Abstract
Strålebehandling (RT) fortsetter å være en av de mest populære behandlingstilbud for lokalisert prostatakreft (CAP). Hensikten med studien var å undersøke
in vitro
effekten av LBH589 alene og i kombinasjon med RT på vekst og overlevelse av Cap cellelinjer og mulige mekanismer for bestrålingssensibilisering av kombinasjonsbehandling. Effekten av LBH589 alene eller i kombinasjon med RT på to netting cellelinjer (PC-3 og LNCaP) og en normal prostatisk epitelcellelinje (RWPE-1) ble studert ved MTT og klonogene analyser, cellesyklusanalyse, western blotting av apoptose -relaterte og celle check point proteiner og DNA dobbel tråd pause (DSB) reparasjon markører. Den immunfluorescens farging ble brukt til å ytterligere bekrefte DSB uttrykk i behandlede Cap celler. Våre resultater tyder på at LBH589 inhiberte proliferasjon i både hetten og normale prostata epitel-celler i en tids- og doseavhengig måte; low-dose LBH589 (IC
20) kombinert med RT kraftig forbedret effektiviteten av celledreping i Cap celler; sammenlignet med RT alene, kombinasjonsbehandling med LBH589 og RT indusert mer apoptose og ført til en jevn økning av sub-G1 befolkningen og bortfall av RT-indusert G2 /M arrest, økt og vedvarende DSB, mindre aktivering av ikke-homolog ende begynte (NHEJ) /homolog rekombinasjon (HR) reparasjon stier og et panel av cellesyklusrelaterte proteiner. Disse resultater antyder at LBH589 er en potensiell middel for å øke radiosensitiviteten av humane celler Cap. LBH589 brukes enten alene eller i kombinasjon med RT er en attraktiv strategi for behandling av menneskelig Cap
Citation. Xiao W, Graham PH, Hao J, Chang L, Ni J, Strøm CA, et al. (2013) kombinasjonsbehandling med histondeacetylase Inhibitor LBH589 og strålevern er en effektiv diett for prostata kreft celler. PLoS ONE åtte (8): e74253. doi: 10,1371 /journal.pone.0074253
Redaktør: Hari Koul, University of Colorado, USA
mottatt: 8 oktober 2012; Godkjent: 02.08.2013; Publisert: 26 august 2013
Copyright: © 2013 Xiao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av en Karriereutvikling Fellowship fra National Health Medical Research Council (YL), Australia; St George Hospital Cancer Research Trust Fund (PHG), Sydney, Australia; og China Scholarship Council (WWX), Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Dagens behandlingstilbud for lokaliserte Cap er strålebehandling (RT), kirurgi og endokrin behandling. Selv om aggressiv stråling blir bedre biokjemisk kontroll, større endetarm og urin toksisitet forekom også [1]. Lokal svikt etter RT fortsatt 20% -35% i mellomliggende-og høy-risiko Cap pasienter [2], som fører til økt metastaser og lavere overlevelse. Derfor, for å undersøke en ny kombinasjon tilnærming med en selektiv radio-sensitive med RT forbedre Cap Radiosensitivity er stort behov for.
histondeacetylase hemmere (HDACi) er en voksende gruppe av agenter som retter seg mot histondeacetylase (HDAC) og lovende radiosensibiliserende for tiden under etterforskning. Bestrålingssensibilisering av HDACi, slik som valproinsyre [3] har blitt vist i prekliniske studier. HDACi er en potent induser eller regulator av cellulære atferd som apoptose, cellesyklus og DNA reparasjonsprosesser. Det er antatt å utøve sin effekt hovedsakelig ved å endre histon og kromatin strukturer, og dermed modulere gentranskripsjon [4]. Videre kan disse acetylaser og deacetylases også modulere cellefunksjoner uavhengig av genekspresjon ved å virke på ikke-histonproteinene så som p21 [5], p53 [6], Ku70 [6]. Gjennom virker på en serie av histon og ikke-histonproteinene, er HDACi stand til å mediere apoptose, cellesyklus, og DNA-reparasjonsprosesser på en godt organisert måte.
LBH589 er en hydroksamsyre-derivat og en ny pan- HDACi [7]. Qian et al. rapporterte at LBH589 alene redusert angiogenese og tumorvekst i et PC-3-xenograft dyremodell [8]. En fase I-studie er utført ved å behandle kastreringsresistent prostatakreft (CRPC) pasienter ved hjelp av oral LBH589 med eller uten docetaxel, viser lovende resultater for fremtidig klinisk anvendelse [9]. Disse resultatene støtter hypotesen om at LBH589 kan være nyttig i kombinasjon med RT for behandling av lokaliserte cap.
