Abstract
nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) spiller en viktig rolle i cellulære bioenergi. Det er ansvarlig for konvertering av nikotinamid til nikotinamidadenindinukleotid, en essensiell molekyl i cellulær metabolisme. NAMPT har blitt grundig studert det siste tiåret på grunn av sin rolle som en viktig regulator av nikotinamidadenindinukleotid krevende enzymer. NAMPT er også kjent som et potensielt mål for terapeutisk intervensjon på grunn av dens involvering i sykdom. I denne studien brukte vi en global massespektrometri-baserte metabolomic tilnærming for å undersøke effektene av FK866, et lite molekyl hemmer av NAMPT for tiden i kliniske studier på metabolske forstyrrelser i humane kreftceller. Vi behandlet A2780 (ovariekreft) og HCT-116 (tykktarmskreft) cellelinjer med FK866 i nærvær og fravær av nikotinsyre. Det ble ikke observert signifikante endringer i aminosyrer metabolisme og purin og pyrimidin metabolisme. Vi har også observert metabolske endringer i glykolysen, sitronsyresyklusen (TCA), og pentosen fosfat pathway. Å utvide omfanget av de oppdagede polare metabolitter og forbedre data tillit, søkte vi en global metabolomics profileringsplattform ved å bruke både ikke-målrettede og målrettet hydrofil (HILIC) -LC-MS og GC-MS analyse. Vi brukte Oppfinnsomhet Knowledge Base for å lette projeksjonen av metabolomics data på stoffskifte. Flere metabolske veier viste differensial svar på FK866 basert på flere kamper til listen over kommenterte metabolitter. Denne studien tyder på at globale metabolomics kan være et nyttig verktøy i farmakologiske studier av virkningsmekanismen til narkotika på cellenivå
Citation. Tolstikov V, Nikolajev A, Dong S, Zhao G, Kuo MS (2014 ) Metabolomics Analyse av metabolske effekter av nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) Hemming på humane kreftceller. PLoS ONE 9 (12): e114019. doi: 10,1371 /journal.pone.0114019
Redaktør: Ramón Campos-Olivas, spansk National Cancer Center, Spania
mottatt: 24 februar 2014; Godkjent: 04.11.2014; Publisert: 08.12.2014
Copyright: © 2014 Tolstikov et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Eli Lilly and Company. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfattere er ansatte i Eli Lilly and Company, og som sådan, har overbevisninger, eller økonomiske engasjement med Eli Lilly and Company. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Som en videreføring av en tidligere studie på den farmakologiske hemming av nikotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) beskriver metabolske grunnlag av NAMPT hemming [1], rapporterer vi her resultatene av en global metabolomics analyser som avslørte de metabolske endringer av NAMPT hemming i humane kreftceller. Den nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) kofaktor er viktig for en rekke cellulære prosesser. Hos pattedyr, kan NAD syntetiseres fra nikotinamid, nikotinsyre, eller tryptofan [2] – [5]. In vivo konsentrasjon av nikotinsyre er lav på grunn av dets hurtige utskillelse og metabolisme, noe som tyder på at utnyttelsen av nikotinsyre for NAD biosyntesen i forhold til nikotinamid er begrenset i pattedyr [3]. De novo biosyntese av NAD fra tryptofan forekommer hovedsakelig i leveren [4]. Derfor er to-trinns salvage pathway som konverterer nikotinamid til NAD representerer den hovedvei til NAD biosyntese i pattedyr [6] – [8]. NAMPT, opprinnelig identifisert som en pre-B-cellekolonifremmende faktor [9], er det hastighetsbegrensende enzym som katalyserer det første trinn i biosyntesen av NAD fra nikotinamid [10], [11]. Nylige studier har vist at NAMPT-mediert NAD-biosyntese i kreftceller spiller en avgjørende rolle i en rekke fysiologiske prosesser, herunder metabolisme, energiproduksjon, overlevelse, apoptose, DNA-reparasjon, og inflammasjon [2], [12] – [14]. Det ble demonstrert at NAMPT er overuttrykt i flere typer tumorer, inkludert bryst-, kolorektal, gastrisk, lunge, prostata og andre karsinomer [15] – [18], og dets ekspresjon synes å være assosiert med tumorprogresjon [19]. I cellen, er NAMPT rikelig i cytosol og til stede i kjernen. Det har vært tilstrekkelig opplyst at NAD omsetning i kreft eller prolifererende celler betydelig økt sammenliknet sunn eller ikke-voksende celler [1], [7]. Disse observasjoner på mulige involvering av NAMPT i sykdom har nå blitt støttet av ulike tilnærminger i kreftceller studier [10] – [14]. Nedregulering av NAMPT hemmer tumorcellevekst in vitro og in vivo og sensitizes celler mot oksidativt stress og DNA-skadende midler [8], [15], [18], [20] – [22]. Inhiberingen av NAMPT fører også til dempningen av tumorvekst og induksjon av apoptose på grunn av NAD uttømming [8], [21] – [24]. Tatt sammen, eksemplifiserer NAMPT et lovende terapeutisk mål for utviklingen av nye potensielle kreftlegemidler.
