Abstract
I denne studien ble seks 2-phenylnaphthalenes med hydroksylgrupper ble syntetisert i høye utbytter ved demetylering av de tilsvarende metoksy-2-phenylnaphthalenes, og en 2-fenylnaftalen med en aminogruppe ble oppnådd ved hydrogenering. Alle de 2-fenylnaftalen-derivater ble undersøkt for cytotoksisitet, og struktur-aktivitetsforhold (SAR) mot human brystkreft (MCF-7-celler), ble også bestemt. SAR Resultatene viste at cytotoksisiteten ble markant fremmet av hydroksylgruppen i C-7-stillingen av naftalenringen. Innføringen av hydroksylgrupper i C-6 stillingen av naftalenringen og C-4-stillingen av fenylringen nokså forbedret cytotoksisitet, men innføring av en hydroksylgruppe i C-3-stillingen av fenylringen svakt redusert cytotoksisitet. Totalt sett, 6,7-dihydroksy-2- (4′-hydroksyfenyl) naftalen (PNAP-6h) oppviste den beste cytotoksisitet, med en IC
50 verdi på 4,8 pM mot MCF-7 cellelinje, og viste lav toksisitet mot normale menneskelige mammary epitelceller (MCF-10A). PNAP-6H ført til celle arrest i S-fasen, mest sannsynlig på grunn av økende nivåer av p21 og p27 og reduserer nivåene av cyklin D1, CDK4, cyklin E, og CDK2. I tillegg vil redusert PNAP-6h CDK1 og cyclin B1 uttrykk, mest sannsynlig fører til G
2 /M arrest, og induserte morfologiske endringer, for eksempel kjernekraft krymping, kjernekraft fragmentering, og kjernefysisk hypercondensation, som observert av Hoechst 33342 farging. PNAP-6h indusert apoptose, mest sannsynlig ved markedsføring av Fas-ekspresjon, økt PARP-aktivitet, caspase-7, caspase-8, og caspase-9 uttrykk, Bax /Bcl-2-forhold, og fosforylering av p38, og redusert fosforylering av ERK. Denne studien gir den første demonstrasjonen av cytotoksisitet av PNAPs mot MCF-7 celler og belyser den underliggende mekanismen PNAP-indusert cytotoksisitet
Citation. Chang CF, Ke CY, Wu YC, Chuang TH (2015) struktur- aktivitet Forholdet mellom syntetisk 2-Phenylnaphthalenes med hydroksylgrupper som hemmer spredning og indusere apoptose av MCF-7 kreftceller. PLoS ONE 10 (10): e0141184. doi: 10,1371 /journal.pone.0141184
Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institutt for biokjemi og bioteknologi, TAIWAN
mottatt: 13 juli 2015; Godkjent: 06.10.2015; Publisert: 22 oktober 2015
Copyright: © 2015 Chang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: forfatterne ønsker å takke departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan (MEST 103-2320-B-039-027-, MEST 103-2113-. M-039-003- og MOST 103-2738-M-039-001-), Kina Medical University (CMU103-N-05), og delvis tilskuddet fra kinesisk medisin Research Center, Kina Medical University (Ministry for utdanning, Aim for Top Universitetet Plan) for økonomisk støtte. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
brystkreft er den vanligste årsaken til kreftdød hos kvinner; derfor jakten på en ny og effektiv antikreftmiddel er avgjørende. Naftalenderivater viser potent anti-arytmi, anti-tumor, og antioksidantaktivitet [1]. Farmakologisk, 2-phenylnaphthalenes (PNAPs) har tilsvarende romlige og konforme krav til genistein (en isoflavone) og utviser et stort antall biologiske og biomedisinske effekter [2]. Kjemisk, 1-substituert naftalen, ikke 2-substituert naftalen, oppnås ved elektrofil aromatisk substitusjon av naftalen. Så langt vi kjenner til, studier av forholdet mellom struktur og cytotoksisitet av multi-substituerte PNAPs er sjeldne. I denne studien vi syntetisert usubstituert PNAP-en, syv metoksy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8), seks tilsvarende hydroksy-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7H), og en amino-PNAP (PNAP-8 timer) og undersøkt deres anticancer struktur-aktivitetsforhold og virkningsmekanismer i MCF-7-cellelinjen.
