maligniteter, inkludert prostatakreft [4] og Rac protein uttrykk er betydelig økt i prostatakreft [7].
Rho GTPases regulere cellesyklus ved aktivering av c-Jun N -terminal kinase (JNK) og p38 mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), som fører til oppregulering av cyclin D1 [8], [9], [10]. Den Rac1 signalveien spiller også en betydelig rolle i celleoverlevelse som omfatter v-akt murin thymoma viral onkogen homolog 1 (AKT) kinase [11]. AKT i sin tur fosforylerer BCL2-forbundet agonist av celledød (BAD) [12], et proapoptotiske medlem av BCL-2-familien, nøytralisere proapoptotiske virkningene av dårlig [13]. p21 protein (Cdc42 /Rac)-aktivert kinase 1 (PAK1) er en ytterligere vesentlig nedstrøms effektor av Cdc42 og Rac1 [14], [15] i kontrollen av programmert celledød [16].
Siden siste studier har implisert avvik Rac1 og Cdc42-aktivitet i human kreft, har disse Rho GTPases blitt foreslått som anticancer mål [17], [18]. Rac1 var en av de første målene i rasjonelle medikament design tilnærminger og et lite molekyl hemmer (NSC23766) som forstyrrer samspillet av Rac1 med flere GEFs ble identifisert som bare minimalt påvirket Cdc42 aktivitet [19].
Vi var interessert i å utvikle mer potent, roman, kjemisk modifisert små molekyler til å hemme Rho GTPase aktivitet for mulig klinisk anvendelse i behandling av kreft ved hjelp av Rac1 inhibitor NSC23766 som en ledende struktur for sammensatte konstruksjon [19]. Vi rapporterer nå identifisering og biologisk aktivitet av AZA1, en roman dual Rac1 og Cdc42 hemmende stoff som hemmer kreft vekst prostata effektivt i en human prostatakreft xenograft modell.
Materialer og metoder
Cellelinjer
human androgen-uavhengig prostatacancerceller 22Rv1 (CRL-2505), PC-3 (CRL-1435) og DU 145 (HTB-81) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, PAA, Pasching, Østerrike) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS; PAA), 0,1 M ikke-essensielle aminosyrer, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellelinjer ble testet for autentisitet ved hjelp STR-PCR (PowerPlex 16 HS System, Promega, Madison, WI).
Compound generasjon
Basert på tilgjengelige strukturell og funksjonell informasjon om Rac1-GEF Vekselvirkningen mellom Rac1 inhibitorforbindelsen NSC23766 [19] og benytte en virtuell screeningstrategi ved hjelp av ZINC databasen [20], genererte vi 21 kjemisk forskjellige potensielle Rac-inhiberende forbindelse formler, som deretter ble syntetisert ved SPECS (Delft, Nederland). Deretter ble alle syntetiserte forbindelser testet
in vitro
av løselighet undersøkelse, aktiveringsanalyser og mitokondriell toksisitet analyser (WST-1) som beskrevet nedenfor.
Rac1, Cdc42 og RhoA aktiveringsanalyser
prostatakreft-celler ble sådd ut i 6-brønns plater og sultet i 24 timer. Celler ble inkubert med lite molekyl-inhibitor AZA1 20 uM i 60 minutter og deretter stimulert med 50 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF; R MKI67) antistoff (tumor spredning analyse, Dako, Glostrup, Danmark ) [22], [23]. Primære antistoffer ble detektert ved sekvensiell inkubasjon med passende biotinylerte sekundære antistoffer (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og peroksidase konjugert streptavidin (Dako), utviklet med 3, 3′-diaminobenzidin (Vector Laboratories), motfarget med haemalum, dehydratisert og montert i DPX (Merck, Darmstadt, Tyskland) og digitalisert bildene ble generert.
Analyse av effektene av sammensatte AZA1 på overlevelse
overlevelse studien ble satt i tre måneder. Mus som bærer 22Rv1 xenotransplantater ble behandlet med forbindelsen AZA1 på 2 uker (
n
= 10) eller 30% DMSO (
n
= 10) som beskrevet ovenfor. Dyrene ble avlivet da de var døende.