NAD er et substrat for dehydrogenaser, poly (ADP-ribose) polymeraser, sirtuins, mono (ADP-ribosyl) transferaser, og ADP-ribosyl cyclases [2], [4], [12]. I de fleste kreftceller, poly (ADP-ribose) polymerase, en nøkkel protein som er nødvendig for DNA-reparasjon som også er involvert i apoptose, blir aktivert på grunn av skade på DNA og genom ustabilitet [2], [25] – [27]. Aktiviseringen av poly (ADP-ribose) polymerase fører til NAD uttømming i kreftceller [2], [8], [25] – [27]. Som et resultat av den nedregulering av NAMPT sensitizes kreftceller til DNA-skadende midler og apoptose [10], [21]. Tilsvarende SiR2 protein fungerer også som en nøkkel nedstrøms effektor av NAMPT som regulerer en rekke forskjellige cellulære funksjoner, inkludert overlevelse og inflammasjon [28] – [30]. Nylige studier har vist at proteiner SiR2 regulere cytokinproduksjon [30], som i sin tur reduserer NAD-nivået gjennom hemming av NAMPT. Videre har en NAMPT inhibitor vist anti-inflammatorisk virkning i dyremodeller av inflammasjon [20], [30]. Til slutt, nøkkelen virkningsmekanismen av NAMPT hemming er blokaden av glykolyse ved glyceraldehydes-3-fosfat-dehydrogenase trinn ansvarlige for adenosin trifosfat (ATP) utarming, metabolsk forstyrrelse, og påfølgende tumorvekst-inhibering [1]. Men hvor modulere NAMPT aktivitet i kreftceller påvirker cellulær metabolisme, utenom energimetabolismen som tidligere rapportert [1], er ukjent. FK866, et lite molekyl inhibitor av NAMPT, har vært gjenstand for omfattende studier [2], [21], [31]. Molekylet har blitt co-krystallisert med og funnet å være bundet til den nikotinamid bindende lomme av NAMPT, for derved å demonstrere sin mekanisme som en konkurrerende inhibitor av NAMPT med hensyn til nikotinamid [32]. Flere studier antyder også at FK866 hemmer spesifikt NAMPT i cellen, og oppviser antitumoraktivitet i prekliniske tumormodeller [11], [14], [20], [30], [32] – [35]. Således synes FK866 for å være et ideelt verktøy molekyl for å vurdere den fysiologiske funksjon av NAMPT i cellen. I denne studien ønsket vi å vurdere ytterligere de globale virkningene av NAMPT hemming av FK866 på kreft metabolismen ved hjelp av global massespektrometri-baserte metabolske profilering. Vi har valgt to humane kreftcellelinjer som er forskjellige i måten de bruker nikotinsyre og nikotinamid for NAD dannelse, forutsatt at tilsetningen av nikotinsyre i vekstmediet kan avskaffe NAMPT inhibering i en cellelinje, men ikke i den andre. Vi har funnet at inhibering av NAMPT av FK866 resulterer i endring av tallrike metabolske veier langt utover energimetabolisme. Derfor er den globale massespektrometri-baserte metabolske profilering tilnærming et nyttig verktøy for mekanistiske studier av narkotika handlinger og for å identifisere potensielle farmakodynamikk markører.
