Abstract
Hypoksi forekommer i en rekke forskjellige fysiologiske og patologiske tilstander, herunder tumorigenesis. Tumorceller har til å tilpasse seg til hypoksi ved å endre deres genekspresjon og proteinsyntese. Her viste vi at hypoksi hemmer oversettelse gjennom aktivering av PERK og inaktivering av mTOR i menneskets tykktarm kreft HCT116-celler. Langvarig hypoksi (1% O
2, 16 h) dramatisk hemmer generell oversettelse i HCT116 cellene, forblir likevel valgte mRNA effektivt settes under en slik tilstand. Ved hjelp av microarray analyse av polysome- forbundet mRNA, identifiserte vi et stort antall hypoksi-regulerte gener på translasjonsforskning nivå. Effektivt oversatt mRNA under hypoksi ble validert av polysome profilering og kvantitativ real-time RT-PCR. Pathway berikelse analyse viste at mange av de oppregulert gener som er involvert i lysosome, sukker og lipid metabolisme, antigen presentasjon, celle adhesjon, og ombygging av den ekstracellulære matrise og cytoskjelettet. Flertallet av nedregulert gener som er involvert i apoptose, ubiquitin-formidlet proteolyse, og oksidativ fosforylering. Videre undersøkelser viste at hypoksi induserer lysosomale autofagi og mitokondriell dysfunksjon gjennom translasjonsforskning regulering i HCT116 cellene. Overflod av flere oversettingsfaktorer og mTOR kinase aktivitet er involvert i hypoksi-indusert mitokondrie autofagi i HCT116 cellene. Våre studier markere betydningen av translasjonsforskning regulering for tumorcelle tilpasning til hypoksi
Citation. Lai MC, Chang CM, Sun HS (2016) Hypoksi induserer Autophagy gjennom translasjonell oppregulering av lysosomal Proteiner i Human tykktarmskreft Cells . PLoS ONE 11 (4): e0153627. doi: 10,1371 /journal.pone.0153627
Redaktør: Vladimir Trajkovic, School of Medicine, University of Beograd, Serbia
mottatt: 02.11.2015; Godkjent: 02.04.2016; Publisert: 14 april 2016
Copyright: © 2016 Lai et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (NSC100-2320-B-006-021-My3 til MCL og NSC101- 2627-B-006-005 til HSS) og Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPD3E0012). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste kreftformene hos mennesker. Hvert år blir mer enn 1 million pasienter diagnostisert med CRC i verden. Forekomsten av CRC har vært jevnt økende de siste 20 årene [1]. Studier av CRC har gitt verdifull innsikt i flertrinns genetiske prosessen med kreftutvikling [2, 3]. Flertallet av CRC er utløst av mutasjoner i adenomatøs polypose coli (
APC
) genet [4], som induserer dannelsen av tidlig adenom. Utviklingen av tykktarmskreft er videre fremmet av en rekke genetiske mutasjoner, inkludert
KRAS
,
SMAD4
, og
TP53
, som gjør adenom vekst og karsinom progresjon. En bedre forståelse av de molekylære mekanismene bak CRC progresjon kan lette utviklingen av nye anti-kreftbehandling. I løpet av det siste tiåret, er flere nye molekylære mål for tiden under etterforskning for behandling av CRC [5].
På grunn av rask spredning og avvikende angiogenese, svulster inneholder områder med varierende grad av hypoksi [6]. Tumorceller har til å tilpasse seg til hypoksisk stress ved å endre deres genekspresjon og proteinsyntese [7]. Disse endringene omfatter energi metabolisme, angiogenese, cellemigrasjon, tumorinvasjon og metastasering, cellesyklusregulering, inflammatorisk respons, og pH regulering [8-10]. Tumor hypoksi antas å spille en nøkkelrolle i tumorprogresjon og malignitet. Tilstedeværelsen av hypoksiske celler i faste tumorer er assosiert med en dårlig prognose i mange typer kreft [6]. Tidligere studier har vist at hypoksiske tumorceller er mer motstandsdyktig mot radioterapi [11, 12] og mange vanlig anvendte kjemoterapeutiske midler [13]. Derfor er det verdt å undersøke regulering av genekspresjon i humane kreftceller under hypoksiske betingelser.