I denne studien har vi en hypotese om at LBH589 kunne drepe Cap celler og behandling av CAP celler med LBH589 før RT ville øke følsomheten Cap celler til RT.
Materialer og metoder
Kjemi og antistoffer
LBH589 (panobinostat) ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Selleck Kjemikalier South Loop West, Houston, TX, USA). Andre kjemikalier som brukes ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hills, NSW, Australia), med mindre annet er angitt. Primære og sekundære antistoffer som brukes i denne studien er oppført i Tabell 1.
Antistoff
Kilde
Skriv
fortynning
Inkubasjonstid
Temperatur
Application
Kanin anti-human caspase-3 (Pro) EpitomicsMAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human caspase-3 (Active) EpitomicsMAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human Histone H3 (acetyl K9) AbcamPAb1: 500o /n4
° CWBRabbit anti-human Histone H4 (acetyl K8) AbcamPAb1: 500o /n4
° CWBRabbit anti-human p21AbcamPAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human p-p53AbcamPAb1: 1000o /n4
° CWBMouse anti-human p53AbcamMAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human fosfor-CDK1 (Tyr15) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human Cdk1 (cdc2) AbcamPAb1: 10000o /n4
° CWBRabbit anti-human p-chk-1AbcamPAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human chk-1AbcamPAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human p-chk-2AbcamPAb1: 500o /n4
° CWBRabbit anti-human chk-2AbcamPAb1: 500o /n4
° CWBRabbit anti-human fosfor-Rb (Ser795) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human fosfor-Rb (Ser807 /811) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000o /n4
° CWBMouse anti-human RbAbcamMAb1: 1000o /n4
° CWBMouse anti-human γH2AXAbcamMAb 1: 500 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4
° CIF WBRabbit anti- menneskelig Ku70EpitomicsPAb1: 1000o /n4
° CWBRabbit anti-human Ku80EpitomicsPAb1: 1000o /n4
° CWBMouse anti-human BRCA1AbcamMAb1: 200 (IF) 1: 200 (WB) o /n4
° CWB, IFRabbit anti human BRCA2AbcamPAb1: 200 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4
° CWB, IFMouse anti-human RAD51AbcamPAb1: 100 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4
° CWB, IFMouse anti -humant GAPDHMilliporeMAb1: 500o /n4
° CWBMouse anti-humant lgG1-negative controlDakoIgG11: 1000o /n4
° CIFGoat anti-kanin-IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 minroom temperatureWBGoat anti-mus-IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500045 . minroom temperatureWBGoat anti-mus Alexa Fluor® 488 Dye ConjugateInvitrogenIgG1: 100045 minroom temperatureIFTable 1. Antistoffer brukes for western blotting og immunfluorescens farging
Merknader: MAb: monoklonalt antistoff; o /n: overnatter; PAb: polyklonale antistoff; WB: western blotting; IF: immunfluorescens; HRP: pepperrot peroxidas CSV ned CSV
Cell kultur
De androgen-ikke-responsiv PC-3 og androgen-responsive LNCaP Cap cellelinjer, og den normale menneskelige prostata RWPE-en cellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). PC-3 og LNCaP-celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% (vol /vol) oppvarmet-inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin, mens RWPE-1 celler ble dyrket i K-SFM-medium supplert med 0,2 ng /mL rekombinant epidermal vekstfaktor (rEGF) og 25 ug /ml bovint hypofyseekstrakt uten FBS. Alle cellelinjer ble holdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2.
MTT-analysen
Celleproliferasjon ble evaluert i hetten og normal prostata cellelinjer etter behandling LBH589 ved hjelp av MTT-analysen å følge en publisert fremgangsmåte [10]. I korthet ble 2000-celler sådd i 96-brønners platene ble inkubert i kulturmedium i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med en rekke konsentrasjoner av LBH589 (0 ~ 20 umol /L) eller det samme volum av DMSO kontroll i friskt medium i ytterligere 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Absorbans (OD) ble avlest ved 560 nm på en BIO-TEC mikroplateleser (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Resultatene er representert som OD forholdet mellom de behandlede og kontrollcellene. IC
20 (20% hemmende konsentrasjon) av LBH589 etter 24 timer ble beregnet og valgt for følgende eksperimenter.