Materialer og metoder
Studiedesign
Hver av to cellelinjer ble behandlet med 5 og 50 nM av FK866 (i 0,1% DMSO) og 0,1% DMSO med eller uten nikotinsyre (10 mM) i 24 timer. Hver gruppe ble drevet med 6 biologiske replikater. Cellelinjer som ikke ble behandlet med narkotika og nikotinsyre fungerte som kontroller.
kreft celler
A2780 (NCI DCTD), en eggstokkreft cellelinje, og HCT-116 (ATCC), en kolorektal kreft cellelinje, ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen 30-2001) og McCoys 5a (Hyclone SH30200), henholdsvis, i nærvær av 10% FBS. Celler ble sådd ut i en 6-brønners kulturplate i en tetthet på 1,0 x 10
6-celler per brønn og inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 i 24 timer og deretter behandlet med FK866 i DMSO ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. FK866 ble syntetisert som tidligere beskrevet [36], [37]. Som en del av studiedesign ble cellene også dyrket og behandlet med nikotinsyre (10 mm) og FK866 i 24 timer før innhøstingen. Celleviabilitet ble vurdert ved å måle totalt proteininnhold ved hjelp av en CytoScan SRB Cvtotoksisitetsmålinq Kit (Cat No. 786-213;. G-biovitenskap, St. Louis, MO). Etter 24 timers behandling, ble mediet fjernet og pre-kjølt ved -20 ° C; Deretter ble 500 ul av 80% metanol tilsatt til hver brønn. Cellene ble skrapet og oppsamlet ved -20 ° C i 1,5 ml Eppendorf-rør. Etter 60 minutter ble de Eppendorf rør sentrifugeres i 5 minutter ved 14.000 omdreininger i minuttet og plasseres supernatanten til nye rør for videre analyse.
Metabolomics Analyse
Analyser ble utført ved hjelp av ikke-målrettede og målrettet protokoller ved hjelp av GC-TOF-HRMS, hydrofile (HILIC) -LC-HRMS og HILIC-LC-MS /MS instrumenter implementere tidligere rapportert metode [38] – [40]. En standard kvalitetskontroll (QC) prøve inneholdende en blanding av aminosyrer og organiske syrer ble injisert daglig for å overvåke massespektrometer respons. Den sammenslåtte QC prøve ble oppnådd ved å ta en prøve av det samme volum av alle prøver fra studien. Den sammenslåtte QC prøve ble injisert daglig med en batch av prøvene analysert, og ble anvendt for å bestemme den optimale fortynning av satsen prøvene og å validere metabolitt identifikasjon og toppintegrering (S1-fil). Supernatanter av celleekstrakter ble delt inn i tre deler: 75 ul for GC-TOF-MS-analyse, 175 ul for HILIC-LC /MS-analyse, og 175 pl for HILIC-LC /MS /MS-analyse
. Eksempel Derivatisering og GC-TOF-HRMS analyse
ekstrakter ble tørket ved hjelp speedvac konsentrator Savant DNA120 (ThermoScientific, San Jose, California) med badetemperaturen satt under 30 ° C. Pre-kjølte prøver ble ytterligere tørket over en time med en Free-Zone lyofiliseringsanordning (Labconco, Kansas City, MO). Tørkede prøve derivatisering med metoksylamin-hydroklorid i pyridin og N-metyl-N-trimetylsilyltrifluoracetamid ble utført som beskrevet av Tong et al. [37]. Gasskromatografi ble utført ved hjelp av en Agilent 7890A gasskromatograf (Agilent, Palo Alto, California) tilkobles en høyoppløselig time-of-flight Pegasus GC-HRT massespektrometer (Leco, St. Joseph, MI). Automatiserte injeksjoner ble utført ved hjelp av en MPS2 programmerbar robot flerbruks sampler (Gerstel, Muhlheim an der Ruhr, Tyskland). GC-systemet var utstyrt med en Gerstel temperatur-programmert injektor, avkjølt injeksjonssystem (modell CIS 4). En automatisert foring