I respons til hypoksi, celler raskt øke nivået av hypoksi-induserbar faktor 1 (HIF-1) [14, 15], en heterodimer som består av et oksygenfølsomt HIF-1α subenheten og et konstitutivt uttrykt HIF-1β subenheten. HIF-1 regulerer oksygen homeostase under hypoksi ved transcriptionally målrette mer enn 100 gener, som inneholder hypoksi-responsive elementer (hres) innenfor sine arrangører [16, 17]. I tillegg til transkripsjon, er omregning ansett som en viktig bidragsyter til hypoksi-regulert genekspresjon [18, 19]. Metabolsk merking studier viste at hypoksi hemmer global oversettelse i mange forskjellige cellelinjer [20-23]. Generelt oversettelsen blir betydelig hemmet av akutt anoksi ( 0,02% O
2) eller langvarig hypoksi (≦ 2% O
2, 16 h) [21, 22, 24-26]. Det har blitt rapportert at mammalian target of rapamycin (mTOR) og det endoplasmatiske retikulum bosatt kinase (PERK) spiller sentrale roller i translasjonell regulering under hypoksi [26-28]. Hypoksi hemmer kinaseaktiviteten av mTOR og fører til defosforylering av translasjon initiering faktor 4E-bindende proteiner (4E-bps). Defosforylering av 4E-BPs øker deres bindende affinitet til oversettelse initiering faktor eIF4E og dermed undertrykker cap-avhengige oversettelse ved å forstyrre sammenslutning av eIF4E med eIF4G. På den annen side induserer hypoksi den ufoldede protein respons (UPR), som oppstår som en konsekvens av endoplasmatisk retikulum (ER) stress, og fører til aktivering av PERK [21, 24, 27]. Aktivert PERK fosforylerer eukaryote translasjonsinitieringssete faktor 2 subenheten α (eIF2α) og således hindrer translasjon initiering ved å hindre dannelsen av eIF2-GTP-tRNA (i) Met ternære kompleks [29].
Selv om oversetter er i stor grad hemmet under hypoksi, forblir utvalgte mRNA effektivt settes under en slik tilstand. Oversettelse av hypoksi-responsive gener krever alternative mekanismer, slik som intern ribosom innføringsstedet (IRES) [30, 31] og oppstrøms åpen leseramme (uORF) [32]. IRES er en kompleks RNA strukturelt element som setter i gang oversettelse ved direkte å rekruttere ribosomene for å finne startkodonet på en mRNA. Det er antatt at hypoksi undertrykker cap-avhengige, men ikke IRES-mediert oversettelse initiering [29]. Hypoksi-responsive gener HIF-1α og VEGFA har vist seg å opprettholde oversettelse gjennom IRES under hypoksi [33, 34]. Imidlertid er mekanismen for translasjons-regulering under hypoksi fremdeles ikke fullt ut forstått, og det kan variere avhengig av celletyper og hypoksiske betingelser.
Autophagy er en celle biologisk prosess som degraderer unødvendige eller dysfunksjonelle proteiner og organeller for å opprettholde næringsstoff og energi homeostase under stress forhold [35]. Det har blitt rapportert at hypoksi induserer autophagy i et HIF-1-avhengig måte [36, 37]. Imidlertid translasjonell regulering spiller også en viktig rolle i hypoksi-indusert autophagy. I denne studien brukte vi polysome profilering koblet til hele menneskegenomet uttrykk array å identifisere kandidat gener som oversettelse er regulert av hypoksi i menneskets tykktarm kreft HCT116-celler. Funksjonell annotering av kandidat gener indikerer at hypoksi regulerer oversettelse av en rekke gener involvert i lysosome og ulike metabolske veier. Vi gir bevis for at hypoksi induserer autofagi gjennom translasjonsbevegelse oppregulering av lysosomale proteiner i HCT116-celler. Våre studier understreker viktigheten av translasjonsforskning regulering for tumorcelle tilpasning til hypoksi.