Flere studier har demonstrert at genistein og forbindelser med den fenyl-1-benzopyran-4-on ryggrad hemme veksten av kreftceller via cellesyklus arrest og induksjon av apoptose [3-5]. Cyclin-cyklinavhengig kinase (CDK) -komplekser er hoved regulatorer av cellesyklusen, noe som er en svært kompleks og tett regulert prosess [6,7]. G
1 /S-faseovergangs reguleres ved aktivering av cyklin D1-CDK4 /6 komplekset og cyclin E-CDK2 kompleks [8,9], mens G
2 /M-fase overgang er regulert av aktivering av cyklin B1-CDK1 kompleks [10,11]. Dereguleringen av cellesyklusen fører til en mangel på differensiering og avvikende vekst.
Apoptose er en utviklingsprosess som fører til programmert celledød [12]. Prosessen med apoptose inkluderer morfologiske endringer (f.eks celle svinn, membran blebbing, kromatin kondens, og kjernefysisk fragmentering) og biokjemiske endringer (f.eks DNA sammenbrudd, protein cleavage, og protein cross-linking) [13,14]. Mange legemidler mot kreft indusere celledød ved å aktivere caspases, som utgjør en del av en felles apoptotiske sti [15,16]. Ytre og indre trasé som regulerer caspase-avhengig apoptose er identifisert [17]. I den ekstrinsiske reaksjonsveien, Fas, en død reseptor, fører til dannelse av en dødsinduserende FADD-caspase-8 aliserte kompleks [18]. Den indre vei styres av Bcl-2-familien av proteiner. Først blir de Bax /Bcl-2 forholdet øker, og denne økning, etterfulgt av frigjøring av cytokrom c, som fører til aktivering av kaspase-9 og caspase-3 [19]. MAPK-reaksjonsveien er vel kjent for sin regulering av celleoverlevelse og apoptose. MAPK-familien er sammensatt av tre hoved kinaser: ERK, p38, JNK og [20]. ERK er fortrinnsvis aktivert av vekstfaktorer, som fører til cellevekst og overlevelse. p38 og JNK blir fortrinnsvis aktivert av cytokin stimulering og oksidativt stress, noe som resulterer i celle differensiering og apoptose [21,22]. Det er uklart om den indre /ytre vei eller MAPK veien er aktivert i PNAP-mediert apoptose. I denne studien, vurderte vi det cytotoksisitet av en rekke PNAPs mot MCF-7 celler og belyst mekanismen bak PNAP-indusert cytotoksisitet.
Materialer og metoder
Kjemi
de metoder som benyttes for å syntetisere de femten PNAP derivatene er vist i figur 1. 2-fenylnaftalen (PNAP-1) og syv metoksy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-8) ble syntetisert fra kommersielt tilgjengelig fenylacetonitriler og benzaldehyder i henhold til tidligere rapporterte fremgangsmåter [23]. Seks tilsvarende hydroksy-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7H) ble oppnådd ved demetylering av PNAP-2-PNAP-7 i utmerkede utbytter (91% til 100%). En amino-PNAP (PNAP-8H) ble oppnådd ved hydrogenering av PNAP-8 i et utbytte på 86%. Den
1 H og
13C NMR spektra av PNAP-2H-PNAP-8t er tilgjengelig i saksdokumenter (Tall A-G i S1 File). Alle de PNAPs ble oppløst i DMSO til en konsentrasjon på 50 mM for å fremstille lagerløsninger, som ble lagret ved -20 ° C.
De åtte 2-phenylnaphthalenes (PNAP-1-PNAP-8) ble lett hentet fra fenylacetonitriler og benzaldehydes gjennom seks trinn. Deretter ble de seks hydroksy-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7h) oppnådd ved demetylering av den tilsvarende metoksy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7). Dessverre, forsøk på demetylering av PNAP-8 under samme forhold førte til komplekse blandinger. En annen hydrofil amino-PNAP (PNAP-8t) ble produsert av reduksjon av nitro-PNAP (PNAP-8).