Statistisk analyse
Data ble testet for normalitet hjelp av Shapiro-Wilk test. Gruppene ble sammenlignet med parametrisk variansanalyse (ANOVA, Wilcoxon rank sum test, Kruskal-Wallis test). Alle statistiske tester var tosidig. De totale overlevelseskurver etter behandling ble analysert av Kaplan-Meier overlevelses test. Statistiske tester ble utført med SAS (versjon 9.1.3) og Enterprise Guide (versjon 4.1, SAS Institute Inc., Cary, NC). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
P
verdier 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
AZA1 behandling hemmer Rac1 og Cdc42 aktivitet i prostatakreftceller
En
in vitro
skjerm av lavmolekylære inhibitorer basert på modifikasjoner av NSC23766 å identifisere dual-hemmende forbindelse aktivitet identifiseres strukturen N * 2 *, N * 4 * -bis- (2-metyl-1H-indol-5-vl ) -pyrimidin-2,4-diamin (AZA1) (figur 1) for å ha sterk inhibitorisk aktivitet (Text S1, Tabell S1, figur S1 og S2). Opprinnelig ble Rac1 aktivering i 22Rv1 prostata cellelysater følgende stimulering med EGF undersøkt i screeningforsøk. Aktivering av EGF reseptor (EGF-R) spiller en sentral rolle i spredning og invasjonen av prostatakreft, og utgjør derfor en patologisk relevant faktor for analyse av prostatakreft vekst i 22Rv1 modell [24]. Aktiviteten av Rac1 var oppregulert i løpet tredelt etter stimulering av 22Rv1 prostatakreftceller med EGF når sammenlignet med ubehandlede celler. Den mest effektive Rac1 hemmer identifisert var AZA1 (tabell S1). Behandling av 22Rv1 humane prostatakreftceller med 5, 10 eller 20 uM AZA1 i 60 min doseavhengig redusert Rac1 aktivitet signifikant med 45% (p 0,022), 70,4% (p 0,004) og 85,7% (p 0,002), henholdsvis, sammenlignet med 20 mikrometer NSC23766 (figur 2A venstre panel). AZA1 (20 mm) også signifikant nedregulert Rac1 aktivitet i DU 145 og PC-3 prostata cellelinjer med 86,8% (p 0,006) og 89,9% (p 0,001), henholdsvis (panel figur 2A høyre). I tillegg AZA1 behandling av 22Rv1 ved 2, 5, 10 eller 20 uM trykkes Cdc42-aktivitet med 54% (p 0,02), 65,4% (p 0,01), 81,6% (p 0,002) og 90,3% (p 0,001), henholdsvis (figur 2B venstre panel). AZA1 (20 mm) også signifikant nedregulert Cdc42 aktivitet i DU 145 og PC-3 prostata cellelinjer med 71,1% (p 0,0015) og 86% (p 0,007), henholdsvis (panel figur 2B høyre). I motsetning til dette AZA1 behandling (20 uM) forårsaket ingen suppresjon av RhoA aktivitet (figur 2C). Disse resultatene indikerer at AZA1 spesifikt og signifikant nedregulerer Rac1 og Cdc42 aktivitet i 22Rv1, DU 145 og PC-3 human prostatacellelinjer.
(N * 2 *, N * 4 * -bis- ( 2-metyl-1H-indol-5-yl) -pyrimidin-2,4-diamin).
A, B Rac1, Cdc42 og C, RhoA aktivering i 22Rv1, DU145 og PC3 prostatakreft celler etter inkubering (60 min) med forskjellige konsentrasjoner av forbindelse AZA1 og stimulering med 50 ng /ml EGF. Hjelp av tre uavhengige eksperimenter er vist. * Signifikant forskjellig fra EGF.