Materialer og metoder
Cell kultur og hypoksisk behandling
HCT116-celler (ATCC
® CCL247
™) ble dyrket i MEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. For hypoksisk (1% O
2) behandling, ble cellene overført til et spesialdesignet hypoksi kammer (NexBiOxy Inc., Hsinchu, Taiwan) som ble spylt med 95% N
2 og 5% CO
2 ved 37 ° C
plasmider og transfeksjon
De plasmider uttrykker FLAG-merket villtype mTOR eller konstitutivt aktive mutanter (L1460P E2419K). ble kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA). Cell transfeksjon ble utført ved hjelp av transfeksjon reagens Lipofectamine
® 2000 (Thermo Fisher Scientific), i hovedsak i henhold til produsentens instruksjoner.
RNAi-mediert knockdown
Alle de plasmider som kreves for RNAi -mediert knockdown ble levert av National RNAi Kjerne Facility (Academia Sinica, Taiwan). De to pLKO.1-shRNA vektorer som brukes til å knockdown PSAP og LAMP2 var som følger: TRCN0000217974 (shPSAP), og TRCN0000029263 (shLAMP2). Transfeksjon reagens Lipofectamine
® 2000 (Thermo Fisher Scientific) ble brukt til å overføre plasmid-DNA inn i HCT116-celler. Cellene ble høstet 3 dager etter transfeksjon for analyse.
sukrosegradient sedimentering og polysome profilering
celler ble samlet opp i kald PBS inneholdende 100 ug /ml cykloheksimid. Alle påfølgende trinn ble utført ved 4 ° C. Cellepelletene ble resuspendert i RSB-150 (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 3 mM MgCl
2, og 150 mM NaCl) inneholdende 100 ug /ml sykloheksimid, 40 ug /ml digitonin (Calbiochem), 20 U /ml RNasin (Promega), og 1X proteasehemmer cocktail (Thermo Fisher Scientific). Etter inkubasjon på is i 5 minutter, ble cellene ødelagt ved passasje gjennom en 26-gauge nål fem ganger. Cytoplasmiske ekstrakter ble samlet ved sentrifugering ved 3000 x g i 2 minutter, og ytterligere klargjort ved sentrifugering ved 11 000 x g i 15 min. Prøvene ble applisert på en lineær 15-40% sakkarose-gradient og sentrifugert ved 38 000 opm i 3 timer i en Beckman SW41-rotor. Etter sentrifugering, ble total RNA ekstrahert fra hver fraksjon ved hjelp av fenol /kloroform-ekstraksjon i nærvær av 1% SDS og 0,25 M NaCl, etterfulgt av etanolutfelling. For polysome profilanalyse ble gradienter overvåket ved 254 nm med en ISCO fraksjone system (Lincoln, Nebraska).
Immunoblotting
Proteiner ble overført til en PVDF Transfer Membrane (PerkinElmer). Protein Blottene ble blokkert med 3% skummet melk i TBST-buffer (100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20) ved RT i 1 time. De primære antistoffer inkludert kanin anti-fosfor-eIF2α (Ser51) (1: 1000 fortynning, Cell Signaling), mus anti-eIF2α (0,4 mikrogram /ml, Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-fosfor-4E-BP1 (Thr37 /46 ) (1: 1000 fortynning, cellesignalisering), muse-anti-4E-BP1 (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), muse-anti-β-aktin (1: 2500 fortynning, Sigma-Aldrich), muse anti-HIF- 1a (0,2 ug /ml; BD Transduction Laboratories), geite-anti-Glut1 (1 pg /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-VEGF (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-LC3B (1: 1000 fortynning, cellesignalisering), kanin-anti-P62 (1: 2000 fortynning, MBL), kanin-anti-α-tubulin (1: 2000 fortynning, cellesignalisering), kanin-anti-GNS (1: 200 fortynning; GeneTex), kanin-anti -PSAP (1: 1000 fortynning, GeneTex), muse-anti-TPP1 (1 pg /ml; Abcam), muse-anti-ATPB (0,5 ug /ml; Abcam), kanin-anti-LAMP2 (1: 1000 fortynning, GeneTex), kanin anti-eIF4E (1 ug /ml; Abcam), og kanin-anti-eIF4A1 (1 pg /ml; Abcam). Blottene ble inkubert med primære antistoffer i blokkeringsbuffer ved romtemperatur i 2 timer, etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugerte sekundære antistoffer ved romtemperatur i 2 timer. Deteksjon ble utført ved hjelp Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrat (Millipore) for X-ray film som eksponeres.
