Abstract
Massivt økende globale forekomst av tykktarmskreft krever effektive behandlings- og forebyggingsstrategier. Her rapporterer vi uventede anticancerogenic effektene av hydroethanolic
Iberis amara
ekstrakt (IAE), som er kjent som en mye brukt phytomedical produkt for behandling av gastrointestinale plager. IAE inhiberte signifikant proliferasjon av HT-29 og T84 kolon carcinoma celler med en inhiberende konsentrasjon (IC
50) på 6 og 9 ug /ml, henholdsvis, og ytterligere genererte hemmende virkninger i PC-3 prostata og MCF7 brystcancerceller . Inhibering av proliferasjon i HT-29-celler ble forbundet med et G2 /M fase cellesyklus-stans herunder redusert ekspresjon av ulike regulatoriske markørproteiner. Spesielt i HT-29 celler IAE ytterligere indusert apoptose ved intracellulær dannelse av reaktive oksygenforbindelser (ROS). I samsvar med forutsigelser avledet fra vår
in vitro eksperimenter
, bidaily oral gavage på 50 mg /kg av IAE over 4 uker resulterte i signifikant inhibering av tumorvekst hos en mus HT-29 tumor xenograft modell. Til sammen
Iberis amara
ekstrakter kan bli nyttige alternativer for å forebygge og behandle utviklingen av tykktarmskreft
Citation. Weidner C, Rousseau M, Plauth A, Wowro SJ, Fischer C, Abdel -Aziz H, et al. (2016)
Iberis amara
Extract Induserer Intracellulær Dannelse av reaktive oksygen arter og Hemmer tykktarmskreft. PLoS ONE 11 (4): e0152398. doi: 10,1371 /journal.pone.0152398
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 23 april 2015; Godkjent: 14 mars 2016; Publisert: 06.04.2016
Copyright: © 2016 Weidner et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den tyske departementet for utdanning og forskning (BMBF, gi tall 0315082, 01EA1303). Forfatter HAA ble støttet av Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH i form av lønn. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Heba Abdel-Aziz er ansatt Steigerwald Arzneimittelwerk GmbH, et selskap som selger phytomedical produkter . Heba Abdel-Aziz og de andre forfatterne har erklært ingen potensiell interessekonflikt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste kreftformen globalt og den fjerde største årsaken til kreft -relaterte død [1]. CRC står for 1-2 millioner nye tilfeller og mer enn 600.000 dødsfall per år [1]. Den globale forekomsten av CRC er stadig økende, og ser ut til å være forbundet med en vestlig livsstil [1].
Effektiv behandling av CRC er hemmet av redusert samsvar med screening anbefalinger, sent stadium diagnose av nye CRC tilfeller alvorlig terapi toksisitet, medikamentresistens, og kreft tilbakefall [2, 3]. For å overvinne disse begrensningene nye tilnærminger for effektiv forebygging og behandling av CRC for, blant annet komplementering av sterk cytotoksisk eller målrettet medikamentell behandling, for eksempel ved anvendelse av trygge alternativer fytoterapeutiske [4].
Generelt bassenger av naturlige stoffer slike som flavonoider, fenoliske syrer, polyfenoler og terpenoids kan modulere flere molekylære stier involvert i patobiologi av komplekse sykdommer. Spesielt, plantebaserte sammensatte blandinger generelt provosere lave giftige bivirkninger [5]. Nyere studier har vist at mild urteekstrakter redusere kreftcellevekst, ved å indusere apoptose og produsere synergistiske effekter i CRC. For eksempel, utdrag fra grønn te, druer, ingefær, gurkemeie, soya og hvitløk [4], kamille [6] eller melissa officin [7, 8] ble rapportert å utøve helse gunstige effekter.
Iberis amara plakater (også kalt bitter candytuft) tilhører familien
Brassicaceae
, og er vanlig i Sentral- og Sør-Europa [9]. Her, analyserte vi en godt validert og godkjent hydroethanolic ekstrakt av
Iberis amara plakater (IAE) som rutinemessig søkt om gastrointestinal bruk.
