Abstract
Differensial Redox homeostase i normale og maligne celler antyder at pro-oksidant-indusert oppregulering cellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS) bør selektivt målet kreftceller uten å ødelegge levedyktigheten til ikke-transformerte celler. Følgelig kan en pro-oksidant avvik godt tolerert av ikke-ondartede celler raskt nå en celle-død terskel i maligne celler som allerede er på et høyt børverdi av konstitutiv oksidativt stress. For å teste denne hypotesen, vi tok fordel av et utvalgt antall amin-pyridin-baserte Fe (II) komplekser som opererer som effektive og robuste oksidasjonskatalysatorer av organiske substrater ved reaksjon med peroksider. Fem av disse Fe (II) -complexes og de tilsvarende aminopyridine ligander ble valgt til å evaluere sine kreft egenskaper. Vi fant at jernkomplekser unnlatt å vise noen relevant aktivitet, mens de tilsvarende ligander utstilt betydelig antiproliferativ aktivitet. Blant ligander, noe som var hemolytisk kan forbindelser 1, 2 og 5 var cytotoksisk i lavt mikromolområde mot et panel av molekylært forskjellige humane kreftcellelinjer. Viktigere, den cytotoksiske aktiviteten profilen av noen forbindelser forble uforandret i epitelial-til-mesenchymale (EMT) -indusert stabile populasjoner av kreft stilk-lignende celler, som oppnådd resistens mot de kjente ROS induser doksorubicin. Forbindelser 1, 2 og 5 inhiberte clonogenicity av kreftceller og indusert apoptotisk celledød ledsaget av caspase 3/7 aktivering. Flowcytometri analyser indikerte at ligander var sterke indusere av oksidativt stress, som fører til en 7-dobling i intracellulære ROS nivåer. ROS induksjon var forbundet med deres evne til å binde intracellulære jern og generere aktive koordinasjonskomplekser på innsiden av celler. I motsetning til dette, ekstracellulære kompleksdannelse av jern inhiberte aktiviteten av ligandene. Jernkomplekser viste en høy kompetanse til å spalte DNA gjennom oksidative avhengige mekanismer, noe som tyder på en sannsynlig mekanisme for cytotoksisitet. I sammendrag, rapporterer vi at ved chelatering av intracellulær jern, pro-oksydant aktivitet av amin-pyrimidin-baserte jernkomplekser effektivt dreper kreft og kreft stilk-lignende celler, og dermed gi funksjonelle bevis for en effektiv familie av redoks-rettede anti- kreft metallodrugs
Citation:. González-Bártulos M, Aceves-Luquero C, Qualai J, Cussó O, Martínez MA, Fernández de Mattos S, et al. (2015) Pro-Oxidant aktivitet av amin-Pyridin-Based Iron Komplekser effektivt dreper kreft og Cancer Stem-lignende celler. PLoS ONE 10 (9): e0137800. doi: 10,1371 /journal.pone.0137800
Redaktør: Sujit Kumar Bhutia, Nasjonalt institutt for teknologi Rourkela, INDIA
mottatt: 5 mai 2015; Godkjent: 21 august 2015; Publisert: 14. september 2015
Copyright: © 2015 González-Bártulos et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), CONSOLIDER-INGENIO 2010 CSD2010-00065, og fra Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) , SAF2012-38914, Plan Nacional de jeg + D + I
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP gjennomgå metabolske tilpasninger for å opprettholde sin ukontrollert vekst og spredning. Forskjellige indre og ytre molekylære mekanismer bidra i denne metabolske omprogrammering å forsyne kreftceller med tilstrekkelig energi og biosyntetiske kapasitet i tumormiljøet [1,2]. Endret metabolisme sammen med aktivert onkogene signalisering og deregulering av mitokondriell funksjon vanligvis resulterer i en økning i dannelsen av reaktive oksygenarter (ROS) i kreftceller [3,4]. Interessant, fører dette fenomenet til en differensial redoks-homeostase i normale og maligne celler som er å få fotfeste som et lovende mål for utforming av mer selektive og effektive anticancermidler [5-8].