utveksling (ALEX) (Gerstel) ble anvendt for å eliminere kryssforurensning fra prøven matrise som var oppstått mellom prøve kjøringer. Flere deaktiverte forsynt med ledeplater Foringene for GC-inntak ble anvendt. Den Gerstel injektor ble programmert for den følgende sekvens: initial temperatur 50 ° C, hold i 0,1 minutt, øker temperaturen i en hastighet på 10 ° Cs-en til en slutt-temperatur på 330 ° C, og hold tid 15 minutter). Injeksjoner av 1 pl ble tatt opp i splitless-modus. Kromatografi ble utført på en RTX-5Sil MS-kolonne (lengde 30 m; ID: 0,25 mm; df: 0,25 um) med en Integra-Guard-kolonne (Restek, Bellefonte, PA). Helium bæregass ble anvendt ved en konstant strøm på 1 ml min-1. GC-ovnen ble temperaturen programmert til den følgende sekvens: 50 ° C begynnelsestemperatur med en 1-minutts hold tid og deretter gradvis ved 10 ° C per minutt til en temperatur på 140 ° C, og deretter gradvis ved 4 ° C per minutt til en temperatur på 240 ° C, og deretter gradvis ved 10 ° C per minutt til en temperatur på 300 ° C med en 8-minutters holdetid. Både overføringsledningen og kilde temperaturer var 250 ° C. Ion kilde operert ved -70 kV filament spenning. Etter en forsinkelse løsningsmiddel av 500 sekunder, ble massespektra kjøpt til 2,4 spektra per sekund med en utvinning frekvens på 2 kHz og en masse spekter av 60-520 m /z. Oppløsning ble satt til 25 K. Mass nøyaktighet ble kontrollert med PFTBA innstiller på en sub-ppm nivå under hele driftstiden. Standard QCs og samleprøve QCs ble brukt til å overvåke GC-TOF-HRMS datafangst (S1 File) [41] – [43]. Massespektrometer kalibrering ble utført på daglig basis ved hjelp av leverandør protokollen. Mass nøyaktighet ble rutinemessig opprettholdt i en sub-ppm nivå med en oppløsning på 30 til 40 K. Dataanalyse ble utført med selger programvare ChromaTof (LECO, St. Joseph, MI) og AnalyzerPro (SpectralWorks Ltd, Runcorn, UK) ved hjelp av den nyeste NIST-MS database (https://chemdata.nist.gov/).
HILIC-LC-MS /MS analyse
ekstrakter ble brukt uten ytterligere derivatisering. HILIC-LC-MS /MS datainnsamling og prosessering ble overvåket ved hjelp av standard QCs [42], [43] og samleprøve QCs (S1 fil). Væskekromatografi ble utført ved hjelp av NEXERA UPLC system (Shimadzu, Columbia, MD) kombinert med Triple Quad 5500 System (AB Sciex, Framingham, MA). HILIC separasjoner ble oppnådd ved anvendelse av en polyamin-bundet polymer-gel-kolonne (apHera NH2 Polymer) med en 150 x 2 mm, 5 um partikkelstørrelse, som er utstyrt med en beskyttelseskolonne (apHera NH2 Polymer) med en 10 x 2 mm, 5 um partikkelstørrelse (Supelco, Bellefonte, PA). De mobile fasene var acetonitril (A) og 50 mM ammoniumbikarbonat (pH 9,4, justert med ammoniumhydroksyd) (B) ved strømningshastigheter på 0,25 ml /min ved 30 ° C. Etter tre minutters isokratisk kjøre på 15% B, ble en gradient til 30% B avsluttet ved 12 minutter og en gradient til 60% B ble avsluttet 15 minutter. Etter det ble en gradient til 75% B avsluttet ved 21 minutter og en gradient til 98% B ble gjennomført på 22 minutter. Etter kolonne vask, ble kjøringen avsluttet med 98% B på 29 minutter. Kolonne likevekt med en start buffer tok 6 minutter før neste injeksjon. Datainnsamlingen ble utført ved hjelp av planlagte MRMs. Total liste inneholdt mer enn 200 MRM overganger generert med autentiske standarder i positiv og i negativ modus [43] (S1 fil).