Colony forming analyse
PC-3, LNCaP og RWPE-1 celler ble anvendt for kolonidannende analyser som beskrevet tidligere med mindre modifikasjoner [10]. I korthet, 1,5 ~ 2 x 10
6 PC-3, ble LnCap og RWPE-1-celler ble behandlet i 6 cm skål med LBH589 ved de respektive IC
20 konsentrasjoner eller samme volum av DMSO (kontroll) i 24 timer og deretter 200 ~ 2 × 10
5 celler ble sådd i 6 cm retter. Etter 8 timer utvinning ble LBH589-behandlede og DMSO-behandlede kontrollceller utsatt for en enkelt dose bestråling (0-8 Gy) ved romtemperatur ved bruk av en lineær akselerator (Elekta, Stockholm, Sverige) i en dose hastighet på 2,7 Gy /min med 6 MV fotoner (Cancer Care Centre, St George Hospital, Sydney, Australia). Etter RT ble alle cellene umiddelbart vaskes med stoff-fri medium. Etter 14 dagers inkubering, ble cellene farget med krystallfiolett. Koloniene, definert som grupper av 50 celler, ble bedømt manuelt ved hjelp av et Olympus INT-2 invertert mikroskop (Tokyo, Japan). Data fra RT alene eller kombinasjon behandlet (LBH589 og RT) celler ble normalisert mot de ubestrålte celler (scoret som 100% colony forming evne).
flowcytometrisk analyse for cellesyklus distribusjon
0,5 ~ 2 x 10
6 PC-3 og LNCaP Cap-celler ble sådd ut i 10 cm plate i 24 timer, deretter behandlet med LBH589 ved de respektive IC
20 konsentrasjoner eller DMSO (kontroll) i ytterligere 24 timer før den underkastes til 2 Gy RT. På bestemte tidspunkter (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 og 72 timer etter 2 Gy), trypsinert adherente og flytende celler ble slått sammen og fiksert i kald 70% (v /v) etanol ved 4 ° C. Histogrammer av DNA-innhold ble analysert ved hjelp FlowJo programvare (V.7.6.1, Tre Star, Inc., Oregon, USA) for å bestemme cellesyklus distribusjon (ubåter G1, G1, S og G2 /M).
Immunofluorescent farging for γH2AX og HR reparasjon pathway proteiner
PC-3 og LNCaP Cap celler ble behandlet med samme protokoll som beskrevet i cellesyklus analyse (se ovenfor). Etter å ha mottatt to Gy RT, ble LBH589-behandlede og DSMO-behandlede celler utsatt for immunofluorescens farging ved bestemte tidspunkter (pre-RT, 24, og 72 t etter 2 Gy). Cellen forberedelse for immunofluorescens farging ble som tidligere beskrevet med modifikasjoner [11,12]. De fargede celler ble undersøkt ved hjelp av en FV300 /FV500 Olympus laser scanning confocal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) og bildene ble tatt. For hver behandling tilstand, γH2AX, BRCA1, BRCA2 og RAD51 foci ble bestemt i minst 50 celler. Tellingen av γH2AX, BRCA1, BRCA2, og RAD51 atom foci i disse cellene ble utført av to uavhengige observatører (WWX og JLH).
Western blotting
PC-3 og LNCaP Cap cellene behandlet med den samme protokoll som beskrevet i cellesyklusanalyse (se ovenfor). LBH589-behandlede og kontrollceller ble utsatt for 2 Gy RT. Både flytende og adherente celler ble samlet opp ved bestemte tidspunkter (pre-RT, 2, 6, 12, 24, 48 og 72 timer etter 2 Gy) for Western-blotting som beskrevet tidligere [13]. Membraner ble inkubert med forskjellige primære antistoffer og pepperrot peroxidise (HRP) -merkede sekundære antistoffer på bestemte betingelser (Tabell 1). Imagequant LAS4000 system (GE helsevesenet, USA) ble anvendt for bildeopptaket.