IAE utøves overraskende sterk antiproliferative og apoptotisk aktivitet, for eksempel i kolon carcinoma celler. Disse antitumorvirkninger ble forårsaket av intracellulær dannelsen av reaktive oksygenarter (ROS), mens bråkjøling av ROS av antioksidanter beskyttet kreftceller fra apoptose. Spesielt, anvendelse av IAE i en xenograft mus modell resulterte i effektiv hemming av tumorvekst
in vivo
, som gir bevis for at IAE kan med fordel brukes for å forebygge og komplementær behandling av tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Material
Kjemi ble kjøpt fra følgende kilder: staurosporin (STN) og irinotecan (IRI) fra LKT Laboratories (Biomol), oksaliplatin (OX) fra Cayman Chemical (Biomol, Hamburg , Tyskland). Paclitaxel (PTX), 5-fluorouracil (5-FU), menadion (MD), tert-butylhydroperoksyd (TBHP), N-acetylcystein (NAC), glutation (GSH), 3H-1, 2-dithiole-3- tion (D3T), ble α-tokoferol (α-TOC) og askorbinsyre (AA) innkjøpt fra Sigma Aldrich (Taufkirchen, Tyskland). Hydroethanolic
Iberis amara
pakke (IAE) er en industriell, validert hydroethanolic (31% v /v) ekstrakt levert av Steigerwald Arzneimittelwerk (Darmstadt, Tyskland). Ekstraktet ble fremstilt i henhold til en standardisert fremgangsmåte. Kvalitet ble kontrollert ved hjelp av HPLC fingerprinting, og innholdet av ekstraktet ble bestemt nøyaktig som beskrevet tidligere i detalj [10].
Cellekultur
human HT-29 (ACC-299 , DSMZ, Braunschweig, Tyskland) og T84 kolorektal kreftceller (CCL-248, ATCC, LGC Promochem, Wesel, Tyskland) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium /Nutrient blanding F-12 (DMEM /F-12, # 11330-057 , Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Tyskland) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS, Biochrom, Berlin, Tyskland) og 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin (Biochrom). HT-29 celler ble etablert fra den primære svulsten av en 44 år gammel kaukasisk kvinne med kolon adenokarsinom; T84 celler ble isolert fra en lungemetastasering av et kolon karsinom i en 72-år gammel mann. PC-3 prostata kreft celler (CRL-1435, ATCC) ble dyrket i RPMI 1640 (Biochrom) supplert med 10% FBS og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. MCF7 brystcancerceller (HTB-22, ATCC) ble dyrket i DMEM Glutamax (Gibco, Life Technologies) supplert med 10% FBS, 10 ug /ml human insulin (Sigma Aldrich) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin . CCD 841 Con primære kolon celler (CRL-1790, ATCC) ble dyrket i DMEM Glutamax (Life Technologies) inneholder 10% FBS. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Cellene ble behandlet ved hjelp hydroethanolic IAE, angitt forbindelser oppløst i DMSO, eller tilsvarende kjøretøy kontroller.
Behandlinger av celler med IAE var spesielt optimalisert med tanke på konsentrasjon og behandlingstider, som varierte avhengig av biologisk respons og markører brukes til deteksjon.
spredningsanalyse
spredning av kreftceller ble bestemt ved hjelp av CyQUANT NF Cell Proliferation assay Kit (Life Technologies). For dette formål, HT-29, T8, PC-3 og MCF7 kreftceller og normale CCD 841 Con-celler ble sådd ut i sorte 384-brønners plater (# 3712, Corning, Fisher Scientific, Schwerte, Tyskland) med en densitet 750 celler /brønn (HT-29), 900 celler /brønn (T84), 250 celler /brønn (PC-3), 900 celler /brønn (MCF7) og 900 celler /brønn CCD 841 cON primære kolon celler, henholdsvis, i et endelig volum på 50 ul /brønn. Cellene ble deretter behandlet med konsentrasjonsrekke av forbindelsene ved tilsetning av 10 ul av en 6-gangers lager konsentrasjon. Etter 72 h (HT-29, PC-3) og 96 timer (T84, MCF7, CCD 841 con) behandling, henholdsvis, det relative antall celler ble bestemt ved måling av cellulært DNA-innhold ved bruk av det fluorescerende CyQUANT fargestoff i henhold til produsentens bruksanvisning. For samtidig behandling med antioksidanter, var behandlingstiden redusert til 48 timer. Fluorescensintensitet ble målt ved bruk av Polarstar Omega (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) og transformert til relative antall celler. For konsentrasjon serien, ble data montert ved hjelp GraphPad Prism 5,0 ifølge ligningen: Y = Top + (Bunn-Top) /(1 + 10 ^ ((logikk
50-X) * hillslope)) med variabel Hill skråning. Effektivitet er den maksimale observerte induksjon av celledød (100% -Bottom) i forhold til ubehandlede celler (satt til 0%).