HILIC-LC-HRMS analyse
Ekstrakter ble brukt uten ytterligere derivatisering. Standardene QCs og samleprøve QCs ble brukt til å overvåke HILIC-LC-HRMS datainnsamling som tidligere beskrevet (S1 File) [42] – [44]. Væskekromatografi ble utført ved hjelp av WATERS UPLC system (Waters, Milford, MA) kombinert med Triple TOF 5600 System (AB Sciex). HILIC separasjoner ble oppnådd ved å bruke de ovenfor beskrevne protokoller. Informasjons Dependent Acquisition eksperiment ble brukt for datainnhenting i løpet av 70 til 800 m /z masse området for positive og negative ioner separat. Data ble behandlet ved hjelp MarkerView versjon 1.2.1-programvaren (AB Sciex). Spiking samleprøver med kommersielt tilgjengelige autentiske standarder er tillatt for identifikasjon av prøvekomponenter. Data ble samlet inn for positive og negative ioner separat i løpet av en 70 til 800 m /z masse spekter, gjennomføre forsøk beregnet på å fragmentere alle ioner som overskrider den valgte terskel, mens bruk av rullende fragmentering energi. Massespektrometer Kalibrering ble utført på daglig basis ved bruk av leverandørens protokoll for positive og negative ioner. Mass nøyaktighet ble rutinemessig opprettholdt på 5 ppm nivå med en oppløsning på 20 til 30K. Komponent identifikasjon ble oppnådd med spiking autentiske standarder når det er tilgjengelig. Ukjente komponenter ble identifisert ved hjelp av rekalibrert spektrale data med hjelp av PeakView versjon 1.2.0.3 programvare (AB Sciex). Batch rekalibrering ble utført ved bruk av tidligere identifiserte komponenter som har forskjellige masser og retensjonstider som interne standarder. Denne protokollen er tillatt for rutinen oppnåelse av en 2-5 ppm masse nøyaktighet avvik for foreldre ioner og deres fragmenter (S1 fil). METLIN (https://metlin.scripps.edu/index.php), HMDB (https://www.hmdb.ca/), MASSBANK (https://www.massbank.jp/), NIST-MS (http : //chemdata.nist.gov/), IDEOME (https://mzmatch.sourceforge.net/ideom.php), mzCloud (https://mzcloud.org/), og in-house generert HRMS og HRMS /MS databasene ble brukt for blandingen oppdraget elementær, spektrale data sammenligninger, og detaljert manuell fortolkning. Denne oppdagelsen protokollen åpnet for annotering av metabolitter, som ikke var kommersielt tilgjengelig (S1 File). Kommenterte data ble videre behandlet med MarkerView versjon 1.2.1-programvaren (AB Sciex) for å beregne metabolitten toppområdet. Uidentifiserte funksjoner ble rutinemessig ekskludert fra topp listen. HILIC-LC-HRMS data ble brukt for å klargjøre krysstale observeres under HILIC-LC-MS /MS-analyse, og den ble brukt for måling av metabolitter som hadde konsentrasjoner over lineære område under HILIC-LC-MS /MS-analyse . Det ble også brukt for oppdraget tilbakeholdelsestider for isomerer (S1 fil).
Data Processing and Statistical Analysis
GC-MS dataanalyse ved hjelp ChromaTof tillatt for topplistene generasjonen, som ble videre ekstrahert over datablad og kombinert i en hovedliste. I tillegg ble databehandling utføres med AnalyzerPro og en matrise analysator add-on ble brukt til å generere en matrise mål-bibliotek. NIST-MS-databasen ble brukt til å generere dette biblioteket. Denne protokollen resulterte i dannelsen av flere tusen egenskaper. Data ble ytterligere filtrert som beskrevet i Chan et al. [41] og Dunn et al. [42] og fusjonert med data generert med ChromaTof hjelp. Manuell kontroll og fjerning av duplikater ble utført for å danne et endelig metabolitter toppbordet identifisert og målt ved hjelp av GC-MS-metoden. Median data normalisering (rad skalering), logaritmisk transformasjon, og data skalering (Pareto) for GC-MS og LC-MS-data ble utført under anvendelse av MetaboAnalyst versjon 2,0 software [45] for å kompensere for inter- og intra-instrumental variasjon. En endelig metabolitt topp bord ble konstruert ved å flette data innhentet med alle metoder. Peak listen, generert med LC-MS /MS-metode, tjente som grunnlag for data sammenslåing og integrering (S1-fil). Duplikater introdusert med de komplementære metoder (GC-HRMS og HILIC-LC-HRMS) ble fjernet etter manuell inspeksjon. Metabolitten intensiteter fra individuelle prøver ble normalisert til proteinkonsentrasjon tilsvar før ytterligere statistisk analyse. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av univariate og multivariate metoder. MetaboAnalyst versjon 2.0 [45] og JMP versjon 11 pakker ble brukt for statistiske analyser. Analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstest ble utført for data sammenligninger mellom grupper, som er definert med studiedesign som følger: kontroll (betegnet som -NA) og behandlede celler (betegnet som + Na, 50 nM-NA, 5 nM-NA, 50 nM + NA, 5 nM + NA). Figurene inneholdende illustrasjoner av ANOVA resultatene har grafisk informasjon forklart som følger: forskjeller mellom gruppene ble ansett statistisk signifikant når p 0,05. Grand gjennomsnittet vises som en horisontal linje ligger innenfor panelet (fig. 1). Y-aksen viser normalisert, log transformert, og skalert topparealet. Eksperimentelle grupper på de ulike behandlingene ble videre klassifisert ved hjelp unsupervised hierarkisk clustering, prinsipal komponent analyse, og overvåket multivariat analyse Partial Least Squares-diskriminant analyse (S3 File).