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført minst tre ganger (n = 3). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). For bestrålingseksperimenter, ble overlevelsesfraksjonene beregnet som følger: SF = [bety plating effektiviteten av stråling (± LBH589) behandlede cellene delt mener plating effektiviteten av kontroll (± LBH589)]% Survival fraksjoner av kombinasjons-behandlede celler ble korrigert for cytotoksisitet av LBH589. RT overlevelseskurver ble montert i henhold til den lineære-kvadratiske modellen ved hjelp GraphPad Prism 4.0-programvaren (GraphPad, San Diego CA):
Survival = e
– (αD + βD
2)
De følgende parametere ble beregnet: α verdi, β verdi, α /β verdi, ID90, ID
50, og ID10 (RT dose som gir en overlevende fraksjon på 10%, 50% og 90%, respektivt) ; og SF2 (overlevende fraksjon på 2 Gy). Den radiosensitizing Effekten av LBH589 ble representert ved dosen forbedring faktor (DEF), beregnet som ID
50 for RT behandlede celler dividert med ID
50 for kombinasjons-behandlede celler [14]. To-veis ANOVA ble brukt til å studere innvirkningen av RT dose og LBH589 på resultatparametre (f.eks overlevelsesfraksjon, cellesyklusfordeling, γH2AX foci nummer). En to-utvalgs t-test ble brukt til å sammenligne den gjennomsnittlige andelen av ubåter G1, G1, S og G2 /M-fase celler, og gjennomsnittlig γH2AX, BRCA1, BRCA2, foci RAD51 tall mellom spesifikke to behandlingsforhold. Mulige signifikante forskjeller (
p
0,05) ble evaluert ved hjelp av SPSS v 16,0 programvare (SPSS, Chicago, IL, USA)
Resultater
Effekten av LBH589 alene. på celleformering ved hjelp av netting celler og normale prostata epitelceller
tid og doseavhengig inhibering celleproliferasjon effekt ble funnet i begge Cap-celler (PC-3 og LNCaP) og normale prostata epitelceller (RWPE-1) (figur 1A). IC
20 verdi etter 24 timer for PC-3, LNCaP og RWPE-1 ble 10 umol /l, 2,5 umol /l, og 15 umol /L, henholdsvis, noe som tyder på at to netting cellelinjer er mer følsomme for LBH589 enn . normal prostata epitelcellelinje
(A) Celler ble behandlet med en rekke konsentrasjoner av LBH589 for 24, 48 og 72 timer; (B) Celler ble behandlet med RT eller kombinasjon med RT og LBH589 for analyse av kolonidannende effektivitet. Overlevelses fraksjonene ble betydelig redusert i PC-3 og LNCaP Cap celler (
p
0,01), men ikke i normale REWP-1 celler (
p
0,05); (C) Typiske Bildene vises for kolonivekst i RT og kombinasjonsbehandling (LBH589 og RT) i Cap og normal prostata celler. Alle resultatene var fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Poeng, mener; barer, SD.
Effekten av kombinasjonsbehandling på kolonidannelse ved hjelp av hetten og normal prostata celler
bestrålingssensibilisering effekten av LBH589 på PC-3 og LNCaP ble angitt med betydelig redusert overlevelse fraksjoner (
p
= 0,0075 for PC-3,
p
= 0,0074 for LNCaP) og DEF i disse to cellelinjer 1 (1,77 for PC-3 og 1.29 for LNCaP) ( Figur 1B-C). Radiosensitivity var ikke signifikant økt i RWPE-en ved LBH589 forbehandling med DEF på 1,18 (
p
= 0,0823) (figur 1B-C). RT parametere for RT alene og kombinasjonsbehandling i hver cellelinje er oppsummert i tabell 2. SF2, ID90, ID
50 og ID10 var alle signifikant redusert i PC-3 og LNCaP ved LBH589 forbehandling (
p
. 0,05), men ingen av disse vesentlig endret for RWPE-en
Cell linje
undergruppe
α verdi (Gy
-1)
β-verdi (Gy
-2 )
α /β-verdi (Gy)
SF2
ID90
ID
50
ID10
DEF (forholdet mellom ID
50)
PC-3Radiation0.2590.0644.047*0.46*4.31*1.84*0.37*1.77LBH589-radiation0.5420.1194.5550.212.681.040.19LNCaPRadiation0.0280.0750.373*0.70*5.35*2.86*1.01*1.29LBH589-radiation0.0530.1180.4240.564.202.210.75RWPE-1Radiation1.0E-070.0382.6E-060.867.784.271.671.18LBH589-radiation0.0390.0420.9180.786.923.611.18Table 2. strålebiologisk parametere for stråling og LBH589-strålebehandling
Forkortelser:. SF2 = overlevende fraksjon på 2 Gy, ID90 = stråledose produsere en overlevende brøkdel av 90%; ID50 = stråledose produsere en overlevende brøkdel av 50%; ID10 = stråledose produsere en overlevende brøkdel av 90%, DEF = dose forbedring faktor; *
p
. 0,05 vs. tilsvar LBH589-stråling behandlede celler CSV ned CSV
LBH589 alene kan indusere apoptose og histon acetylering i Cap-celler
lav-dose LBH589 behandling (IC
20) i 24 timer indusert spaltning av full lengde caspase-3 og acetylering av histon 3 (H3) og histon 4 (H4) i begge PC-3 og LNCaP celler (Figur S1), kan foreslå LBH589 initiere apoptose vei knyttet til histone acetylering.