Generell prosedyre for utarbeidelse av hydroxy-PNAPs.
BBr
3 i CH
2 Cl
2 ved en konsentrasjon på 1 M (5 ml, 5 mmol) ble langsomt tilsatt til en løsning av metoksy-PNAPs (PNAP-2-PNAP-7, 0,5 mmol) i CH
2 Cl
2 (20 ml) ved 0 ° C. Blandingen ble tillatt å oppvarmes til romtemperatur og ble omrørt i 1 time. Den resulterende løsning ble helt over i H
2O (50 ml). «H
2O lag ble ekstrahert med EtOAc (3 x 50 ml), og de samlede ekstrakter ble vasket med H
2O (3 x 50 ml), tørket med vannfritt magnesiumsulfat
4, og filtrert. Filtratet ble konsentrert, og residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel og eluert med EtOAc for å oppnå hydroksy-PNAPs (PNAP-2H-PNAP-7H). De fulle spektrale data for disse forbindelser er beskrevet som følger
6-hydroksy-2-fenylnaftalen (PNAP-2h)
Utbytte 91%..; hvitt fast stoff, smp 176-177 ° C (lit. [24], smp 169-170 ° C).
1 H NMR (500 MHz, CDCh
3)
δ
5,12 (1H, br s), 7,12 (1H, dd,
J
= 8,8, 2,4 Hz), 7,17 (1H, s), 7,36 (2H, t,
J
= 7,4 Hz), 7,47 (1H, t,
J
= 7,4 Hz), 7,69 til 7,71 (3H, m ), 7,75 (1H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,80 (1H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,97 (1H, s);
13C NMR (125 MHz, CDCh
3)
δ
109,3, 118,2, 125,7, 126,3, 126,9, 127,1, 127,2 (2 × C), 128,8 (2 × C), 129,2, 130,2, 133,8, 136,4, 141,2, 153,5; IR (KBr) 3339, 3046, 1618, 1495, 1292, 1194 cm
1; ESIMS
m /z plakater (rel int) 219 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
beregnet for C
16H
11o: 219,08044; funnet:.. 219,08036 [M-H]
–
6,7-Dihydroxy-2-fenylnaftalen (PNAP-3H)
Utbytte 98%; hvitt fast stoff, smp 205-207 ° C.
1 H NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
7,12 (1H, s), 7,20 (1H, s), 7,32 (1H, t,
J
= 7,5 Hz), 7,45 (2H, t,
J
= 7,5 Hz), 7,50 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,65 ( 1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,72 (2H, d,
J
= 7,5 Hz), 7,86 (1H, s), 9,57 (2H, br s);
13C NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
109,5, 110,2, 112,2, 123,4, 126,4, 126,8 (2 × C), 127,0, 128,3 , 129,0 (2 × C), 129,3, 134,7, 140,9, 147,3, 147,4; IR (KBr) 3495, 3395, 1628, 1528, 1119 cm
1; ESIMS
m /z plakater (rel int) 235 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
beregnet for C
16H
11o
2: 235,0754; funnet:.. 235.0755 [M-H]
–
2- (4′-hydroksyfenyl) naftalen (PNAP-4h)
Utbytte 100%; hvitt fast stoff, smp 166-167 ° C (lit. [25], smp 167-169 ° C).
1 H NMR (500 MHz, CDCh
3)
δ
4,89 (1H, br s), 6,95 (2H, d,
J
= 8,6 Hz), 7.44- 7,50 (2H, m), 7,61 (2H, d,
J
= 8,6 Hz), 7,70 (1H, dd,
J
= 8,5, 1,7 Hz), 7,84-7,90 (3 H , m), 7,97 (1H, s);
13C NMR (125 MHz, CDCh
3)
δ
115,7 (2 × C), 125,0, 125,4, 125,7, 126,2, 127,6, 128,0, 128,3, 128,7 (2 × C), 132,3, 133,7, 133,9, 138,1, 155,1; IR (KBr) 3564, 3055, 1603, 1512, 1180 cm
1; ESIMS
m /z plakater (rel int) 219 (41, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
beregnet for C
16H
11o: 219,08044; funnet:.. 219,08043 [M-H]
–
6-hydroksy-2- (4′-hydroksyfenyl) naftalen (PNAP-5H)
Utbytte 93%; hvitt fast stoff, smp 127-128 ° C (lit. [26], smp 258-262 ° C).