AZA1 blokkerer spredning av menneskelige prostata kreft celler
Vi deretter analysert virkningene av AZA1 på cellulær proliferasjon og apoptose i målcellene. Behandling av ustimulerte 22Rv1 celler med AZA1 doseavhengig betydelig redusert celledeling etter 72 timers inkubering med 2, 5 eller 10 um (p 0,001) AZA1 sammenlignet med kontrollceller (figur 3A, venstre panel). For å analysere om AZA1 kan også redusere cellulær proliferasjon i EGF stimulerte celler, behandlet vi EGF-stimulert prostata kreft celler med AZA1. Behandling med 50 ng /ml EGF øket 22Rv1 (p 0,05, figur 3A, høyre panel), og litt økt DU 145 og PC-3 (figur S3) cellulær proliferasjon. AZA1 behandling doseavhengig, betydelig redusert cellulær proliferasjon etter 72 timers inkubering med 2, 5 eller 10 mM (p 0,001) AZA1 i forhold til EGF-stimulert og ubehandlet 22Rv1 (figur 3A, høyre panel), DU 145 og PC-3- -celler (figur S3).
A, relativ tetthet av kreftceller opptil 72 timer etter behandling med 2, 5, og 10 uM forbindelse AZA1 i ustimulerte (venstre panel) eller EGF-stimulert (høyre panel) cancer -celler ble målt ved bruk av WST-1-celleproliferasjonsanalyse. AZA1 undertrykker 22Rv1 prostatacancer celleproliferasjon i både ikke-stimulerte og EGF-stimulerte kreftceller på en doseavhengig måte. Hjelp av tre uavhengige eksperimenter er vist. * Signifikant forskjellig fra kontroll (venstre panel) og fra kontroll og EGF-stimulerte celler (høyre panel); +, Signifikant forskjellig fra kontrollen (høyre panel) ;. B, representant flowcytometri histogrammer som viser cellepopulasjoner i sub- G
0 /G
1, G
0 /G
1, S og G
2 /
M faser. 22Rv1 celler ble inkubert med 10 pM AZA1 i 24 timer. Kontrollceller mottok ingen behandling. Cellulært DNA-innhold ble analysert ved flow-cytometri etter farging med propidiumjodid. C, Cyclin D1 uttrykk. Representative strømningscytometri-analyse og kvantifisering av fluorescens-intensitet i 22Rv1-celler ble behandlet med 10 uM AZA1 i 60 min (rød histogram) sammenlignet med ubehandlede celler (fet linje) og isotype kontroller (tynn linje). Forbindelse behandling redusert cyclin D1 nivåer. * Signifikant forskjellig vs. kontroll.
Neste vi analyserte cellesyklus distribusjon følgende AZA1 behandling. 22Rv1 celler ble delt inn i sub G
0 /G
1, G
0 /G
1, S og G
2 /M faser. Under G
0 /G
1 befolkningen ble brukt til å beregne apoptose. Figur 3B viser et representativt sett av data fra ubehandlede og behandlede AZA1-22Rv1 celler. 22Rv1 celler behandlet med 10 uM AZA1 i 24 timer viste en økning i den under G
0 /G
en fase fra 1,47% til 26,9% (± 2,78; P 0,05) og en reduksjon i G
2 /M-fasene fra 32,25% til 20,30% (± 3,56; P 0,05) i cellene behandlet med 10 uM AZA1, hvilket antyder inhibering av cellulær proliferasjon og en økning i antall av apoptotiske arrangementer. Vi testet da effekten av AZA1 på cellesyklusen regulatorisk protein Cyclin D1. I cellelysatene ble behandlet med 10 uM AZA1 i 60 minutter, ble redusert Cyclin D1 fluorescensintensitet signifikant med 22% ± 4,2% (p 0,001) sammenlignet med ubehandlede kontroller representativt vist i figur 3C. Disse resultatene indikerer en rolle for AZA1 i blokkering Rac1 og Cdc42-avhengige celle syklus hendelser i 22Rv1 prostatakreftceller og induksjon av apoptose.