Microarray analyse
For microarray analyse, isolert RNA ble ryddet opp med RNeasy Mini kit (Qiagen) . Omtrent 6 ug total RNA ble revers transkribert til cDNA ved anvendelse av en oligo d (T) primer som inneholder T7 RNA polymerase promoter-sekvensen ved 3′-enden. Biotin-merket komplementært RNA (cRNA) ble fremstilt ved
in vitro transkripsjon
fulgt av metall-indusert hydrolyse ved 94 ° C. Deretter ble fragmentert cRNA hybridisert på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 Array ved 45 ° C i 16 timer. Påfølgende vasking og farging ble utført med en Fluidic Station-450 og GeneChips skannes med Affymetrix Genechip Scanner 7G. Raw microarray data ble analysert videre med GeneSpring GX 10 software (Silicon Genetics).
RT-PCR og kvantitativ real-time PCR
RT-PCR ble brukt til å detektere mRNA uttrykk nivå. Trukket ut RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av High-Capacity cDNA revers transkripsjon Kits (Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens instruksjoner. Det resulterende cDNA ble underkastet konvensjonell PCR eller kvantitativ real-time PCR-analyse. Konvensjonell PCR ble utført ved anvendelse av GoTaq DNA-polymerase (Promega) og den forover og revers primere: p-aktin (forover primer (FP): 5’CATCCACGAAACTACCTTCAACT3 «og revers primer (RP): 5’TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG3»), HIF-1α (FP : 5’TGGACTCTGATC ATCTGACC3 «og RP: 5’CTCAAGTTGCTGGTCATCAG3»), og VEGFA (FP: 5’CCTGGT GGACATCTTCCAGGAGTACC3 «og RP: 5’GAAGCTCATCTCTCCTATGTGCT GGC3.) [38]
kvantitativ real-time PCR var utføres ved hjelp StepOnePlus
™ real-time PCR Systems i henhold til leverandørens anbefalinger (Thermo Fisher Scientific). Primere som brukes til kvantitativ real-time PCR er oppført i S1 tabell. Nivåene av mRNA ble påvist med Fast SYBR
® Grønn Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Kvantitative analyser ble utført ved måling av CT-verdier i løpet av den eksponensielle fase av forsterkning. Relative kvantiteringsstandarder verdier ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden [39].
Pathway berikelse analyse
Funksjonell annotering av hypoksi-regulerte gener ble utført ved hjelp av offentlig tilgjengelig DAVID Bioinformatikk Resources versjon 6.7 programvare (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) med Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) pathway database. Den statistiske signifikans ble bestemt ved en modifisert Fishers eksakte test. P-verdi = 0 representerer perfekt berikelse. P-verdi 0,05 blir betraktet som sterkt anriket i merknads kategorier
Flowcytometri analyse
Cellekulturer ble avgjørende farget med acridinoransje. (AO, Sigma-Aldrich) i en konsentrasjon på 5 ug /ml i 15 min og deretter vasket med PBS. AO er en fluorescerende kationisk fargestoff som kan bli anvendt for å måle nivåene av sure vesikulær organeller (lysosomer) i cellene. Nivåene av sure vesikulær organ ble analysert ved hjelp av FACSCalibur (BD Biosciences) med eksitasjon satt til 488 nm, og utslipp fra fluorescerende AO ble oppdaget av FL-3-kanal (670 nm).
mitokondriemembranpotensialet var bestemt ved anvendelse av tetra-metylester (TMRM). Cellekulturer ble vital farget med 0,5 uM TMRM i 30 minutter ved 37 ° C og deretter vasket med PBS. Fluorescensintensiteten av TMRM ble analysert ved hjelp av strømningscytometri med FL-2-kanals (564 ~ 606 nm). Prøvene ble analysert ved hjelp Cellquest Pro 4.0.2 programvare (BD Biosciences) og kvantifisering ble utført ved hjelp WinMDI 2.9 programvare (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).