Meget reaktive ROS produseres i celler ved ufullstendig reduksjon av molekylært oksygen til vann under aerob metabolisme. ROS er normalt reguleres av cellulære forsvars antioksydanter [9,10] og delta i flere cellulære funksjoner inkludert signaltransduksjon, enzymaktivering, genekspresjon og protein posttranslasjonelle modifikasjoner [11]. Når generert i overskudd eller når effektiviteten av celleantioksidantsystem er submaksimal, ROS akkumulere og forårsake irreversible celleskade gjennom oksydasjon av biomolekyler så som lipidmembraner, enzymer eller DNA som generelt fører til cellulær død [12]. ROS kan også fremme kreft initiering og progresjon ved å indusere DNA-mutasjoner og pro-onkogene signaliseringsreaksjonsveier [13,14].
Økt ROS i kreftceller oppregulerer antioksidant respons, noe som resulterer i en ny redoks-balanse som gjør det mulig for disse cellene å opprettholde høyere ROS-nivåer enn normale celler. Følgelig kreftceller oppviser vedvarende oksidativt stress, som fremmer celle-proliferasjon, men er utilstrekkelig til å forårsake cellulær død [4,13]. Denne endrede homeostase gjør kreftcellene sårbare for eksogene oksidasjonsmidler som genererer ekstra ROS, som trolig vil øke oksidativt stress nivåer over cytotoksiske terskel. Dette mottakelighet er forsterket av den begrensede kapasiteten til kreftceller til å styrke antioksidant respons for å nøytralisere oksidativt fornærmelse [15]. I kontrast til normale celler tolerere høyere nivåer av eksogent ROS spenning ettersom de oppviser lavere konstitutive ROS-nivåer sammen med en overlegen respons av antioksidantsystem. Faktisk er det vel beskrevet som, i tillegg til de direkte effekter på DNA og celledeling, virkningsmekanismen av mange kjemoterapeutiske midler så som 5-fluoruracil, bleomycin, cisplatin, doksorubicin eller paclitaxel også omfatter ROS-mediert apoptose [13 , 16-19].
Mens de biologiske effektene av ROS og mekanismene som regulerer ROS-nivåer er godt etablert i kreftceller, er lite kjent om rollen ROS i kreftstamcelle (CSC) undergruppe, som viser en høy evne til selvfornyelse og differensiering og også potensial til å generere svulster med en markert kjemo- /radio motstand [20,21]. Cscs inneholder lavere nivåer av ROS enn ikke-cscs, sannsynligvis som en konsekvens av forbedrede fri-radikal fjernende systemer [22]. Lave nivåer ROS kan være relatert til den priviligerte status av denne undergruppe av celler, bevare integriteten DNA og protein-funksjon, som er kritisk for å opprettholde muligheten for selvfornyelse og stemness [23,24]. Dermed kan eksogent ROS høyde være en tilnærming for å drepe CSC undergruppe, som normalt anrikes etter konvensjonell kjemoterapi. Faktisk niclosamide og Arsenikk (AS
2o
3), som er potente ROS inductors, har vist seg å fremme CSC død [25].
En rekke legemidler mot kreft som er rettet mot mobil Redox balanse er i forskjellige faser av preklinisk og klinisk utvikling [5,6]. Mekanistisk, disse agentene enten hemme cellulære antioksidant forsvarssystemer [27-29] eller generere ROS [30-32]. I tillegg til disse midler, kan overgangsmetall-baserte forbindelser være lovende kandidater for pro-oksiderende behandling. Når akkumulert i cellene, metaller som jern, mangan og kobber, gjennomgår sykling redoks-reaksjoner som genererer høye nivåer av ROS, først og fremst de svært skadelige hydroksylradikal arter gjennom Fenton reaksjonen. Dette metal-mediert form av oksidativt stress er en velkjent årsak til celledød [33], og dermed et økende antall undersøkelser utforsker potensialet i metallodrugs i redoks-baserte anticancer behandling [34-37].