AZA1 hemmer kreft celle migrasjon
Aktiv migrering av tumorceller er en forutsetning for tumorprogresjon og metastase og rapporter viser at EGF-indusert kreft celle migrasjon kan hemmes ved å undertrykke Cdc42 /Rac1 signalveier [25]. Således undersøkte vi effekten av AZA1 på migrering av EGF-stimulert 22Rv1, DU-145 og PC-3-celler i Transwell-analyser. EGF-stimulering betydelig økt kreftcellemigrasjon i 22Rv1 (figur 4A), DU 145 og PC-3 (figur S4A) celler (p 0,001). Behandling av celler med to mikrometer AZA1 for 24 timer betydelig reduserte kreftcellemigrasjon ved 59,6 ± 12% (22Rv1 celler; p 0,001; figur 4A), 56,8 ± 18,8% (DU 145 celler; p 0,001; figur S4A) og 57,3 ± 16,1% (PC-3 celler; p 0,001; figur S4A). forhold til EGF-stimulert kreftceller
A, Representative bilder av migrert prostata kreft celler fra en
in vitro
migrasjon analyse er vist. 22Rv1 prostata kreft celler ble stimulert med 50 ng /ml EGF og ble behandlet med 2, 5 eller 10 uM AZA1 i 24 t og migrerte kreft celler kvantifiseres deretter i
in vitro
migrasjons analyser. Data ble samlet inn fra fem individuelle sammenhengende synsfelt (40x) fra tre replikate Boyden kamre. * Signifikant forskjellig fra kontroll; +, Signifikant forskjellig fra kontroll og EGF-stimulerte celler. B, Effekt av AZA1 behandling på lamellipodia og filopodia formasjon. 22Rv1 prostatakreftceller ble platet ut på cellekulturkamre, stimulert med 50 ng /ml EGF og inkubert med 5 og 10 um AZA1 i 24 timer. Paraformaldehyde faste celler ble farget med Atto-488 phalloidin (F-aktin, grønn) for å oppdage polymerisert aktin cytoskjelettet, filopodia og lamellipodia og kontra med DAPI (blå) og fotografert (forstørrelse, x1000). Arrow hodet indikerer filopodia, pil viser lamellipodia. Tallene for filopodia og lamellipodia per celle ble kalkulert fra 25 cellene i hver gruppe. AZA1 fører til endringer i mobilnettet morfologi og undertrykker filopodia og lamellipodia formasjon. * Signifikant forskjellig fra kontroller; +, Signifikant forskjellig fra kontroller og EGF-stimulerte celler; ‡, signifikant forskjellig fra EGF-stimulerte celler. Co, kontroll. C, Effekt av AZA1 på aktin dynamikk. Uttrykk for F-aktin og G-aktin i 22Rv1, DU 145 og PC-3 celler analysert ved immunoblotting (F-aktin /G-aktin ratio). Barer representerer F /G aktin gjennomsnitt ± SD. * Signifikant forskjellig fra kontroll av den respektive cellelinje; +, Signifikant forskjellig fra kontroller og EGF-stimulerte celler av den respektive cellelinje.
Behandling med 2 uM AZA1 også redusert kreftcellemigrering i alle tre cellelinjene når sammenlignet med kontrollceller uten EGF-stimulering ved 40,2 ± 12,1% (22Rv1 celler; p 0,01; figur 4A), 20,2 ± 8,9% (DU 145 celler; p 0,04, figur S4A), og 24,9 ± 16,1% (PC-3 celler; p 0,05; Figur S4A), henholdsvis i forhold til EGF-stimulert kreftceller
Behandling av celler med fem mikrometer og 10 mikrometer AZA1 ytterligere redusert migrasjon med 72,1% og 79,1% (p. 0,001) i 22Rv1 celler, med 72,4% og 91,4% (p 0,001) i DU-145-celler, og med 60,9% og 74,7% (p 0,001), PC-3-celler, respektivt, sammenlignet med EGF-stimulerte celler (figurene 4A og fig S4A). Disse resultatene indikerer en rolle for AZA1 i blokkering Rac1 og Cdc42 avhengig migrasjon av 22Rv1, DU 145 og PC-3 prostatakreftceller.