cellesyklusanalyse
modulering av cellesyklusen ble bestemt i HT -29-celler behandlet med 30 ug /ml IAE i 24 timer. Etter trypsinering ble cellene fiksert i 70% etanol og inkubert på is i 15 min. Celler ble deretter merket med propidiumjodid (PI) /RNase fargeløsning (# 4087, Cell Signaling Technology, New England Biolabs, Frankfurt, Tyskland) og videre inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Fikserte celler ble frosset ved -20 ° C før analyse. Til slutt ble cellene analysert ved hjelp av FACS Aria II strømningscytometer (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Dataanalyse ble utført ved hjelp FlowJo 7,6 (Tre stjerne), og cellesyklus statene ble tildelt ved å bruke implementert Dean-Jett-Fox modell. Histogrammer ble visualisert ved GraphPad Prism 5.0. Legg merke til at i våre hender denne analysen var dessverre ineffektiv ved bruk av alternative tykktarm-avledet T84-celler på grunn av vanskeligheter med å oppnå et betydelig antall enkeltceller. Dette problemet ble også økt i løpet av fiksering, noe som resulterer i akkumulering av T84 celler (f.eks dubletter), som gjorde dataanalyse av ulike cellesyklus sier umulig i praksis.
Immunoblotting
Celler ble lysert i 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS med proteasehemmere (Roche Diagnostics) og fosfatase hemmere (Sigma Aldrich), og ultralydbehandlet (ved hjelp av en enhet fra Bandelin elektronisk, Berlin, Tyskland). Etter sentrifugering ved 10 000 g i 10 minutter, ble supernatantene lagret ved -80 ° C inntil bruk. Prøvene ble denaturert og separert ved bruk av NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein gels (Life Technologies) og blottet på Hybond ECL nitrocellulosemembraner (GE Healthcare, Freiburg, Tyskland). Membranene ble blokkert med 5% melk pulver i 0,1% Triton X-100 /TBS (TBS-T, pH 7,6) ved romtemperatur i 1 time og deretter vasket i TBS-T (0.1%). Primære antistoffer mot cyclin A2 (# 4656), cyclin D3 (# 2936), CDK 2 (# 2546), CDK 4 (# 2906), CDK 6 (# 3136), caspase 3 (# 9665), kløyvde caspase 3 (# 9664), caspase 9 (# 9502), kløyvde caspase 9 (# 9501), PARP (# 9542), kløyvde PARP (# 5625), p18 (# 2596), p21 (# 2947, alle fra Cell Signaling Technology), og GAPDH (# sc-48167, Santa Cruz) ble fortynnet i TBS-T (0.1%) med melkepulver og BSA, henholdsvis, i henhold til produsentens protokoller. Membranene ble ristet ved 4 ° C over natten, deretter vasket med TBS-T (0,1%) og inkubert med anti-kanin IgG-HRP (# sc-2004), anti-muse-IgG-HRP (# sc-2005) og anti- geite-IgG-HRP (# sc-2020, alle Santa Cruz), henholdsvis, i henhold til produsentens instruksjoner. Proteiner ble påvist ved hjelp av Western Lightning ECL-løsning (Perkin Elmer, Rodgau, Tyskland). Membraner ble strippet med Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) i 7 minutter ved romtemperatur. Densitometriske analysene ble utført ved hjelp av FUSION-SL Advance 4,2 MP System (Peqlab, Erlangen, Tyskland).
caspaseaktivering
Aktivering av caspases 2, 3/7, 6, 8 og 9 var undersøkt ved hjelp av luminometric caspase-Glo analyser (Promega, Mannheim, Tyskland). I korthet, en dag før behandling av HT-29 celler ble sådd i sorte 384-brønners plater (# 3712, Corning) med en tetthet på 2000 celler /brønn i et endelig volum på 20 ul /brønn. Cellene ble deretter behandlet i 24 timer med 60 ug /ml IAE, 10 uM staurosporin eller kjøretøy bare. Luminescens ble målt i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av Polarstar Omega (BMG Labtech).