LysoTracker farging
LysoTracker Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific) brukes til å undersøke biosyntese og akkumulering av lysosomer i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble de HCT116-celler dyrket på dekkglass merket med LysoTracker Red DND-99 (1: 5000 fortynning) i 1 time under vekstbetingelser. Etter merking ble cellene vasket med kald PBS og fiksert med 3% formaldehyd i PBS i 30 min. Etter grundig vasking med PBS, ble prøvene montert umiddelbart og observert ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop (Zeiss Axio Observer A1, Tyskland) utstyrt med et CCD-kamera.
Statistisk analyse
Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± standard feil og analysert ved hjelp av GraphPad Prism 4.0-programvaren (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av en uparet t-test. P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Generelt oversettelsen er utsatt for hypoksi i HCT116 cellene
Det har blitt rapportert at generell oversettelsen er hemmet av hypoksi. i ulike celletyper, men hypoksi-responsive gener kan flykte fra translasjonsforskning undertrykkelse under hypoksi [32-34, 40]. Her utførte vi polysome profilering og RT-PCR for å påvise polysomal fordeling av spesifikke mRNA. MRNA /ribosom-komplekser ble separert inn i 11 fraksjoner ved anvendelse av en lineær 15-40% sakkarose-gradient sentrifugering (figur 1A). Fordelingen av et mRNA innenfor polysomal fraksjonene er reflektert av dets transla-sjonsvirkning. Først må vi brukte forskjellige kolorektal kreft-cellelinjer for å studere effekter av hypoksi ved omregning og observert at forlenget hypoksi (1% O
2, ≧ 16 timer) førte til en dramatisk inhibering av oversetter i HCT116-celler (S1 Fig). Translasjonell effektivitet av husholdningsgenet p-aktin endres fra ~ 60% til ca 30% i løpet av 16 timer for eksponering for hypoksi (figur 1B). Fordi Perk og mTOR kinaser er blitt foreslått som viktige faktorer i translasjonell regulering under hypoksi [27], vi derfor analysert fosforylering status på sine nedstrøms underlag, eIF2α og 4E-BP1, i HCT116 cellene under hypoksi. Immunoblot-analyse viste at langvarig hypoksi fører til en svak økning i fosforylering eIF2α (figur 1C), og 4E-BP1 er gradvis defosforylert innen 16 timer etter eksponering for hypoksi i HCT116-celler. Dette indikerer at hypoksi hindrer oversetter i det minste delvis ved aktivering av PERK og inaktivering av mTOR i HCT116-celler.
A. Cytoplasmiske ekstrakter ble lastet på en lineær 15-40% sakkarose-gradient-ultrasentrifugering. Etter sentrifugering ble polysome profilen plottet ved A
254 verdier (øvre), og RNA ble ekstrahert fra hver fraksjon for analyse. Det rensede RNA ble løst på en 1% formaldehyd /agarosegel, og rRNA ble visualisert ved etidiumbromidfarging (nedre). Fordelingen av ribosomale subenheter og polysomes er indikert. B. HCT116-celler behandlet med hypoksi (1% O
2) for 0, 4, 8, 16 og 24 timer. Den polysomal fordeling av β-aktin-mRNA ble påvist ved polysome profilering og RT-PCR. Translasjonell effektivitet av β-aktin-mRNA ble beregnet og angitt i prosent ved forskjellige tidspunkter. C. fosforylering status av eIF2α og 4E-BP1 ble bestemt ved immunoblotanalyse i HCT116-celler eksponert for hypoksi for det angitte tidsrom. Nivåene av fosforylert (PI-) og total proteiner ble oppdaget av spesifikke antistoffer mot fosfor-eIF2α (Ser51), eIF2α, fosfor-4E-BP1 (Thr37 /46), og 4E-BP1. Påvisning av β-aktin protein fungert som en lasting kontroll. D. Immunoblot-analyse av HIF-1α, GLUT1, VEGFA, og p-aktin proteiner i HCT116-celler utsatt for hypoksi i 16 timer. Påvisning av β-aktin protein fungert som en lasting kontroll. E. HCT116-celler ble dyrket under normoxia (21% O
2) eller hypoksi (1% O
2) i 16 timer. Celler ble høstet og lysert i RSB-150 buffer. Cytoplasmiske ekstrakter ble lastet på en lineær 15-40% sakkarose-gradient-ultrasentrifugering og oppsamlet i 11 fraksjoner (1 ml /fraksjon). RNA isolert fra hver fraksjon ble påvist ved RT-PCR og underkastet agarosegelelektroforese. Den polysomal regionen gradienten inkluderer fraksjoner 7-11. Translasjonell effektivitet av β-aktin, HIF-1α, og VEGFA mRNA ble beregnet og vist som en prosentandel. 28S og 18S rRNAs direkte ble visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Fordelingen av ribosomale subenheter og polysomes indikeres.