Hotel gjennomsnittet vises som en horisontal linje ligger innenfor panel . Y-aksen viser normalisert, log transformert, og skalert topparealet. Dots representerer prøver. Gruppe mener vist som en horisontal linje innenfor boksen.
Pathway og Nettverksanalyse
Identifiserte metabolitter ble utsatt for IPA analyse (Oppfinnsomhet System, Redwood City, California). Tiltredelses antall påviste metabolitter (HMDB, pubchem, og KEGG identifiserings) ble oppført i MS Excel og importert til IPA å kartlegge de kanoniske stier og generere nettverk av samspill biologiske enheter. Data ble presentert som fold endre verdier (forholdstall) beregnet mot kontrollgruppen (betegnet som -NA). Omfattende sti og nettverksanalyser ble utført. Nedstrøms biologiske prosesser ble scoret i henhold til ontologi støtte ved hjelp av oppfinnsomhet Knowledge Base (https://www.ingenuity.com/science/knowledge-base). IPA analyse innstillinger var som følger:
Referanse sett. Oppfinnsomhet Knowledge Base (endogene kjemikalier)
Forholdet til blant annet:.. Direkte og indirekte
Har endogene kjemikalier
Filter oppsummering: Tenk bare relasjoner hvor tillit er eksperimentelt observert eller høy (forventet)
Analyse innstillingen inkludert data som samles inn fra menneskeceller
P-verdi forklaring er.. som følger: et mål på sannsynligheten for at sammenhengen mellom et sett av metabolitter i datasettet og en beslektet funksjon er på grunn av tilfeldig krets. Jo mindre p-verdi, jo mindre sannsynlig er det at foreningen er tilfeldig og mer betydnings foreningen. Generelt, p-verdier 0,05 indikerer en statistisk signifikant, ikke-tilfeldig krets. IPA bruker aktiverings z-poeng algoritme for å gjøre forutsigelser. Z-poengene algoritmen er konstruert for å fremstille enten en forutsigelse av aktivering eller inhibering (eller ingen prediksjon), så vel som for å redusere sjansen for at tilfeldige data vil generere betydelige prediksjoner.
Resultatene
for å vurdere effekten av NAMPT hemming på kreft metabolisme, brukte vi to forskjellige cellelinjer: A2780, en NARPT-negative cellelinje som bare kan utnytte NAMPT-mediert nikotinamid vei for NAD biosyntesen, og HCT-116, en NAPRT-positive celle linje som kan bruke både NAMPT-mediert nikotinamid og NAPRT-mediert nikotinsyre trasé for NAD biosyntese. Fordi HCT-116 kan bruke nikotinamid og nikotinsyre for NAD formasjon, kan tilsetningen av nikotinsyre i vekstmediet avskaffe NAMPT inhibering i HCT-116, men ikke i A2780. Derfor ble nikotinsyre brukt i denne studien å vurdere spesifisitet NAMPT hemmere.