DNA-fragmentering analyse
BrdU-merkede DNA-fragmenter i cytoplasma av behandlede HT-29 celler ble kvantifisert ved hjelp av Cellular DNA Fragmentering ELISA kit (Roche Diagnostics). Kort sagt ble HT-29-celler sådd ut i 96-brønners plater (TPP) med en tetthet på 13.000 celler /brønn i nærvær av 10 pM 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) og inkubert i 2 dager ved 37 ° C. Supernatanten ble fjernet og cellene ble behandlet i 6 timer med IAE, STS eller kjøretøy som angitt i det tilsvarende resultater figuren. De cytosoliske fraksjoner ble høstet og analysert på en 96-brønners halvareal klar høy-bindende mikroplate (# 3690, Corning). Cellefrie prøver ble brukt som bakgrunn kontroll for subtraksjon, og data ble normalisert til kjøretøy-behandlede celler.
phosphatidylserine eksternalisering (annexin V) assay
eksternalisering av fosfatidylserin ble analysert ved hjelp av annexin- V-FLUOS Farging kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, HT-29 og T84-celler ble behandlet som angitt i det tilsvarende resultater figuren og deretter merket med Annexin-V-FLUOS og propidiumjodid. Flowcytometri ble utført ved hjelp av Accuri C6 (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Data ble analysert ved hjelp FlowJo 7,6 (Tre stjerne). For bar tomten presentasjon, apoptose omfattet tidlig (annexin positiv, PI negative) og sent stadium apoptotiske hendelser (annexin positiv, PI positive).
Påvisning av reaktive oksygenforbindelser (ROS)
Dannelse av ROS ble oppdaget ved hjelp av ROS-sensitive CellROX Orange probe (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Dette celle-permeant fargestoff er ikke-fluorescerende i en redusert tilstand og utviser lys oransje fluorescens ved oksydasjon. CellROX Orange ble valgt for å måle ekstracellulære samt intracellulær ROS fordi dette fargestoff er forenlig med full mellom betingelser og krever ingen cellulær aktivering. For påvisning av ekstracellulære ROS, ble CellROX Orange fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 10 uM i hel cellekulturmedium, og IAE og testforbindelser ble tilsatt som angitt i det tilsvarende resultater figuren. Målingen ble utført i sort 96-brønners plater (# 655090, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland) i et sluttvolum på 150 ul /brønn. For å øke assay følsomhet, ble det fargestoff som er beskyttet mot atmosfærisk oxygen ved tilsetning av et tettende lag med 100 ul mineralolje (Luxcel Biosciences, Cork, Irland) til hver brønn. Fluorescens intensitet (529/590 nm) ble registrert i 24 timer ved 37 ° C ved hjelp av Polarstar Omega (BMG Labtech). Fluorescens verdier ved tid null ble trukket for dataanalyser GraphPad Prism 5.0. For deteksjon av intracellulær ROS, ble HT-29-celler sådd ut i 12-brønners plater (TPP, Biochrom) med en tetthet på 250.000 celler /brønn en dag før behandling. Etter behandling med IAE, MD eller bærer, ble cellene trypsinert og deretter vasket med PBS. Pelleterte celler ble resuspendert i 1 ml av 5 uM CellROX Orange i PBS og inkubert i 20 minutter ved 37 ° C. For å fjerne uinkorporert fargestoff ble cellene vasket og resuspendert på nytt i PBS før flowcytometri deteksjon (ved hjelp av en Accuri C6-enheten). Data ble analysert ved hjelp FlowJo 7,6 (Tre stjerne) og GraphPad Prism 5.0.