Effekt av kombinasjonsbehandling eller RT alene på cellesyklus distribusjon
Andel av subG1 befolkningen økt jevnt og betydelig i kombinasjons-behandlede celler sammenlignet med RT-behandlede celler i begge Cap cellelinjer (figur 2 og figur S2-S5), noe som indikerer mer celledød inkludert apoptose i kombinasjons-behandlede celler. Ved RT behandling alene, cellene gikk midlertidig cellesyklus-forsinkelses /G2 /M rest mellom 2-24 h, og deretter til slutt gjenvunnet etter 24 timer. Følgelig, RT redusert G1 befolkningen mellom 2-24 h, og G1 gjenopptatt etter 24 timer (figur 2). Mens i kombinasjonsbehandling (LBH589 + RT), den LBH589 forbehandling på celler i utgangspunktet utløst en augment av G2 /M arrest sammen med reduksjon av G1 og S porsjoner. Den kombinasjonsbehandling deretter forårsaket den etterfølgende gradvise og avskaffelse av alle G1, S og G2 /M-populasjoner av behandlede celler med et minimum recovery (figur 2).
Prosentandelen av ubåter G1, G1, S og G2 /M populasjoner ble analysert ved hjelp av flow cytometri fra pre-RT til 72 timer post-RT;
p
0,01 (*): signifikant forskjell i prosentandel av cellesyklus fase mellom den angitte tidspunkt og «Pre-RT» tidspunkt i RT-grupper;
p
0,01 (
#): signifikant forskjell i prosentandel av cellesyklus fase mellom RT-gruppen og kombinasjonsgruppen ved «Pre-RT» tidspunkt;
p
0,01 (
barer, SD.
Forskjeller i G2 /M undergruppe mellom kombinasjonsbehandlet og RT-behandlede grupper i hvert Cap cellelinje ble også observert. Celler som kun fikk 2 Gy RT hadde betydelig G2 /M arrest 6 ~ 12 timer etter RT både i PC-3 og LNCaP cellelinjer, og G2 /M arrest vedvarte i LNCaP cellene inntil 48 timer etter RT. For kombinasjons behandlede celler, forårsaket innledende LBH589 behandling en betydelig økning av G2 /M befolkningen prosent før RT i begge Cap cellelinjer, og avskaffet videre G2 /M arrest etter påfølgende 2 Gy RT (figur 2 og figur S2-S5).
kombinasjons~~POS=TRUNC behandling~~POS=HEADCOMP kan hemme RT-indusert cellesyklus sjekkpunkter aktivering i Cap celler
mønstrene uttrykks for disse sjekkpunkt proteiner skilte seg i to Cap cellelinjer etter RT alene eller kombinasjonsbehandling med LBH589 og RT er vist i figur 3. Som p53 er negativ i PC-3-celler, ekspresjon av både p21 og p53 økte etter 2 Gy RT eller kombinasjonsbehandling i LNCaP-celler, men de er mer vedvarende i RT-behandling alene sammenlignet med kombinasjonsbehandling. Mønstrene av p21 uttrykk i enkle eller kombinerte behandlinger i PC-3 celler er svært lik de i LNCaP celler. p21 enten i PC-3 eller LNCaP-celler og p53 i LNCaP-celler var ikke detekterbare 24 timer etter kombinasjonsbehandling fordi LBH589 forbehandling førte til gradvis reduksjon av p21 og p53-ekspresjon (figur 3). Uttrykk for p-CDK1 ble observert i RT-behandlede celler før RT og var vedvarende før 72 timer etter 2 Gy RT i både PC-3 og LNCaP celler; i motsetning til dens ekspresjon ble nedregulert og ble til og med ikke påvises i kombinasjons-behandlede grupper (figur 3). Uttrykket av total-Cdk1 (t-Cdk1) ikke endrer seg med tiden, og holdt seg på samme nivå etter en enkelt RT og kombinasjonsbehandling (figur 3).