Amino Acids Metabolism
Bruk av globale metabolomics protokoller, vi observert signifikante endringer i aminosyre metabolismen på NAMPT hemming med FK866 i begge cellelinjer, med unntak av glycin og serin metabolisme, arginin metabolisme, og histidin metabolisme (S2-S5-filer). Som vist på fig. 1, alanin og aspartat metabolisme ble betydelig påvirket. Det ble ikke observert medikament dose avhengig induserte endringer i aspartat, alanin og N-karbamoyl-aspartat nivåer. Tilsetting av nikotinsyre fullstendig avskaffet disse effektene observert i HCT-116, men ikke i A2780 (Fig. 1, S4 Fil og S5-filer), som indikerer at disse effektene skyldtes NAMPT hemming. Det er interessant at asparagin og glutamatnivåer ble ikke signifikant endret. En marginal reduksjon i glutamat og glutaminnivået i HCT-116-celler ble også observert. Økninger i treonin nivåene ble observert (S2 fil) og reversert med nikotinsyrebehandling i HCT-116-celler, som støtter tilkobling til aspartat, som er en kilde for treonin biosyntese.
Interessant nivåene av N-acetylglutamine ble forhøyet i begge cellelinjer ved behandling med FK866 og bare de effekter i HCT-116 ble reddet ved tilsetning av nikotinsyre. Lignende resultater ble oppnådd for lysin, N-acetyl-lysin, fenylalanin, tryptofan, tyrosin, leucin, isoleucin, metionin, SAM, og prolin (S3 Fil, S4 og S5 Fil filer). SAM er kjent for å delta i cystein og metionin metabolisme, arginin og prolin metabolisme, biosyntesen av aminosyrer, og i transmethyleringsreaksjoner, transsulfuration, og aminopropylation. Det ble funnet at endringer av SAM nivåer er påfallende lik endringer i aspartat nivåer (S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer). Til slutt, NAMPT hemming også fører til endret polyamin metabolisme fordi spermin og spermidin-nivåer ble forhøyet i en doseavhengig måte ved behandling med FK866. Tilsetting av nikotinsyre fullstendig avskaffet effektene observert i HCT-116 celler, men ikke i A2780 celler (S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer). Således synes NAMPT hemming å forurolige flere aminosyre-reaksjonsveier, og noen av effektene synes å være cellelinje bestemt.
purin og pyrimidin Metabolism
På grunn av at flere trinn av purin og pyrimidin-biosyntese krever at NAD og mellomprodukter som er avledet fra karbohydratmetabolisme, vurderte vi effektene av NAMPT hemning på nukleotid-relaterte metabolism.As er vist på fig. 2 og i S3 Fil, S4 Fil og S5 filer, observerte vi endringer i nivåene av puriner som svar på FK866 behandling fordi det var en doseavhengig økning i nivåene av adenin, cytidin, cytosin, adenosin, 1-methyladenosine, inosin, adenosin monofosfat (AMP), adenosindifosfat (ADP), inosin-monofosfat (IMP), inosin-difosfat (IDP), cytidin-difosfat (CDP), deoksyguanosin difosfat (dGDP), 5-aminoimidazol-4-karboksamid ribonukleotid (AICAR), AICAR 3 « , 5»-cyklisk fosfat, N-formylglycinamide ribonukleotid, orotidine, purin, tymidin, uridin og i begge cellelinjene, lik økningen i aminosyrer nivåer. Interessant, tillegg av nikotinsyre betydelig redusert de forhøyede nivåer av inosine i begge cellelinjene (fig. 2, S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer). Nivåer av xantin ble ikke endret i A2780-celler, men økte på en doseavhengig måte i HCT-116-celler, noe som tyder på en cellelinje bestemt forskjell i xantin-relaterte metabolisme. Det var en doseavhengig reduksjon i 7-methylguanosine, deoksyadenosin, deoksyuridin, guanosinmonofosfat (GMP), cytidin monofosfat (CMP), deoksycytidin-monofosfat (dCMP), deoksyadenosin-monofosfat (damp), og uridin-trifosfat (UTP) nivåer. Disse effektene var på grunn av NAMPT hemming på grunn av tilsetningen av nikotinsyre avskaffet disse virkninger i HCT-116 celler, men ikke i A2780 celler. Interessant, behandling med 5 nM av FK866 øket dCMP nivåer sammenlignbare med de av 50 nM av FK866 i A2780 celler. Igjen, det var observert en cellelinje bestemt effekt fordi NAMPT hemming forårsaket en reduksjon i nivåene syklisk AMP og AICAR ribotid i A2780 celler, men ikke i HCT-116 celler (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer).