AZA1 reduserer lamellipodia og filopodia dannelse og reduserer F /G-aktin ratio
Cdc42 og Rac1 er også avgjørende i dannelsen av filopodia og lamellipodia, som er viktig i invasjonen av kreftceller [26]. Vi undersøkte derfor effekten av AZA1 på cellemorfologi hjelp phalloidin farging av 22Rv1, DU 145 og PC-3 celler som spesifikt flekker polymerisert aktin cytoskjelettet. Morfologisk, antall 22Rv1 lamellipodia og filopodia økt betydelig på EGF-stimulering (p 0,04, figur 4B). Behandling med AZA1 på 5 og 10 mikrometer resulterte i betydelig redusert lamellipodia (p 0,01) og filopodia (p 0,01) dannelse i 22Rv1 prostatakreftceller etter 24 timer i forhold til EGF-stimulert celler (figur 4B)
I DU 145 celler, mens mange filopodia er observert at økningen følgende EGF-stimulering, nesten ingen lamellipodia er synlige. I likhet med effekten på 22Rv1 celler, behandling med AZA1 på 5 og 10 mikrometer førte til dramatisk redusert filopodia formasjonen i DU 145 prostatakreftceller etter 24 timer i forhold til EGF-stimulert celler (Figur S4B, øvre tre paneler). I PC-3 celler, både lamellipodia og filopodia dannelse skjedde i kontroll og EGF-stimulert celler. Etter behandling med AZA1 (5 og 10 mm), lamellipodia var nesten umulig å oppdage og cellene utviklet en mer avrundet morfologi. Filopodia var fortsatt observert etter fem mikrometer AZA1 behandling, selv ble redusert til 10 mikrometer AZA1 (Figur S4B, lavere tre paneler).
Derfor AZA1 hemmet lamellipodia og filopodia formasjon i prostatakreftceller, viser forskjellig grad av undertrykkelse avhengig av kreftcelletype. Disse dataene indikerer en direkte regulerende effekt av Rac1 /Cdc42 aktivitet på lamellipodia og filopodia forlengelse i alle testede cellelinjer som kan bli berørt av AZA1 behandling. Sammen utgjør disse dataene indikerer en bestemt rolle for AZA1 i begrenser Rac1 /Cdc42-mediert celle morfologi.
Neste vi undersøkte F- og G-aktin innholdet i prostata kreft celler til å avgjøre om AZA1 kan påvirke dynamisk aktin omorganisering . AZA1 redusert lamellipodia og filopodia dannelse og redusert kreftcelle migrasjon. Siden Cdc42 og Rac er kjent for å spille viktige roller i aktin omleiring, hvilket er en forutsetning i disse prosessene [28], evaluerte vi virkningen av Rac1 /Cdc42 inhibering på forholdet mellom Rac1 og Cdc42 aktivitet og dynamisk omorganisering av aktin skjelettet. Immunoblotting analyser av F- og G-aktin fraksjoner viste at den relative ekspresjonsnivået av F-aktin /G-aktin var signifikant høyere i EGF-stimulert 22Rv1, DU-145 og PC-3 prostata kreft celler sammenlignet med kontrollceller (p 0.05, figur 4C). Behandling med AZA1 ved 2, 5 og 10 uM betydelig redusert relative uttrykk forholdet mellom F til G-aktin i alle tre cellelinjer etter 24 timer sammenlignet med EGF-stimulerte kreftceller (p 0,01; figur 4C) og kontrollceller ( p 0,05;.. Figur 4C)
Disse funnene tyder på at lamellipodia og filopodia formasjon i prostatakreftceller er assosiert med omorganiseringen av aktin filamenter og at denne prosessen blir påvirket av AZA1 behandling
AZA1 nedregulerer den PAK signalveien