Påvisning av lipidperoksidasjon
Dannelse av cellulære lipid peroksider ble undersøkt ved hjelp av Click-iT lipidperoksidasjon analyse (Life Technologies ). Denne analysen gjør bruk av linoleamid alkyn (LAA, alkyn-modifisert linoleic acid) som sammen med cellemembraner. LAA kan bli oksidert som resulterer i alkyn-modifiserte proteiner som kan merkes ved hjelp av en azid-modifisert Alexa Fluor 488 fargestoff gjennom kobber-katalysert klikk kjemi. Således, er et stadig økende fluorescens intensitet detektert på grunn av forbedret lipidperoksidasjon etter behandling. En dag før behandling av HT-29 celler ble sådd i 12-brønns plater med en tetthet på 250.000 celler /brønn. Cellene ble deretter behandlet i 24 timer med IAE eller menadion i nærvær av 50 uM LAA. Etter trypsinering ble cellene vasket med PBS og fiksert i 3,7% formaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket i PBS igjen, permeabilisert ved anvendelse av 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved romtemperatur og deretter blokkert ved tilsetning av 1% BSA i 30 minutter ved romtemperatur. Gjenværende BSA ble fjernet ved omhyggelig vasking av cellene med PBS. Pelleterte celler ble inkubert med 500 ul Klikk-iT reaksjon cocktail i 30 minutter ved romtemperatur i henhold til produsentens protokoll. Klikke Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 1% BSA /PBS. Cellene ble igjen vasket og resuspendert med PBS. Flowcytometri ble utført ved hjelp av Accuri C6 enheten. Data ble analysert ved hjelp FlowJo 7,6 (Tre stjerne) og GraphPad Prism 5.0.
Fluorescensmikroskopi
For visualisering av lipidperoksidasjon hjelp av Click-iT lipidperoksidasjon metode HT-29 celler ble sådd på 13 mm dekkglass plassert i 24 brønners plater med en tetthet på 125.000 celler /brønn en dag før behandling. -Celler ble behandlet i 24 timer med IAE eller menadion i nærvær av 50 uM linoleamid-alkyn (LAA). Etterpå ble adherente celler vasket med PBS og fiksert i 3,7% formaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket i PBS, permeabilisert ved anvendelse av 0,5% Triton X-100 i PBS (PBS-T) i 10 min ved romtemperatur og ble blokkert ved tilsetning av 1% BSA i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, 250 pl Click-iT reaksjon cocktail ble tilsatt i henhold til produsentens protokoll og cellene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonene ble stanset ved vasking med 1% BSA i PBS, og cellene ble igjen vasket med BSA-fri PBS. Dekkglass ble til slutt motfarget med forlenge gull Antifade Mountant oppløsning (inneholdende DAPI) og inkubert i 24 timer ved romtemperatur. Fluorescens mikroskopi ble utført ved hjelp av en LSM700 instrument (Zeiss, Jena, Tyskland).
For deteksjon av spaltede PARP, ble HT-29 celler sådd på 13 mm dekkglass (Sarstedt, Nürnbrecht, Tyskland) og plassert i 24 brønners plater (Nunc, Wiesbaden, Tyskland) med en tetthet på 125.000 celler /brønn en dag før behandling. -Celler ble behandlet i 24 timer med IAE eller testforbindelser, ble vasket med PBS, og endelig fiksert i 4% formaldehyd /PBS i 15 min. Celler ble permeabilisert i 0,3% Triton X-100 /PBS (PBS-T) for ytterligere 10 minutter ved romtemperatur og deretter blokkert i 5% geiteserum (Sigma Aldrich) i PBS-T (0.3%) i 60 minutter ved romtemperatur . Etterpå ble cellene inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff mot spaltede PARP (# 5625, Cell Signaling Technology), som ble fortynnet (1: 200) i 1% BSA /PBS-T (0.3%). Cellene ble vasket med PBS-T (0.3%) og merket med anti-kanin IgG (H + L) F (ab «) 2-fragment Alexa Fluor 488 konjugat (# 4409, Cell Signaling Technology) fortynnet (1: 1000) i 1% BSA /PBS-T (0,3%) i 1 time ved romtemperatur.
F-aktin ble farget med Texas Rødt-X phalloidin (Life Technologies) i 30 minutter ved romtemperatur. Til slutt, ble dekkglass motfarget ved hjelp forlenge gull Antifade Mountant oppløsning (inneholdende DAPI) og inkubert i 24 timer ved romtemperatur. Fluorescens mikroskopi ble utført ved hjelp av en LSM700 enhet (Zeiss, Jena, Tyskland).