Cellesyklus relaterte proteiner (p21, p-p53, p53, p-Cdk1, t-Cdk1, p-Chk1, t-Chk1, p-Chk2, t-Chk2, p-Rb795, p-Rb807 /811, t-Rb) og DNA-skader og reparasjonsrelaterte proteiner (γH2AX, Ku70, Ku80, BRCA1, BRCA2, og RAD51) ble bestemt ved western blotting. t: Endringer i totale proteinnivåer ved DNA skade; p: aktivering av DNA eller cellesyklus sjekkpunkt proteiner (fosforylert form). Typiske Bildene vises fra tre uavhengige forsøk (N = 3).
uttrykk nivåer av total-chk-en (t-chk-1) og total-chk-2 (t-Chk- 2) (to viktig sjekkpunkt kinaser i cellesykluskontroll) på DNA-skade ble økt med innlegget RT tid i RT alene-gruppen. Tilsetningen av LBH589 endret ikke den strålings-induserte økning i t-Chk-1 og t-CHK-2, men oppheves økningen ved alle tidspunkter (figur 3). Kombinasjons behandling av LBH589 og RT førte til markert redusert nivå av aktiverte CHK-1 og Chk-2 (p-Chk-1 og p-Chk-2) etter 6 timer etter RT behandling, sammenlignet med RT behandling alene (Figur 3) . Ekspresjonen av proteiner sjekkpunkt er forventet å beskytte cellene mot bestråling. Våre resultater tyder på at LBH589 kan påvirke både ekspresjon og aktivitet av CHK-1 og Chk-2 og dermed forstyrrer cellesyklusstyring når den kombineres med RT behandling. p-Rb795 og p-Rb807 /811 proteiner er viktige sjekkpunkter som er ansvarlige for G2 /M arrest av kreftceller til RT. Aktivering av disse to proteiner ble påvist i RT-behandlede celler, mens ingen eller meget svak ekspresjon av disse to proteiner ble påvist i kombinasjon-behandlede celler, mens det ikke var noen tydelig endring detekteres for ekspresjon av total-Rb (t-Rb) (figur 3), som betyr at LBH589 forbehandling hemmet RT-indusert aktivering av p-Rb795 og p-Rb807 /811. Samlet indikerer disse resultater at ekspresjon og aktivering av disse cellesyklusrelaterte proteiner checkpoint endres i kombinasjonsbehandlede gruppene i forhold til RT alene-behandlede grupper.
Kombinasjonsbehandling kan indusere vedvarende DNA dobbel tråd pause (DSB ) i Cap celler
DNA DSB ble undersøkt ved hjelp av γH2AX som en markør av western blotting og fluorescens farging. I 2 Gy RT-behandlede Cap-celler, startet ekspresjonen av γH2AX å øke fra 10-15 min etter RT, med en topp etter 48 timer og 2 timer, for PC3 og LNCaP henholdsvis, slik som vist ved western blotting (figur 3). De γH2AX Resultatene fra Western-blotting ble ytterligere bekreftet ved immunofluorescens-farging (figur 4). I motsetning til cellene behandlet med kombinasjonsterapi, γH2AX var moderat uttrykt ved den forhånds RT tidspunkt og ble oppregulert på tidsmåleren i både PC-3 og LNCaP-celler inntil 72 timer (figur 3). Antall γH2AX foci i kjerner ble kvantifisert som vist i figur 4. Positiv γH2AX foki var fremdeles påvises 72 timer etter 2 Gy RT i PC-3 og LNCaP-celler ved kombinasjonsbehandling. Disse resultatene indikerer at DNA DSB vedvarer etter kombinasjonsbehandling i forhold til RT alene.