Hotel gjennomsnittet vises som en horisontal linje ligger innenfor panel. Y-aksen viser normalisert, log transformert, og skalert topparealet. Dots representerer prøver. Gruppe mener vist som en horisontal linje innenfor boksen.
Kreatin Metabolism
NAMPT hemming førte til en doseavhengig økning i kreatin og kreatinin nivåer i begge cellelinjene lignende til aminosyrer nivåer. I samsvar med dette, tillegg av nikotinsyre avskaffet disse effektene i HCT-116 celler, men ikke i A2780 celler (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer).
Lipidmetabolisme
fettsyre biosyntesen krever en stor mengde av NADP /NADPH avledet fra NAD og citrat (TCA en mellomliggende); vi har observert signifikante forandringer i lipidmetabolismen i respons til FK866 behandling. Palmitinsyre og stearinsyre-nivåer ble forhøyet i en doseavhengig måte i begge cellelinjer. Interessant, tilsetning av nikotinsyre avskaffet disse effektene i begge cellelinjer. Behandlingen med FK866 førte til økte nivåer av kolin, fosforylcholin, og phoshatydylglycerol i HCT-116 celler, men ikke i A2780 celler. Disse effektene ble observert i HCT-116-celler var et resultat av inhibering NAMPT fordi effektene ble opphevet ved tilsetning av nikotinsyre i vekstmediet. Interessant, observerte vi en sterk doseavhengig økning i glycerophosphocholine og glycerol-3-fosfat-nivåer i A2780 celler, men ikke i HCT-116-celler. Den FK866 behandling resulterte også i en betydelig doseavhengig reduksjon i Lyso-PC og PC-nivåer påvist i A2780 celler, men marginale endringer i HCT-116 celler (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer).
disse observasjonene kan ha reflektert en cellelinje-spesifikk forskjell i disse spesielle stoffskifte. Endelig NAMPT hemming også betydelig påvirket karnitin metabolisme på en doseavhengig måte (Fig. 3).
Hotel gjennomsnittet vises som en horisontal linje ligger innenfor panel. Y-aksen viser normalisert, log transformert, og skalert topparealet. Dots representerer prøver. Gruppe mener vist som en horisontal linje innenfor boksen.
carnitine er et viktig molekyl for regulering av cellulær energi metabolisme av fettsyrer og glukose. Karnitin er involvert i langkjedet fettsyre transport over den indre membran av mitokondrier, og det letter transport av kjede forkortet acylgrupper som produseres i peroxisomes til mitokondriene for ytterligere energiproduksjon. Celle-spesifikke endringer i carnitine stoffskiftet ble observert, noe som indikerer en annen effekt av FK866 administrasjon på carnitine biosyntese og degradering. Acetylcarnitine stammer fra acetyl-CoA, den universelle nedbrytningsproduktet fra alle metabolske substrater. Acetylcarnitine endringer ble funnet å være lik acetyl-CoA endringer (S2 Fil, S3 Fil, S4 Fil- og S5 filer). Butyrylcarnitine kan være avledet fra både fettsyrer og aminosyrer. Dens endringer ble funnet å være doseavhengig, noe som kan gjenspeile de observerte endringer i aminosyrer og fettsyrer metabolisme.
Glycolysis, Pentose fosfat Pathway, og den TCA syklus
Det ble nylig vist at NAMPT inhibering demper glyceraldehydes-3-fosfat-dehydrogenase-aktivitet, som i sin tur påvirker glykolysen, pentosemonofosfat fosfat vei, og den TCA syklus og deres nedstrøms baner i kreftceller [1]. Resultatene av denne studien er i nær enighet med de forrige undersøkelse [1] (S2-S5 filess).
Clustering Analyse
For ytterligere å forstå den metabolske tilkobling og å fange den globale effekter, utførte vi en unsupervised hierarkisk klyngeanalyse. Fig. 4 illustrerer de valgte metabolitter varme kart. Farge intensiteter av kartene viser at NAMPT hemming med FK866 er cellespesifikk og Fig. 4 viser nikotinsyre behandling. Fig. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