1 H NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
6,86 (2 H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,01 ( 1H, dd,
J
= 8,8, 2,0 Hz), 7,10 (1H, s), 7,56 (2H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,63 (1H, dd,
J
= 8,6, 1,6 Hz), 7,70 (1H, d,
J
= 8,6 Hz), 7,78 (1H, d,
J
= 8,8 Hz), 7,94 (1 H, s), 9,51 (1H, br s), 9,70 (1H, br s);
13C NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
108,6, 115,9 (2 × C), 119,1, 124,1, 125,2, 126,7, 127,8 (2 × C), 128,3, 129,7, 131,2, 133,5, 134,6, 155,3, 157,0; IR (KBr) 3183, 3030, 1603, 1512, 1265, 1204 cm
1; ESIMS
m /z plakater (rel int) 235 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
beregnet for C
16H
11o
2: 235,0754; funnet:.. 235.0751 [M-H]
–
6,7-Dihydroxy-2- (4′-hydroksyfenyl) naftalen (PNAP-6t)
Utbytte 98%; hvitt fast stoff, smp 280-282 ° C.
1 H NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
6,84 (2 H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,08 ( 1H, s), 7,13 (1H, s), 7,42 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,53 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,58 ( 1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,73 (1H, s), 9,46 (3H, br s);
13C NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
109,5, 109,9, 115,8 (2 × C), 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 127,8 (2 × C), 129,3, 131,6, 134,8, 146,8, 147,3, 156,8; IR (KBr) 3495, 3341, 1597, 1520, 1119 cm
1; ESIMS
m /z plakater (rel int) 251 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
beregnet for C
16H
11o
3: 251,07027; funnet:. 251,07032 [MH]
–
6,7-dihydroksy-2- (3 «, 4»-dihydroksyfenyl) naftalen (PNAP-7h)
Utbytte 100%. ; hvitt faststoff, smeltepunkt 230 ° C (dekomp.).
1 H NMR (500 MHz, DMSO
d
6)
δ
6,80 (1H, d,
J
= 8,2 Hz), 6,98 ( 1H, dd,
J
= 8,2, 2,0 Hz), 7,08 (1H, s), 7,09 (1H, d,
J
= 2,0 Hz), 7,13 (1H, s), 7,37 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,57 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,68 (1H, s), 8,94 (2 H, br s) , 9,46 (2H, br s);
13C NMR (125 MHz, DMSO
d
6)
δ
109,5, 110,0, 114,1, 116,2, 117,7, 122,0, 122,2, 126,2, 127,7, 129,3, 132,3, 135,1, 144,9, 145,7, 146,8, 147,3; IR (KBr) 3372, 3329, 1602, 1234, 1111 cm
1; ESIMS
m /z plakater (rel int) 267 (100, [M-H]
-); HRESIMS
m /z
beregnet for C
16H
11o
4: 267,0652; funnet:.. 267.0647 [MH]
–
2- (4′-Aminophenyl) -6,7-dimetoksynaftalen (PNAP-8t)
PNAP-8 (77 mg, 0,25 mmol) ble underkastet hydrogenering (50 psi) under anvendelse av 10% Pd /C som katalysator i tetrahydrofuran (THF, 10 ml) og EtOH (1 ml) ved romtemperatur i 12 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert. Residuet ble renset ved kolonnekromatografi over silikagel og eluert med EtOAc for å gi PNAP-8 timer. Utbytte 86%; blekt gult fast stoff, smp 190-191 ° C.