(A) Etter 2 Gy RT, økt gjennomsnittlig γH2AX foci antall signifikant ved 24 timer i begge PC-3 og LNCaP-celler og redusert til en lavere nivå ved 72 timer, mens gjennomsnittlig γH2AX foci nummer i kombinasjonsbehandlede (LBH589 + 2 Gy RT) celler var signifikant høyere enn den i RT-behandlede celler til enhver tid peker og fortsatte å stige til 72 timer. (B) Representative bilder av γH2AX flekker etter 2 Gy RT eller kombinasjonsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP celler.
p
0,05 (†) angir signifikant forskjell mellom RT-behandlede celler og kombinasjons-behandlede celler samtidig punkt.
p
0,05 (*) viser signifikant forskjell mellom cellene på bestemte tidspunkter og celler som får samme behandling på «Pre-RT» tidspunkt. Poeng, mener; barer, SD. N = 50. Typiske bilder vises fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Forstørrelse × 60 i alle bilder.
Kombinasjonsbehandling kan redusere aktivering av ikke-homolog ende bli (NHEJ) reparere veien i Cap celler
Siden vedvarende DNA DSB ble sett i combination- behandlede celler, to NHEJ pathway proteiner (Ku70 og Ku80) som er ansvarlig for reparasjon av RT-indusert DSB ble videre undersøkt av western blotting i RT og kombinasjons-behandlede celler. Ekspresjonsmønstre av Ku70 og Ku80 var forskjellige for PC-3 og LNCaP-celler (figur 3). I PC-3 celler, ble positivt uttrykk for Ku70 og Ku80 funnet seks timer etter RT og økes gradvis inntil 72 timer etter RT mens uttrykk for Ku70 og Ku80 var umulig å oppdage etter 48 timer i kombinasjonsbehandling (figur 3). I LNCaP celler, ble positivt uttrykk for Ku70 og Ku80 finnes på alle tidspunkter for RT alene og kombinasjonsbehandling med LBH589 og RT, men uttrykk nivåer av Ku70 og Ku80 var mye høyere etter RT alene sammenlignet med kombinasjonsbehandling ved alle tidspunkter (Figur 3). Disse resultatene indikerer NHEJ veien var involvert i RT i Cap celler og at forbehandling med LBH589 kan redusere sin aktivering sammenlignet med RT alene.
Kombinasjonsbehandling kan redusere aktivering av homolog rekombinasjon (HR) reparere veien i Cap celler
BRCA-1, BRCA-2 og Rad-51 er DSB reparasjon proteiner i HR veien. Ekspresjonen av disse proteinene ble indusert i økende grad fra 2 timer til 72 timer etter en enkelt RT ved western blotting (figur 3). Sammenlignet med RT alene gruppe, ekspresjon av BRCA-1 og BRCA-2-proteiner i kombinasjon behandlingsgruppene fulgte den samme tendens, men ble opphevet etter 6 timer etter RT i begge cellelinjer. Spesielt, ble ekspresjon av RAD51 proteinet opprettholdes i et lavere nivå inntil 72 timer i PC-3-celler, og ble betydelig redusert til 24 timer i LNCaP-celler i kombinasjonsgruppene (figur 3). De BRCA-1, BRCA-2 og Rad-51 resultater fra western blotting ble ytterligere bekreftet ved immunfluorescens farging (figur 5-7). Antall foci fra tre protein reparasjonsmarkører i kjerner ble kvantifisert som vist i figurene 5-7. Resultatene fra western blot var i overensstemmelse med immunofluorescent fargingsresultater. Våre funn tyder på at i tillegg til å påvirke NHEJ reparasjon vei, kan LBH589 også bevisst RT via forstyrrer HR pathway dermed svekke DSB reparasjon evne av hetten cellene.
(A) Etter 2 Gy RT, økte gjennomsnittlig BRCA1 foci nummer i betydelig grad ved 24 timer i begge PC-3 og LNCaP-celler og opprettholdt økning i 72 timer, mens gjennomsnittlig BRCA1 foci nummer i kombinasjonsbehandlede (LBH589 + 2 Gy RT) celler ble også øket ved 24 og 72 timer, men var betydelig lavere enn at i RT-behandlede celler. (B) Representative bilder av BRCA1 flekker etter 2 Gy RT eller kombinasjonsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP celler.
p
0,05 (†) angir signifikant forskjell mellom RT-behandlede celler og kombinasjons-behandlede celler samtidig punkt.
p
0,05 (*) viser signifikant forskjell mellom cellene på bestemte tidspunkter og celler som får samme behandling på «Pre-RT» tidspunkt. Poeng, mener; barer, SD. N = 50. Typiske bilder vises fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Forstørrelse × 60 i alle bilder.