overgangsmetallkomplekser med aminopyridine holdige organiske stillas har dukket opp som effektive katalysatorer for oksidasjon av organiske substrater. Disse kompleksene er også ansett som bioinspired katalysatorer, siden de formerer strukturelle og reaktivitet egenskaper oksidative enzymer. En sentral del av sin aktivitet er deres sterke binding til jern og mangan ioner, genererer kraftige oksidanter etter reaksjon med peroksider [38-43]. Disse oksyderende midler virker som katalysatorer for å fremme oksydasjon av inerte molekyler, slik som alkaner, alkener og til og med den utfordrende vannmolekylet. Virkningsmekanismen innebærer treverdig-peroxide arter, kjemisk minner til aktivert bleomycin. I tillegg er disse forbindelsene er svært motstandsdyktig mot selv-oksidasjon. Med dette som bakgrunn, vi her vurdert de antiproliferative og cytotoksiske aktivitet profiler av fem amino-pyridin-baserte Fe (II) -complexes som tidligere har blitt vist å være spesielt aktive i peroksyd aktiveringsreaksjoner [38-43], og det tilsvarende metall- frie ligander, mot et panel av forskjellige humane cellelinjer inkludert epitelial-til-mesenchymale (EMT) -indusert stabile populasjoner av kreft stilk-liknende celler og ikke-maligne celler. De mest aktive forbindelser ble videre analysert for deres evne til å hemme clonogenicity av kreftceller, modulere cellesyklusen og indusere celledød. Kapasiteten av de amin-pyrimidin-baserte jernkomplekser for å generere ROS og føre til DNA-skade ble evaluert sammen med påvirkning av chelatering av intracellulære jern på deres cytotoksiske profil. Basert på den dødelige avbrudd i redoks balanse forårsaket av disse kompleksene i kreft og ROS-resistente kreft stilk-lignende celler, gir vi sterke funksjonelle bevis for en effektiv familie redoks-rettet anti-kreft metallodrugs.
Materialer og Methods
Material
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), dimetylsulfoksyd (DMSO), propidiumjodid (PI) , deferoxaminemesylate salt (DFO), N-acetyl-L-cystein (NAC), calcein-acetoxymethylester (kalsein-AM), cacodylat buffer, Tris-EDTA (etylen-diamino tetraeddiksyre), Tiron, natriumazid, metylgrønt, Hoechst , etidiumbromid, bromfenolblått, xylencyanol, glycerol og RNase A var fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Metylenblått, hydrogenperoksid 35% (vekt /volum) og etanol var fra Panreac (Barcelona, Spania). HEPES var fra ICN (Madrid, Spania). Triton-X100 var fra Pluss én (Amersham Bioscience, Uppsala, Sverige). 2 «, 7»-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (H
2DCFDA) var fra Molecular Probes (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Agarose var fra Ecogen (Barcelona, Spania). Cisplatin (Pharmacia, Pfizer Inc, Kalamazoo, MI, USA) ble vennlig levert av apoteket av den katalanske Institute of Oncology (ICO, Hospital Dr. Josep Trueta, Girona, Spania). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), RPMI-1640-medium, fosfatbufret saltvann (PBS), føtalt bovint serum (FBS), ble penicillin-streptomycin og trypsin oppnådd fra GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA). DMEM /F12, hesteserum og insulin var fra Invitrogen. Hydrokortison, koleratoksin og epidermal vekstfaktor var fra Sigma-Aldrich. Mammary epithelial Cell vekstmedium (MEGM) var fra Lonza (Berkshire, UK). PUC18 plasmid var fra Thermo Scientific (Waltham, MA, USA). Forbindelser valgt for dette studium (1, 1-Fe, 2, 2-Fe, 3, 3-Fe, 4, 4-Fe, 5 og 5-Fe) ble syntetisert ved å følge fremgangsmåtene rapportert [38-41].