1 H NMR (500 MHz, CDCh
3)
δ
3,74 (2H, br s), 4,01 (6H, s), 6,79 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,12 (1H, s), 7,15 (1H, s), 7,52 (2H, d,
J
= 8,1 Hz), 7,56 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,71 (1H, d,
J
= 8,4 Hz), 7,82 (1H, s);
13C NMR (125 MHz, CDCh
3)
δ
55,9 (2 × C), 106,1, 106,5, 115,5 (2 × C), 123,2, 123,6, 126,7, 127,8, 128,1 ( 2 × C), 129,6, 131,8, 137,0, 145,6, 149,2, 149,7; IR (KBr) 3460, 3439, 3018, 2995, 1624, 1504, 1244, 1130 cm
1; ESIMS
m /z
(rei int) 280 (100, [M + H]
+); HRESIMS
m /z
beregnet for C
18H
17NO
2: 251,07027; funnet: 251,07032 [M + H]
+
Cell kultur
MCF-7 celler ble hentet fra laboratoriet til Dr. Yang-Chang Wu (School of Pharmacy, Kina Medical. universitet, Taiwan), og MCF-10A celler ble innhentet fra laboratoriet til Dr. Wei-Chien Huang (Graduate Institute of Cancer Biology, Kina Medical University, Taiwan). MCF-7-celler ble holdt i DMEM /F12 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. MCF-10A-celler ble holdt i DMEM /F12 medium inneholdende 1,05 mM CaCl
2, 100 mg /ml koleratoksin, 5% hesteserum, 10 ug /ml insulin, 500 ng /ml hydrokortison og 1% penicillin-streptomycin. Disse cellene ble dyrket i cellekultur inkubatorer, som ble satt til temperaturer på 37 ° C og supplert med 5% CO
2.
Celleviabilitet assay
MCF-7-celler ble sådd ved en tetthet på 5 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater, inkubert over natten og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, og 50 uM) av femten PNAPs (PNAP-1-PNAP-8 og PNAP-2H-PNAP-8 timer). I tillegg ble MCF-10A-celler sådd ut i en tetthet på 5 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater, inkubert over natten og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, og 100 uM) av tre PNAPs (PNAP-3H, 6H, og -7H). Etter 48 timers behandling, ble 10 ul av MTT-løsning (5 mg /ml i PBS) tilsatt hver brønn, og cellene ble inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C. Mediet ble deretter helt fjernet, og 50 pl DMSO ble tilsatt for å oppløse MTT formazankrystaller. Absorbansen ved en bølgelengde på 550 nm ble deretter målt ved anvendelse av en mikroplateleser MQX200R (BioTek, VT, USA).
cellesyklusanalyse
MCF-7-celler ble sådd ut ved en densitet på 3 x 10
5 celler per brønn av seks-brønners plater, inkubert over natten og deretter behandlet med PNAP-en, 3H, og 6H ved tre forskjellige konsentrasjoner (5, 10, og 25 uM). Etter 48 timers behandling ble cellene trypsinert, vasket en gang med PBS og fiksert i 70% etanol i 1 time ved -20 ° C. De fikserte celler ble vasket med iskald PBS, suspendert i 0,5 ml PBS inneholdende 0,2 mg /ml RNase og 0,1% Triton X-100 i 30 minutter ved romtemperatur og farget med 20 ug /ml propidiumjodid. De fargede celler ble analysert ved hjelp av et FACScan strømningscytometer (Becton Dickinson, CA, USA). Fluorescensen avgitt fra den propidium jodid-DNA-kompleks ble estimert fra et minimum på 10.000 celler per prøve og analysert ved hjelp av Cell quest alias programvare (BD Biosciences, USA).