For å undersøke endringer i oversettelse under hypoksi ble HCT116-celler dyrket under normoksiske (21% O
2) og hypoksisk (1% O
2) forhold kultur i 16 timer. Som forventet, hypoksi stabiliserer HIF-1α protein og induserer ekspresjon av HIF-1 målgener GLUT1 og VEGFA i HCT116-celler (Fig 1 D). Vi utførte også polysome profilering og RT-PCR for å evaluere translasjonell effektiviteten av utvalgte mRNA. Denaturering agarosegel elektroforese av rRNA viste et skifte av mRNA fra polysomes til oversettelse initiering komplekser (Fig 1E, nedre panel). Oppbyggingen av 18S og 28S rRNAs i lavmolekylære ribosomale fraksjoner (fraksjonene 5-6, hypoksi) indikerte translasjonsforskning undertrykkelse under hypoksi. Den polysomal fordeling av β-aktin mRNA ble øyensynlig redusert i hypoksiske HCT116-celler sammenlignet med normoksiske kontroll (figur 1E, øvre panel). En stor del av den β-aktin mRNA (68,7%) var forbundet med polysomes i normoksisk HCT116-celler, mens bare 32,0% av β-aktin mRNA forble assosiert med polysomes i hypoksiske HCT116-celler. I motsetning til dette polysomal fordeling av HIF-1α og VEGFA mRNA var forholdsvis upåvirket av hypoksi (figur 1E, midtre panel). Mer enn halvparten av HIF-1α (58,1%) og VEGFA (53,8%) mRNA forble forbundet med polysomes etter 16 timers eksponering til hypoksi. I overensstemmelse med tidligere studier [33, 34], HIF-1α og VEGFA mRNA har evnen til å unnslippe translasjonell undertrykkelse under hypoksi. Derfor antar vi at utvalgte mRNA forblir effektivt oversatt i HCT116 cellene under hypoksiske forhold.
translasjonell regulering av utvalgte mRNA i HCT116 cellene under hypoksi
For å undersøke effekten av hypoksi på oversettelse, vi utnyttet polysome profilering koblet til cDNA microarray analyse for å skjerme hypoksi-regulerte gener. Begge polysome-assosiert mRNAer og total RNA fra normoksisk og hypoksiske HCT116-celler ble isolert og utsatt for microarray hybridisering. Polysome-forbundet mRNA ble isolert fra en pool av polysomal fraksjoner (fig 1A, fraksjoner 8-11) for analyse av translatome. Total RNA ble ekstrahert fra de samme prøvene for analyse av transcriptome. Den translatoriske endring av et mRNA ble målt ved forandring i mengden av RNA polysomal normalisert til endringen i mengden av totalt RNA for hver mRNA (figur 2, polysomal /totalt). Gener med endringer k to ganger etter eksponering for hypoksi ble ansett som hypoksi-regulert kandidat gener. Alle kandidat gener ble delt inn i fire kategorier: oppregulert og nedregulert gener enten på translasjonsforskning eller transkripsjonsnivået (fig 2). Som et resultat ble 1036 up-regulerte gener og 480 nedregulert gener identifisert ved translatome analyse. Parallell transkriptomet Analysen identifiserte 144 oppregulert gener og 134 nedregulert gener. Imidlertid er bare ~ 32% av hypoksi-regulerte gener på transkripsjonsnivået viser tegn til translasjonelle ko-regulering i HCT116-celler under hypoksi (figur 2, Venn-diagrammer). Dette indikerer at hypoksi kan påvirke ulike undergrupper av målgener mellom translatome og transkriptom.