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Menneske MCF-7 brystkreft cellelinje CAPAN-en bukspyttkjertelkreft cellelinje, PC-tre prostatakreft cellelinje, Z-138, Jeko-en, Granta og SP53 non-Hodgkins lymfom cellelinjer, JURKAT T-celle akutt lymfoblastisk leukemi-celler, LN229 og U87MG gliom cellelinjer og MCF 10A immortalisert mammary epitelisk cellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). CCD-18Co menneskelige kolon fibroblast cellelinje ble hentet fra EucellBank (University of Barcelona, Barcelona, Spania). 1BR3G transformerte humane hudfibroblaster ble oppnådd fra European Collection of Cell Cultures (ECACC, Porton, UK). MCF-7, CAPAN-1, PC-3, LN229 og U87MG ble opprettholdt i DMEM. Hematologiske cellelinjer ble holdt i RPMI-1640. Alle media ble supplert med 10% FBS og 100 U /ml penicillin-streptomycin. Medium for JUKART ble Jeko-1 og Z-138 celler supplert med 25 mmol /l HEPES. MCF 10A-celler ble holdt i DMEM /F12 supplert med 5% hesteserum, 500 ng /ml hydrokortison, 100 ng /ml koleratoksin, 10 ug /ml insulin og 20 ng /ml epidermal vekstfaktor. HMLE celler (udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller), HMLER celler (HMLE celler som overuttrykker hTERT, SV40 T /T og H-RasV12) og HMLERshEcad kreft stamceller lignende celler (HMLER celler omdannes via kort hårnål RNA til å hemme uttrykk for CDH1 genet, som koder for E-cadherin) [44], ble opprettholdt i en 1: 1 blanding av HMLE medium (DMEM /F-12 pluss 5% hesteserum, penicillin-streptomycin-glutamin (PSG), 10 ug /ml insulin, 10 ng /ml epidermal vekstfaktor og 0,5 g /ml hydrokortison) og MEGM. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C under en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO
2
cytotoksisitetsanalyser
Den cytotoksiske aktivitet av forbindelsene ble bestemt ved MTT-reduksjon analyse som beskrevet [ ,,,0],45]. Forbindelser ble fortynnet i Milli-Q vann for å oppnå en mmol /L-stamløsninger. Passende porsjoner av disse oppløsninger ble fortynnet i den tilsvarende cellekulturmedium for å oppnå de endelige arbeidskonsentrasjoner. Aliquoter av 5000 1BR3G celler, 6000 MCF-7, 6000 PC-3 celler, 10 000 CAPAN-1 celler, 4000 MCF 10A celler, 4000 HMLE celler eller 4000 CCD-18Co-celler ble sådd ut i 96-brønners plater, 24 timer før behandlinger. Hematologiske cellelinjer ble sådd ut på 400 000 celler /ml. Celler ble behandlet med den tilsvarende forbindelse i konsentrasjoner som varierer fra 0 til 100 umol /l i 48 timer. Tre replikater for hver forbindelse ble anvendt. IC
50 ble etablert for hver forbindelse med standard ikke-lineær regresjon og kurvetilpasning ved hjelp GraphPad Prism (Graf Pad programvare Inc., La Jolla, CA, USA).
Hemolytisk analysen
hemolytisk aktivitet av forbindelsene ved 100 umol /l ble evaluert ved å bestemme hemoglobinfrigjøring fra erytrocytt-suspensjoner av friskt humant blod (5% vol /vol) som beskrevet [46].
kolonidannelse assay
MCF-7-celler ble sådd ut i 12-brønners plater. Tjuefire timer senere ble cellene behandlet med cisplatin, forbindelse 1, 2 eller 5 til 10 umol /L, eller bærer alene som en kontroll, i 3 og 24 timer ved 37 ° C. I tillegg ble cellene eksponert til forbindelse 1 for 3, 6, 12 og 24 timer. Deretter ble cellene vasket med PBS, samlet opp med trypsin og sådd ut ved lav tetthet (3000 celler i en 360 mm skål). Cellene fikk dele og danne kolonier i 7-10 dager, hvoretter, ble kolonier fiksert og farget med 2% metylenblått i 50% etanol. Antallet kolonier i hver plate ble bestemt ved hjelp av Alpha Innotech Imaging system (Alpha Innotech, San Leandro, CA).
caspase aktivitet analyse
Enzymatisk caspase aktivitet ble bestemt etter utsette cellene til forbindelse 1, 2 og 5 til 10 pmol /l i 48 timer. Caspase 3/7 aktivitet ble målt med luminometric caspase-Glo 3 /7assay (Promega, Madison, WI, USA) med en Synergy HT multi-gjenkjenning mikroplateleser (Bio-Tek).
Cell syklus analyse
Cell sykkelprofiler ble analysert ved flowcytometri av PI-farget celler. I korthet ble cellene oppsamlet ved sentrifugering, vasket i iskald PBS og fiksert i 30 minutter ved 4 ° C i 70% etanol. Etter vasking to ganger med PBS, ble DNA farget med 50 ug /ml PI i nærvær av 50 pg /ml RNase A. fargede celler ble deretter behandlet ved hjelp av et FACScan strømningscytometer (Coulter Epics XL-MSL, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) og winMDI programvare.