Cvtotoksisitetsmålinq
For å undersøke effekten av IAE på celle-levedyktighet i tykktarmskreft og primærceller, søkte vi den CytoTox-Glo Cytotoksisitet assay (Promega, Mannheim, Tyskland), som beskrevet nylig [11]. Derfor ble HT-29 og CCD 841 Con-celler sådd ut i sorte 384-brønners plater (# 3712, Corning, Wiesbaden, Tyskland) med en densitet på 5000 celler /brønn i et endelig volum på 25 ul /brønn. Cellene ble behandlet i 24 timer med konsentrasjonsrekke av IAE ved tilsetning av 10 ul av en 3,5-gangers lager konsentrasjon. Etter behandling luminescens ble målt ved hjelp av Polarstar Omega-enheten (BMG Labtech). Levedyktighet ble beregnet ved subtraksjon av døde celler luminescens fra total luminescence verdier. Data ble montert ved hjelp GraphPad Prism 5,0 ifølge ligningen. Y = Bottom + (Top-Bottom) /(1 + 10 ^ ((X-LogIC50))
Tumor xenograft studie
Å studere
in vivo
effekt av IAE for behandling av menneskelig CRC, ble en tumorvekstinhibitering studie utført ved hjelp av HT-29 tumor xenograft mus modell. studien ble godkjent 13. august
th 2014 av Charles River Discovery Research Services NC Animal Care og bruk komité og gjennomført av Charles River Discovery Research Services (Morrisville, NC, USA). Dyrevelferd av Charles River Discoforskningstjenester ble godkjent av US Office of Laboratory Animal Welfare 14. desember
th 2011 for tidsperioden mellom 14 2011 desember til 31. oktober
st 2015 (identifikasjonsnummer A4358-01). studien ble utført i samsvar med Charles River Discovery forskningstjenester NC og US Public Health service retningslinjer (dyrestudie protokollnummer:. # 980702) Kort, 36 kvinnelige atymiske nakne (NCR nu /nu) mus ble implantert med 5 millioner HT-29 celler subkutant i flanken. På dagen for inokulering, ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (n = 18), og oralt gavaged bidaily i 4 uker med 50 mg /kg IAE i deionisert vann eller med kjøretøy bare. Tumor volum og kroppsvekt ble overvåket under hele eksperimentet ved Charles River Discovery forskningstjenester og dokumentasjon av data ble sendt til forfatterne av denne artikkelen for dataanalyse. Ved slutten av behandlingen, ble tumorer oppsamlet, veid og lagret ved -80 ° C før videre analyser. Blod ble oppsamlet ved hjertepunksjon terminal i henhold til isofluran anestesi, og serum ble analysert ved klinisk kjemi testing ved Charles River.
Statistiske analyser
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien (SEM) hvis ikke annet er angitt. Statistiske tester ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism 5,0. For sammenligning av to grupper statistisk signifikans ble undersøkt av uparet to-tailed t-test hvis ikke annet er angitt. For multiple sammenligninger data ble analysert ved enveis ANOVA med påfølgende Dunnetts post test. En
p
verdi ≤ 0,05 ble definert som statistisk signifikant.
Resultater
IAE hemmet spredning av kreftceller og indusert G2 /M cellesyklus arrest
for å undersøke effektene av IAE for spredning av kolorektal kreft, ble HT-29 og T84-celler behandlet med konsentrasjonsrekke av IAE i 72 og 96 timer (avhengig av varierende tid som er nødvendig for celle proliferasjon av HT-29 og T84-celler), henholdsvis. Celleformering ble bestemt ved måling av cellulært DNA-innhold. IAE inhiberte proliferasjon av HT-29 og T84 kolon karsinom celler på en konsentrasjonsavhengig måte med IC
50-verdier (gjennomsnitt ± SD) til 6 ± 1 ng /ml (Fig 1 A) og 9 ± 1 ug /ml ( figur 1 B), respektivt.
Inhibering av proliferasjon av HT-29 colon cancerceller (A), T84 tykktarmskreftceller (B), PC-3 prostata kreftceller (C), MCF7 brystcancerceller (D ) og normal CCD 841 CoN (colon) celler (E) etter behandling med IAE og et lite panel av kreftmedisiner (nemlig irinotekan, 5-FU og oxiliplatin). Celler ble behandlet med konsentrasjonsrekke av IAE og forbindelser som i 3 dager (A og C) og 4 dager henholdsvis (B og D, E). Det relative antall celler ble bestemt ved måling av cellulært DNA-innhold via fluorescerende fargestoff-binding. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 4).