(A) Etter 2 Gy RT, økte gjennomsnittlig BRCA2 foci antall betydelig på 24 timer i både PC-3 og LNCaP celler og vedlikeholdes økt på 72 timer, mens gjennomsnittlig BRCA1 foci nummer i kombinasjonsbehandlede (LBH589 + 2 Gy RT) celler ble også øket ved 24 og 72 timer, men var betydelig lavere enn den i RT-behandlede celler. (B) Representative bilder av BRCA2 flekker etter 2 Gy RT eller kombinasjonsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP celler.
p
0,05 (†) angir signifikant forskjell mellom RT-behandlede celler og kombinasjons-behandlede celler samtidig punkt.
p
0,05 (*) viser signifikant forskjell mellom cellene på bestemte tidspunkter og celler som får samme behandling på «Pre-RT» tidspunkt. Poeng, mener; barer, SD. N = 50. Typiske bilder vises fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Forstørrelse × 60 i alle bilder.
(A) Etter 2 Gy RT, økte gjennomsnittlig RAD51 foci antall signifikant ved 24 og 72 timer i både PC-3 og LNCaP celler, mens gjennomsnittlig BRCA1 foci nummer i kombinasjonsbehandlede (LBH589 + 2 Gy RT) celler ble også øket ved 24 og 72 timer, men var betydelig lavere enn den i RT-behandlede celler. (B) Representative bilder av RAD51 flekker etter 2 Gy RT eller kombinasjonsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP celler.
p
0,05 (†) angir signifikant forskjell mellom RT-behandlede celler og kombinasjons-behandlede celler samtidig punkt.
p
0,05 (*) viser signifikant forskjell mellom cellene på bestemte tidspunkter og celler som får samme behandling på «Pre-RT» tidspunkt. Poeng, mener; barer, SD. N = 50. Typiske bilder vises fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3). Forstørrelse × 60 i alle bilder.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at LBH589 hemmet veksten av PC-3, LNCaP cap celler og RWPE-1 normale prostata epitelceller i en dose- og tidsavhengig måte, som er lik den tidligere rapporterte toksisitet av andre hydroxamates [15]. Den normale prostatisk epitelcellelinje RWPE-1 var den mest motstandsdyktige mot LBH589 mens LNCaP var det mest følsomme av de tre cellelinjer, noe som tyder på netting cellene er forholdsvis følsomme for LBH589.
Det har blitt erkjent at α /β verdi er vesentlig lavere i Cap enn de fleste andre kreftformer. De α /p-verdiene av PC-3 og LNCaP-celler i denne studien er i samsvar med tidligere rapporter, som er mellom 0,5 og 4 Gy [16]. Når celler som fikk kombinasjonsbehandling (LBH589 og RT), ble de α /p-verdiene av PC-3 og LNCaP-celler øket til 4,555 og 0,424 Gy, respektivt. DEF var 1,77 for PC-3 og LNCaP 1,29 for. Den α /β verdi av RWPE-1-normal prostata cellelinje var 0,243 og 0,257 Gy etter RT alene eller kombinert behandling, noe som er tilsvarende lavere enn de to netting cellelinjer. DEF var 1,18 som er mindre enn det i PC-3 og LNCaP-cellelinjer. Disse resultatene tilsier videre
in vivo
studier og kliniske studier.
I denne studien, våre resultater viste at selv lave doser av LBH589 (IC
20) i 24 timer behandling kan utløse apoptose i Cap-celler (figur S1) og prosentandelen av de subG1 populasjonsceller i kombinasjonsbehandling av LBH589 og RT gradvis økt mens det var gjennomgående ganske lav i RT-behandlede celler, noe som betyr at kombinasjonsbehandling kan forårsake mer celledød.
analyse cellesyklusen bekreftet videre at flere PC-3 og LNCaP-celler ble blokkert i G2 /M-fasen etter 24 timer LBH589 behandling og prosentandelen av celler i G1 fase sunket betraktelig. Videre behandling med LBH589 i 24 timer redusert S-fase innhold av LNCaP-celler til et lavere nivå. I alle cellesyklusfaser, G2 /M-fase-celler som er mest følsomme for stråling og S-faseceller som er mest motstandsdyktige [17]. Våre resultater tyder på at cellesyklus-stans i G2 /M og reduksjon av S-fasen i prosent kan være ansvarlig for bestrålingssensibilisering effekten av LBH589.