Gruppe i p21-aktiverte kinaser (PAK) er viktige effektorer av de små GTPases Rac og Cdc42 som regulerer cellemigrasjon, overlevelse og spredning [27], [29]. PAK regulerer også Rac-mediert lamellipodia forlengelse, migrasjon og invasjon av kreftceller [27]. For å analysere signalveier som kan medierer effektene av AZA1 mediert Rac1 /Cdc42 inhibering, undersøkte vi aktiviteten av den nedstrøms effektor PAK ved å evaluere PAK fosforylering i EGF-stimulerte cancerceller følgende AZA1 behandling. Dataene viser at PAK1 /2 fosforylering ved serin 144/141, som opprettholder den katalytiske aktiviteten til Paks [30], ble doseavhengig redusert betydelig med 46,9 ± 19,1% (2 uM), 55,5 ± 18,4% (5 uM) og 85 ± 14,3% (10 pM) (s 0,04) på AZA1 behandling i 22Rv1 celler sammenlignet EGF-stimulerte celler (figur 5). Tilsvarende PAK1 /2 fosforylering på serin 144/141 ble også doseavhengig og betydelig redusert til 52,4 ± 15,1% (p 0,05) og 48,1 ± 11,5% (p 0,04) henholdsvis, på AZA1 behandling av EGF-stimulert DU 145 og PC-3 celler (figur S5), noe som indikerer at Rac1 /Cdc42 hemming blokkerer PAK1 signalveien i disse prostatakreftceller. PAK1 protein nivåer ble ikke påvirket av AZA1 behandling (data ikke vist). Disse funnene tyder på at AZA1 påvirker cellemotilitet og aktin omorganisering i prostatakreftceller ved å undertrykke Rac1 og Cdc42 aktivitet via PAK1 /2 fosforylering.
Analyse av PAK, AKT og BAD-fosforylering i EGF-stimulert 22Rv1 prostatakreftceller følgende AZA1 behandling. Representative Western blot bilder og kvantifisering av immunoblotter farget med fosfor-PAK1 /2 (pPAK), fosfo-AKT (Pakt) og fosfo-BAD (pBAD) antistoffer før og etter behandling med 2, 5 og 10 mikrometer AZA1 i 24 timer. Rac1 /Cdc42 blokade reduserer fosforylering av PAK1, AKT og dårlig i 22Rv1 prostatakreftceller sammenlignet med kontroller (hjelp av 3 uavhengige eksperimenter). * Signifikant forskjellig fra ikke-stimulerte og ubehandlede kontroller; +, Signifikant forskjellig fra EGF-stimulert kontroll; ‡, signifikant forskjellig fra ikke-stimulert, ubehandlet kontroll og EGF-stimulert kontroll. SP, bestemt protein; LC, lasting kontroll.
AZA1 nedregulerer den AKT signalveien og reduserer BAD fosforylering
For å identifisere ytterligere nedstrøms Rac1 /Cdc42 kandidater berørt av AZA1 behandling, analyserte vi AKT og MAPK aktivitet ved anvendelse av fosfo-spesifikke antistoffer. AKT og ERK aktiviteter har blitt redusert med reduksjon av PAK1 uttrykk som fører til redusert celleproliferasjon, migrasjon /invasjon og overlevelse i tykktarm kreft [28]. Videre har AKT-signalveien er vist å være involvert i sykdomsprogresjon og overgang til androgen-uavhengig sykdom [31].
Vi fant at Rac1 /Cdc42 inhibering av AZA1 i 24 timer førte til en betydelig doseavhengig inhibering av fosfo-AKT nivåer ved 20,8% (2 uM), 39,3% (5 mm) og 62,5% (10 pM) (p 0,05) etter AZA1 behandling av EGF-stimulert 22Rv1-celler (figur 5). I motsetning til dette, AZA1 behandling forårsaket ingen endring i fosforylering av potensialet Rac1 effektorer ERK, JNK og p38 (data ikke vist), noe som indikerer at aktivering av disse MAPK banene ikke påvirkes av Rac1 og Cdc42 inhibering i 22Rv1 prostatakreftceller.