Resultater av microarray analyse ble analysert ved hjelp GeneSpring GX 10 programvare. Gener med ≧ 2 ganger endring i polysomal /total RNA-forhold eller total RNA ble definert som hypoksi-regulerte gener. Resultatene ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. Hypoksi-regulerte gener ble delt inn i fire kategorier: oppregulert og ned-regulert gener på translasjonsforskning (translatome) og transkripsjons (transkriptom) nivåer, henholdsvis. Venn-diagrammer viser overlapping av hypoksi-regulerte gener mellom translatome og transkriptom. Tall i overlappende områder indikerer hypoksi-regulerte gener både på translasjonsforskning og transkripsjonsnivået i HCT116 cellene.
Validering av kandidatgener som oversettelsen er oppregulert ved hypoksi i HCT116 cellene
Hvis du vil kontrollere microarray data, ble flere kandidat gener analysert ved polysome profilering og kvantitativ real-time RT-PCR. Den polysomal sammenslutning av β-aktin mRNA ble tydeligvis redusert i HCT116 cellene utsatt for hypoksi (fig 3A). I kontrast til polysome-forbundet mRNA både translatorisk og transcriptionally oppregulert gener
GLUT1
,
ADM
, og
VEGFA
ble økt i HCT116 cellene under hypoksi sammen å normoxia (figur 3B), noe som indikerer at de tre genene forblir effektivt settes i henhold til hypoksi. Lignende resultater ble oppnådd fra translatorisk men ikke transcriptionally oppregulert gener
HSPA5
,
VCAN
, og
GPR126 plakater (figur 3C). Etter beregningen disse translatorisk opp-regulerte gener viste en økning i translasjonell effektivitet i løpet av hypoksi i forhold til normoxia (figur 3D). Resultatene av valideringsforsøk er i stor grad i samsvar med microarray målinger. Dette indikerer at mange gener kan flykte fra translasjonsforskning undertrykkelse og forblir effektivt oversatt i HCT116 celler under hypoksi.
Flere oppregulert gener på translasjonsforskning nivå (translatome) i hypoksiske HCT116 cellene ble validert. RNA isolert fra sukrosegradient fraksjonering ble analysert ved kvantitativ sanntids RT-PCR. Fordelingen av mRNA i hver fraksjon ble beregnet og vist som en prosentandel (%). A. Polysomal profilen til β-actin tjente som en negativ kontroll. B. Polysomal profiler av oppregulert gener både på translasjonsforskning og transkripsjonsnivåer (
GLUT1
,
ADM
, og
VEGFA
). C. Polysomal profiler av oppregulert gener på translasjonsforskning, men ikke transkripsjonsnivået (
HSPA5
,
VCAN
, og
GPR126
). D. translasjonell effektiviteten av β-aktin, GLUT1, ADM, VEGFA, HSPA5, VCAN, og GPR126 mRNA ble beregnet og vist som en prosentandel (%) i HCT116-celler i henhold til normoxia og hypoksi. Bar grafene viser gjennomsnitt ± standard feil fra minst tre uavhengige forsøk (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)
Pathway berikelse analyse av hypoksi. -regulated gener på translasjonsforskning nivå
for å få innsikt i de biologiske funksjonene til hypoksi-regulerte gener, ble veien berikelse analyse utført ved hjelp av DAVID Bioinformatikk Resources 6.7 programvare for å kartlegge genene til biologiske mekanismer som er definert av KEGG pathway database. Resultatene viste at hypoksi fører til translasjonell opp-regulering av gener som fungerer i lysosomet, glykan og lipidmetabolisme, antigen prosessering og presentasjon, celleadhesjon, og remodellering av den ekstracellulære matriks (ECM) og cytoskjelettet (tabell 1). I motsetning til dette, hypoksi nedregulerer oversettelse av gener som er involvert i apoptose, ubiquitin-formidlet proteolyse, og oksidativ fosforylering (tabell 2). En viktig funksjon av lysosomer er fordøyelses autofagi i eukaryote celler. Derfor antar vi at hypoksi induserer lysosomale autofagi og metabolsk omorganisering for å opprettholde energi homeostase via en translasjonell mekanisme.