ROS plater reduseres
Cellular ROS innholdet ble bestemt ved bruk av 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetate probe (H
2DCFDA). Celler ble sådd ut i 24-brønners plater (50 000 celler /brønn) i fenolrødt-fritt DMEM 24 timer før behandling. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av forbindelse 1, 2 og 5 (2,5, 5 eller 10 umol /L) eller bærer alene som en kontroll, i 5 eller 24 timer ved 37 ° C. I noen forsøk ble cellene ko-behandlet med forbindelsene pluss 5 mmol /l NAC. Etter behandling ble cellene vasket med PBS og inkubert med 1 pmol /l H
2DCF-DA i PBS i 30 minutter i mørket. Etter vask ble cellene samlet med trypsin og analysert ved flowcytometri ved hjelp av en FACS-Calibur strømningscytometer (Becton-Dickinson®, Immunofluorometry Systems, Mountain View, CA, USA). Det geometriske gjennomsnittet fluorescens intensitet på 10 000 celler ble etablert ved hjelp CellQuestTM programvare (Becton Dickinson). Fluorescens fold-økning mot ubehandlede celler ble bestemt for hver behandling.
Fastsettelse av mobilnettet labil jern basseng
Mobil labile jern utvalget ble bestemt med calcein-AM. CAPAN-1-celler (125 000 celler /brønn) ble sådd ut i 24-brønners plater og inkubert i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet i 24 timer med 10 umol /l av forbindelse 1, 2 eller 5 ved 37 ° C. I noen eksperimenter, ble cellene inkubert i 2 timer med 100 umol /L av DFO eller 100 umol /l FeCl ^
2. Celler eksponert til kjøretøyet alene ble brukt som en kontroll. Etter behandling ble cellene vasket med PBS og inkubert med kalsein-AM (0,25 umol /L) i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. Deretter ble cellene vasket og samlet opp med trypsin, og det geometriske gjennomsnittet fluorescens intensitet på 10 000 celler ble bestemt ved flow-cytometri som beskrevet.
Cellular DNA-skade-analyse
DNA-skade ble bestemt ved å overvåke intensiteten av p-H2A.X fluorescens ved hjelp av flow cytometri. I korthet ble cellene oppsamlet med trypsin, vasket i PBS og fiksert i 3,7% formaldehyd i 15 minutter på is. Cellene ble deretter permeabilised med 0,2% volum /volum Triton-X100 i 10 minutter og inkubert med 1: 400 kanin-anti-p- (S139) -H2A.X antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts) i 30 minutter på is. Etter vasking i 0,1% Triton-X100 i PBS, ble celler inkubert med 1: 400-anti-kanin Alexa 555-konjugert antistoff (Jackson Immunoresearch, Newmarket, UK) i 20 minutter på is. Analysen ble utført i et FACScan flowcytometer med flytende programvare.
DNA spaltning analyse
DNA spaltning ble overvåket med agarosegelelektroforese. En stamløsning av pUC18-DNA ble ferskt fremstilt i Milli-Q vann ved en konsentrasjon på 0,5 mikrogram /ml (1512 umol /L nukleotider; 756 umol /L bp). Reaksjoner ble utført ved blanding av 0,5 mL av pUC18 med egnede aliquoter av forbindelsene og 1 mL av aktiveringsmiddel-løsning (35% vekt /vol H
2o
2 i H
2o). Kakodylat-buffer (0,1 M, pH 6,0) ble tilsatt til blandingen for å gi et endelig volum på 20 ul. Sluttkonsentrasjonen av pUC18-DNA var 37,8 umol /L i nukleotider (18,9 umol /L bp). Prøvene ble inkubert i 1 time ved 37 ° C; Reaksjonene ble stanset ved tilsetning av 6 ul av en bufferoppløsning bestående av bromfenol blått (0,25%), xylen cyanol (0,25%) og glycerol (30%). Deretter ble prøvene underkastet elektroforese i 0,8% agarosegeler i 0,5 x TBE-buffer (0,045 mol /l Tris, 0,045 mol /l borsyre, og 1 mmol /L EDTA) ved 100 V i 1 time og 40 min. Gelene ble farget med etidiumbromid (10 mg /ml i TBE) i 15 minutter og visualisert under UV transilluminasjon. DNA-band ble tatt med Progres CapturePro 2.7 system og intensiteten av hvert bånd ble kvantifisert med GelQuant versjon 2.7 software (DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) med en korreksjonsfaktor på 1,31 for å kompensere for den reduserte etidiumbromid opptak av supercoil plasmid pUC18 DNA [47]. Andelen av forskjellige former av plasmid DNA ble etablert for hver behandling. For å teste involvering av ROS i trådkutting og mulige kompleks-DNA interaksjon områder, ble forskjellige ROS fjernere og sporbindemidler tilsatt til reaksjonsblandingen. De fjerningsmidler som ble brukt var Tiron (10 mmol /L), natriumazid (0,4 mol /L), og dimetylsulfoksyd (DMSO, 3 ul). De groove bindemidler som ble brukt var metyl grønn (20 mmol /L) og Hoechst (40 mikromol /l)