I den innledende fase av studien, vi i tillegg testet to ubeslektede kreftcellemodeller, nemlig PC-3 (prostata) og MCF7 (bryst ), til omtrent utelukke cellespesifikke effekter av IAE. I likhet med de to tykktarmskreft-modeller, IAE indusert hemming av proliferasjon (IC
50 verdier på 44 ± 4 ug /ml (figur 1C) i PC-3 og 11 ± 1 ug /ml (figur 1D) i MCF7-kreftcellene , henholdsvis). Disse resultatene antydet at effektene av IAE ikke var begrenset til tykktarm carcinoma-celler.
Som cytotoksiske anticancer legemidler irinotekan, 5-fluorouracil (5-FU) og oksaliplatin, IAE viste behandlings efficacies mellom 70 og 80%, noe som indikerer en fraksjon på 20-30% av fortsatt prolifererende kreftceller etter behandling (figur 1, tabell 1). Generelt IC
50 verdien av IAE var omtrent en størrelsesorden høyere enn de anvendte forbindelser. Spesielt i normale CCD 841 con celler (primær kolon celler som stammer fra et spedbarn), ble spredning hemmet av IAE-og også med 5-FU og oxaliplatin-at IC
50 verdier som var omtrent en størrelsesorden lavere enn for kreftcellelinjer (figur 1E og tabell 1). På den annen side, i forhold til kreftceller i primære tykktarmceller hemming effektivitet var tydelig lavere, noe som indikerer et høyere antall fremdeles prolifererende normale tykktarmceller i forhold til de testede kolon kreftceller.
cellulær proliferasjon er vanligvis knyttet til progresjonen av cellesyklusen [12]. Vi spurte derfor om de observerte antiproliferative virkningene av IAE er et resultat av endringer i cellesyklus regulering. Vi behandlet HT-29 colon carcinoma celler med 30 ug /ml IAE i 24 timer og analysert celler etter propidiumjodidfarging ved strømningscytometri. IAE behandling resulterte i signifikant akkumulering i G2 /M fase (40 vs. 24%) med samtidig reduksjon i G0 /G1 (35 vs. 58%) og S-fasen (9 vs. 14%, figur 2A). IAE ytterligere økt antall celler i den fase SubG1 (17 vs 3%), noe som indikerer induksjon av apoptose i disse celler.
A, Cell cyklus ble analysert ved hjelp av strømningscytometri av propidiumjodid fargede celler. Histogrammer (øverst) viser en representant eksperiment for hver behandling tilstand. Bar tomter (nederst) viser prosent av cellepopulasjonen i apoptotiske SubG1, G0 /G1, S og G2 /M faser av cellesyklus og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). * P≤0.05, *** p≤0.001 vs. kontroll. B, Whole cellelysater ble analysert for ekspresjon av cyclin A2, cyklin D3, CDK2, CDK4, CDK6 og GAPDH proteiner ved immunoblotting ved bruk av spesifikke antistoffer.
Videre har vi analysert ekspresjonen av cellesyklusregulerende proteiner ved immunoblotting. I samsvar med den flowcytometri data, IAE behandling reduserte ekspresjon av cykliner A2 og D3, og av den cyklin-avhengige kinaser (CDK) 2, 4, 6 (figur 2B). Totalt sett de observerte endringene i uttrykk av cellesyklusregulerende proteiner samt den observerte G2 /M arrest muligens står for celleveksthemmende effekter av IAE i kolorektal kreftceller.
IAE behandling aktivert caspases, indusert DNA fragmentering og resulterte i phosphatidylserine eksternalisering i kolon carcinoma celler
Aktivering av caspase signalnettverk er et kjennetegn på apoptose, koble ytre og indre stimuli med nedstrøms apoptotiske hendelser. For å kaste mer lys over effekten av IAE på mobil caspase signalnettverk har vi målt enzymatisk aktivering av et panel av caspases bruker luminometric analyser. Behandling av HT-29-celler med 60 ug /ml IAE i 24 timer viste ingen effekt på kaspasene 2 og 6. Imidlertid, i HT-29-celler IAE behandling resulterte i en signifikant tre-ganger økning av aktiviteten av effektor kaspasene 3 /7, i likhet med anvendelsen av 10 uM staurosporin (STN, 4-dobling). Lignende effekter kan observeres ved bruk av en alternativ (metastatisk) tykktarmskreft modell (T84 celler), bekreftende resultatene stammer fra HT-29 cellemodell (figur 3A).