Hypoksi induserer lysosomale autofagi og mitokondriell dysfunksjon gjennom translasjonsforskning regulering i HCT116 cellene
Vi har identifisert 35 translasjonelt up-regulerte gener som fungerer i det lysosomale reaksjonsveien i HCT116-celler eksponert for hypoksi (tabell 1). Interessant, alle 35 lysosomale gener ble oppregulert under hypoksi ved det translasjonelle nivå uavhengig av transkripsjon (tabell 3). Dette indikerer at translasjonsforskning regulering kan spille en avgjørende rolle i hypoksi-indusert autofagi. Lysosomer kan kvantifiseres ved flow-cytometri etter farging av cellene med akridinorange (AO), en lysosomotropic svak base som samler seg innenfor de sure vesikulær organeller av levende celler. Fluorescensintensiteten av AO var signifikant økt i HCT116-celler etter eksponering for hypoksi i 24 timer (figur 4A), noe som tyder på at hypoksi fører til en økning i innholdet av lysosomer. Vi neste brukte LysoTracker Red DND-99, et fluorescerende acidotropic fargestoff for merking og sporing av sure organeller i levende celler for å vanhellige lysosomer. Lysosomer ble farget rød i HCT116 cellene, og hypoksi gir opphav til forstørret lysosomer i forhold til normoxia (fig 4B). Resultatene indikerer at hypoksi øker størrelsen på lysosomale volum. Vi undersøkte ytterligere induksjon av autophagy ved å overvåke den autophagy markørprotein lettkjede 3 (LC3) i HCT116-celler under hypoxi i forhold til normoxia. Omdannelse av LC3-I til LC3-II og nedbrytning av total LC3 (LC3-I plus LC3-II) ble anvendt for å bestemme endringer i omfanget av autophagy [41]. Immunoblot-analyse viste at LC3-I til LC3-II-konvertering (LC3-II /LC3-l-forhold) ble øket, og den totale mengden av LC3 ble redusert i HCT116-celler eksponert for hypoksi i 24 timer og 48 timer (figur 4C, venstre panel ), noe som tyder på hypoksi-indusert autofagi. Vi har også oppdaget at autofagi markørprotein p62, som er degradert under autofagi [41]. Konsekvent mengden av p62 viste også en markert nedgang i hypoksiske HCT116-celler (figur 4C, høyre panel). For å bekrefte hypoksi-indusert translasjonsforskning oppregulering av lysosomale proteiner (Tabell 3), vi har oppdaget både protein og mRNA nivåer av lysosomale gener glukosamin (N-acetyl) -6-sulfatase (
GNS
), prosaposin (
PSAP
), og tripeptidylpeptidase 1 (
TPP1
). Etter eksponering til hypoksi i 24 timer, ble nivået av GNS og PSAP proteinene økes ved ~ to ganger sammenlignet med normoxia (figur 5A). Nivået av TPP1-protein ble også svakt øket i løpet av hypoksi. En kvantitativ analyse viste at mRNA-nivåene av GNS, PSAP, og TPP1 ikke blir signifikant påvirket av hypoksi (figur 5A). Resultatene tyder på at hypoksi beriker lysosomale proteiner gjennom translasjonsforskning mekanismer.
A. HCT116-celler ble dyrket under normoxia (21% O
2) eller hypoksi (1% O
2) i 24 timer. Celler ble farget med acridin orange (AO) og analysert ved flow-cytometri for å måle innholdet av lysosomer. Bar grafene viser gjennomsnittlig fluorescens intensitet av AO fra minst tre uavhengige forsøk (** p 0,01). B. HCT116-celler ble dyrket under normoxia (21% O
2) eller hypoksi (1% O
2) i 24 timer. Lysosomer ble merket med LysoTracker Red DND-99 for 1 time i levende celler og observert av en omvendt fluorescens mikroskop. C. HCT116-celler ble utsatt for hypoksi (H) eller normoxia (N) i 24 timer og 48 timer. Totalt celle ekstrakter ble analysert ved immunoblotting med LC3 og p-aktin antistoffer (venstre panel). De LC3-I og LC3-II-bånd ble kvantifisert, og autophagy ble målt ved variasjoner i forholdet mellom LC3-II /LC3-I og den totale mengden av LC3 (LC3-I plus LC3-II) normalisert til p-aktin for hver tilstand. Bar grafene viser relative LC3 proteinnivået normalisert p-aktin fra minst tre uavhengige forsøk (** p 0,01). De ovennevnte prøver ble også analysert ved immunblotting med p62 og α-tubulin-antistoffer (panel høyre).