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med SPSS statistisk programvare for Windows (versjon 15.0.; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitative variabler ble uttrykt som middelverdi og standardavvik (SD) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Normaliteten av dataene ble testet ved bruk av Shapiro-Wilk test. Forskjellene mellom data med normalfordeling og homogene avvik ble analysert ved bruk av parametrisk Student t-test. En verdi på p 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Valg av forbindelser
Iron koordineringskomplekser 1-Fe, to-Fe, 3-Fe, fire-Fe. og 5-Fe ble valgt for å analysere deres antitumoraktivitet mot forskjellige humane cellelinjer basert på deres evne til å danne sterke oksiderende arter i å omsette med peroksider [38-43]. Fire Fe (II) -baserte komplekser 1-Fe, 2-Fe, 3-Fe og 4-Fe inneholder firetakket aminopyridine ligander og er kjent for sine overlegne aktivitet i oksidasjonskatalyse [38-40,42,43]. Komplekset 5-Fe inneholder en pentadentat ligand og er kjent for å stabilisere høye oksidasjonstilstander av jern [41]. I tillegg er den jernfrie organiske forbindelsene 1, 2, 3, 4 og 5 ble testet for å evaluere effekten av metall ligering for deres cytotoksiske aktivitet (figur 1).
Forbindelser 1, 2 og 5 er svært cytotoksisk mot kreft og kreft stilk-lignende celler
antiproliferative aktivitet av jernkomplekser (1-Fe, 2-Fe, 3-Fe, 4-Fe og 5-Fe) og den tilsvarende jernfrie ligander (1, 2, 3, 4 og 5) ble først testet mot to tumorkreftcellelinjer, MCF-7 og CAPAN-1. Forbindelser ble testet ved forskjellige konsentrasjoner i området fra 0 til 100 umol /L for å bestemme den konsentrasjon som er nødvendig for å inhibere cellevekst med 50% (IC
50). Forbindelser med IC
50-verdier større enn 100 umol /L ble ansett å være inaktiv. Bare tre av de fem jernkomplekser (1-Fe, 3-Fe, 4-Fe) viste en målbar antiproliferativ effekt i MCF-7-celler, mens ingen av jernkomplekser var aktive mot CAPAN-1-celler (tabell 1). Den antiproliferative aktivitet av 3-Fe og 4-Fe var heller beskjeden (IC
50 = 73,5 ± 0,7 umol /L og 63,5 ± 2,1 umol /liter, henholdsvis). I motsetning til alle jernfrie ligander var cytotoksisk i begge cellelinjer analysert, med IC
50-verdier som varierer fra 3,7 ± 0,4 til 88,5 ± 0,7 pmol /l i MCF-7-celler og fra 6,0 ± 0,7 til 32,0 ± 10,4 umol /L i CAPAN-1 celler. Disse verdiene er innenfor området av veletablerte anticancer-midler slik som cisplatin undersøkes under de samme betingelsene (tabell 1). Gitt den svake antiproliferative aktivitet av jernkomplekser, fokuserte vi på metallfrie organiske forbindelser og evaluert deres cytotoksisitet mot et utvalg av tumor (PC-3, Z-138 og JUKART) og ikke-ondartet (HMLE, MCF 10A, 1BR3G og CCD-18Co) cellelinjer (tabell 2). Forbindelse 2 var den mest aktive ligand mot tumorceller, med IC
50-verdier som varierer fra 3,8 ± 0,2 til 7,2 ± 1,9 umol /l. Forbindelser 1 og 5 også oppviste lave IC
50-verdier (fra 4,8 ± 1,2 til 15,1 ± 3,1 umol /l og fra 2,9 ± 0,4 til 7,7 ± 0,3 umol /liter, henholdsvis), mens en mer moderat antitumoraktivitet ble oppnådd etter ligander 3 og 4. Bare i normal tykktarm CCD-18Co-cellelinjen aktiviteten til forbindelsene var lavere enn i tumorcellelinjer. Viktigere, ingen av ligandene ble hemolytisk, selv ved 100 umol /L (tabell 2). Den antitumor-egenskaper av ligandene ble ytterligere evaluert i et panel av cellelinjer, inkludert human leukemi, lymfom og gliom kreftceller, ved å analysere deres cytotoksiske effekter på 10 umol /L. Som forventet, forbindelsene 1, 2 og 5 viste også høy antiproliferativ aktivitet mot disse cellelinjer (figur 2A), som demonstrerer deres evne til å være bredt aktive antitumormidler.