A, HT-29 og T84 celler behandlet i 24 timer. Enzymatisk aktivering av kaspaser 2, 3/7, 6, 8 og 9 ble bestemt ved bruk av luminescens-baserte analyser. Dataene er normalisert til å styre behandlingen, og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 4). B, Whole cellelysater fra HT-29 celler ble behandlet i 24 timer ble analysert for ekspresjon av total og spaltede proteiner av kaspase 3, caspase 9 og PARP ved immunblotting. Tallene angir densitometriske prosenter av det spaltede til totale proteiner normalisert å kontrollere behandlinger. C, fluorescens mikroskopi av HT-29 celler ble behandlet i 24 timer. Spaltes kaspase 3 ble merket grønn, F-aktin rød og blå kjernen. Skala barer, 25 mikrometer. D, HT-29 celler ble behandlet i 6 timer. DNA-fragmentering ble påvist ved akkumulering av cytoplasmatisk BrdU-merket DNA ved hjelp av ELISA. Dataene er normalisert til å styre behandlingen, og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 5). N.S. ikke signifikant, * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 vs. kontroll.
Av notatet, IAE behandling økte aktiviteten av begge, caspase 8 og caspase 9, omtrent fire ganger (figur 3A), som indikerer induksjon av den ytre (død reseptormediert), så vel som den indre (mitokondrielle mediert) reaksjonsvei av apoptose i HT-29 celler. Som påvist ved immunblotting, vi i tillegg observert indusert spaltning av effektoren kaspase 3, således som bekrefter oven påvises aktivering. IAE behandlingen videre resulterte i omtrent 9-ganger øket spaltning av kromatin-assosiert poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (figur 3B). PARP cleavage ble også validert av fluorescens mikroskopi (Fig 3C). Siden PARP er kjent for å bli aktivert ved DNA-skade, vi videre undersøkte effekten av IAE på DNA-integritet. I tråd med PARP-spaltning, BrdU-merking forsøk viste forhøyede nivåer av cytosoliske DNA i HT-29 celler behandlet med 60 ug /ml IAE i 6 timer, noe som indikerer apoptotisk DNA-fragmentering ved IAE behandling (figur 3D).
Hos friske celler fosfatidylserin (PS) blir generelt begrenset til den indre paknings av cellemembranen, og eksponering av fosfatidylserin på den ytre paknings er ansett som et kjennetegn på apoptose [13]. Vi behandlet således colon carcinoma celler med 60 ug /ml IAE i 48 timer og bestemt PS eksternalisering ved flowcytometri av annexin V-FLUOS /propidiumjodid-merkede celler. IAE økt betydelig antall av apoptotiske celler fra 6% til 22% i HT-29 (figur 4A) og fra 43% til 53% i T84-celler (figur 4B). Lignende observasjoner ble gjort med lave doser av anticancer stoff paclitaxel (5-50 nM) (figur 4). Samlet disse data viser at IAE effektivt indusert apoptose i humane tarmkreftceller.
Annexin V analyser av HT-29 (A) og T84 (B) colon carcinoma celler etter behandling med IAE i 48 timer. Apoptose ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri av annexin V-FLUOS og propidiumjodid fargede celler. Spredningsplott viser en representant eksperiment for hver behandling tilstand. Bar plott angir prosentandelen av apoptotiske celler, omfattende tidlig (annexin-positive, negative PI) og sent stadium (annexin-positive, PI positive) arrangementer. Linjene representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 3). * P≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 vs. kontroll.
Bemerkelsesverdig, kreftceller har en ubalanse av reaktive oksygenforbindelser (ROS). Siden forhøyede konsentrasjoner av ROS kan indusere apoptose, kunne øke oksidativt stress til kreftceller være en lovende strategi for behandling [14].