(A) Cytotoksisk aktivitet av forbindelsene 1, 2, og 5 mot kreftceller. De angitte cellelinjer ble behandlet i 48 timer med ligander (10 pmol /L) og cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Data viser prosent av levedyktige celler i forhold til ubehandlede celler (kontroll). (B) Cytotoksisitet av doksorubicin og forbindelser 1, 2 og 5 mot CS-lignende celler. CS-lignende HMLER-shEcad celler og ikke-CS-lignende HMLER isogene parentale celler ble behandlet i 48 timer med graderte konsentrasjoner av doxorubicin, 1, 2 og 5. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. For hver behandling, prosentandel av levedyktige celler i forhold til ubehandlede celler er angitt. Data representerer gjennomsnittlig ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
For å få innsikt i den cytotoksiske styrken av ligander 1, 2 og 5, deres antiproliferative aktivitet ble evaluert i en stabil brystkreft stilk (CS) -lignende cellelinje (HMLER-shEcad). Denne cellelinjen ble opprinnelig etablert fra trippel onkogene transformert og udødeliggjort menneskelige mammary epitelceller (HMLER), hvor knockdown av E-cadherin utløst en epitelial-mesenchymale overgang (EMT) som resulterte i celler med funksjoner karakteristisk for cscs [44,48]. Som forventet, CS-lignende HMLER-shECad celler var mer resistente overfor den kjente kjemoterapimiddel doksorubicin enn ikke-CS-lignende HMLER isogene kontrollceller [48] (IC
50 = 0,3 ± 0,02 pmol /l vs 0,10 ± 0,02 mikromol /L, henholdsvis, som representerer en ~ 3 ganger økning i IC
50) (figur 2B). I motsetning til dette, den cytotoksiske profilen av ligander 1 og 2 forble stort sett uforandret i CS-lignende HMLER-shECad celler (IC
50 = 5,3 ± 0,7 umol /L og 6,8 ± 0,1 umol /liter, henholdsvis) i forhold til HMLER celler ( IC
50 = 6,5 ± 0,4 umol /L og 6,6 ± 0,3 umol /liter, henholdsvis) (figur 2B), som indikerer at disse ligandene indusere celledød gjennom en mekanisme som ikke kan ved undertrykt av kjemoresistent-CS-lignende fenotype. Videre vises sammensatte en litt selektiv cytotoksisitet mot HMLER-shECad celler. I kontrast, HMLER-shECad utstilt noen motstand mot ligand 5-indusert cytotoksisitet (IC
50 = 8,6 ± 0,5 mikromol /L sammenlignet med 5,1 ± 0,1 mikromol /l hos HMLER celler) (figur 2B).
den langvarige aktivitet av ligandene ble bestemt ved å måle deres evne til å hemme den klonogene potensialet av kreftceller. Således ble MCF-7-celler ble behandlet i 3 eller 24 timer med 10 umol /L av ligand 1, 2 eller 5, eller cisplatin som en positiv kontroll, etterfulgt av plettering ved lav tetthet. Analyse av kolonitall etter 10 dager viste en markert inhiberende virkning av forbindelse 2 på kolonidannelse og antall kolonier ble betydelig redusert med 39% sammenlignet med kontrollceller etter 3 timers eksponering til liganden (figur 3A). Videre clonogenicity av MCF-7-celler ble nesten opphevet etter 24 timers eksponering til forbindelse 2, avslører en større inhibitorisk aktivitet enn cisplatin. På dette tidspunkt kan forbindelser 1 og 5 også betydelig redusert koloni-tall med 57% og 53%, henholdsvis, selv om deres aktivitet var lavere enn forbindelse 2, som er i overensstemmelse med den antiproliferative aktivitet av ligandene (tabell 2). I motsetning til cisplatin behandling, inhibering av cellevekst ved ligander var tidsavhengig. Eksponering av MCF-7 celler til ligand 1 til 3, 5, 12 og 24 timer redusert antall kolonier med 0%, 18,7%, 40,5% og 56,6%, respektivt (figur 3B). Disse resultatene indikerer at ligandene utløse en forsinket celledød mekanisme som krever flere timer for å finne sted.
(A) kolonidannelse av MCF-7-celler etter eksponering for forbindelsene 1, 2 og 5 (10 umol /L ) for 3 eller 24 timer. Cisplatin ble inkludert som en positiv kontroll. (B) kolonidannelse etter eksponering for forbindelse 1 (10 pmol /L) for 3, 5, 12 og 24 timer. Stolpediagrammet viser prosentandelen av telles koloniene i forhold til kontroll ubehandlede celler og representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,05 versus kontrollceller.
forbindelsene 1, 2 og 5 fremme cellesyklus og apoptose
For å avgjøre om de ligander induserer cellulær død gjennom aktivering av programmert celledød (apoptose) , aktivering av kaspaser bøddelknektene, caspase-3 og -7, ble analysert ved anvendelse av en luminometric assay i et panel av humane kreftcellelinjer. Celler ble behandlet med ligandene ved 10 umol /L og kaspase-aktivitet ble målt etter 48 timer. Alle tre ligander aktivert kaspase 3/7 til en viss grad (figur 4). Forbindelse 2 behandling tydelig øket caspase 3/7 aktivitet i alle cellelinjer i sammenligning med ubehandlede kontroller. Interessant, behandling med forbindelse 1 førte til signifikant caspase 3/7 aktivering i lymfom (Z-138, Jeko-1, Granta og SP-53), men ikke i leukemi (JURKAT) eller glioma (LN229 og U87MG) cellelinjer. Forbindelse 5 induserte en bred pro-apoptotiske virkning, aktivere caspase 3/7 i de fleste cellelinjer, bortsett fra PC-3-celler, og var den mest effektive forbindelse mot Jurkat-celler (figur 4). Viktigere, disse resultatene korrelerer sterkt med profilen av cytotoksiske effekter indusert av forbindelsene 1, 2 og 5 (figur 2A), og tyder på at forbindelser 2 og 5 fremmer celledød hovedsakelig ved å indusere apoptose. Disse resultatene ble bekreftet ved å analysere effekten av caspase inhibering på den cytotoksiske aktivitet av forbindelsene. Som vist i figur 4B, pan-kaspaseinhibitor QVD-Oph vesentlig falt cytotoksisiteten av forbindelser 1 og 5 i MCF-7 og CAPAN-1-celler som induserer en økning i cellelevedyktighet som strekker seg 2,5 til 4 ganger. Verdt å merke seg, i overensstemmelse med våre tidligere observasjoner, viste forbindelse 2 en meget høy cytotoksisk aktivitet, noe som kan forklare mangelen på reversjon i nærvær av kaspaseinhibitor i disse forsøksbetingelser. Disse funnene støtter at den cytotoksiske aktivitet av disse forbindelser medfører caspase-avhengig apoptose.
(A) De angitte cellelinjer ble behandlet i 48 timer med forbindelser 1, 2 og 5 (10 umol /L) og kaspase 3 /7-aktivitet ble målt som angitt i materialer og metoder. Stolpediagrammet viser gangers økning i kaspase-aktivitet i forhold til ubehandlet (kontroll) og representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (B) MCF-7 og CAPAN-1-cellene ble behandlet i 48 timer med ligandene (10 uM) i fravær (-) eller nærvær (+) av de pan-kaspaseinhibitor QVD-Oph (20 uM) og cellelevedyktighet ble målt med MTT-analysen. Dataene viser den prosentandel av levedyktige celler i forhold til ubehandlede celler (kontroll). Dataene representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Forskjellene mellom fravær og nærvær av QVD-OPh behandling var statistisk signifikant på * p 0,05, ** p 0,01 og *** p. 0,001
For å utforske effekten av ligander på celle syklusutvikling, cellesyklusfordelingen av MCF-7 og LN229-celler ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri etter 24 og 48 timers eksponering for forbindelsene 1, 2 og 5 (10 umol /L).