Western blot-analyse
MCF-7-celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
5 celler per brønn av seks-brønners plater, inkubert over natten og deretter behandlet med PNAP-en, 3H, og 6H ved tre forskjellige konsentrasjoner (5, 10 , og 25 uM) i 48 timer. Cellene ble vasket med PBS og lysert i iskald RIPA-buffer i 30 min. Supernatanten ble oppsamlet og sentrifugert ved 15 000 rpm og 4 ° C i 30 minutter. Proteinkonsentrasjonen ble målt gjennom en Bio-Rad analyse ved anvendelse av en mikroplateleser MQX200R (BioTek, VT, USA). Cellelysatene ble separert ved 10% SDS-PAGE og elektroforetisk overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Etter flere vaskinger ble membranene blokkert med 5% skummet melk i TBST (Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur og inkubert over natten ved 4 ° C med forskjellige primære antistoffer mot cyklin D1, CDK4, cyclin E, CDK2, p21, p27, cyclin B1, CDK1, kløyvde caspase-7, -8, -9, PARP, BCL-2, BCL-XL, Bax, Bud, Fas, p-p38, p38, p-JNK , JNK, p-ERK, eller ERK (1: 1000 fortynning). Membranene ble deretter vasket tre ganger med TBST og probet med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff (1: 2000) i 1 time ved romtemperatur. Etter tre vaskinger i TBST ble det bundne antistoff visualisert ved anvendelse av ECL western blotting Reagent (PerkinElmer, Boston, MA, USA), og kjemiluminescens ble detektert ved å anvende Fuji medisinsk røntgenfilm (Tokyo, Japan).
cellemorfologi studier
cellene ble sådd ut i 12-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn, inkubert over natten og deretter behandlet med PNAP-en, 3H, og 6H ved tre forskjellige konsentrasjoner (5, 10 og 25 uM) i 48 timer. Cellene ble vasket en gang med PBS, og en undergruppe av celler som var farget med Hoechst 33342 (10 ug /ml i 15 min). De morfologiske endringer ble deretter observert ved lysmikroskopi ved 100 x forstørrelse og fluorescens mikroskopi ved 200 x forstørrelse.
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som middel ± SEM fra tre duplikate eksperimenter . Forskjellene mellom gruppene ble sammenlignet ved analyse av varians (ANOVA) og post-hoc-Tukey ærlig signifikant forskjell (HSD) test ved bruk av SPSS 12,0 programvare for Windows (USA). P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Diskusjon
Effekt av PNAPs på MCF-7 cellelinje levedyktighet studie av deres struktur-aktivitetsforhold
Resultater og og
Å undersøke effektene av de 2-phenylnaphthalenes PNAP-1-PNAP-8, deres demetylering derivater PNAP-2H-PNAP-7h, og amino-PNAP (PNAP-8H) på celleoverlevelse, MCF-7 celler ble behandlet med forskjellige doser av hver forbindelse (0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, og 50 uM) i 48 timer. Satsene for levedyktigheten ble bestemt ved MTT-analysen, og resultatene er vist i tabell 1. Først PNAP-1 viste ingen signifikant aktivitet i MCF-7-celler, og PNAP-2-PNAP-8, som inneholder metoksygrupper, forårsaket nedbør i cellen media i konsentrasjoner høyere enn 5 um (tabell 1). Derfor, jo mer hydrofil PNAP derivater PNAP-2H-PNAP-8t ble utformet og syntetisert. Faktisk ble det ikke observert utfelling for PNAP-2H-PNAP-8h, mest sannsynlig på grunn av dannelse av intermolekylære hydrogenbindinger mellom vann og hydroksyl (eller amino) grupper på 2-phenylnaphthalenes. Tre av derivatene (PNAP-3H, 6H, 7H og) utviste doseavhengig toksisitet betydelig mot MCF-7-celler, med IC
50 verdier på 17,9, 4,8, og 31,8 uM, henholdsvis (tabell 1), mens IC
50 verdiene oppnådd mot MCF-10A celler var 71,0, 50,9 og 55,1 mikrometer, henholdsvis. Resultatene tyder på at PNAP-3t og 6H har forbedret og selektiv cytotoksisitet mot MCF-7 celler og viser lav toksisitet mot MCF-10A celler.
De ovenfor beskrevne resultater viste at PNAP-5t, som har hydroksylgrupper ved C-6 stillingen av naftalenringen og ved C-4-stillingen av fenylringen, oppviste bedre cytotoksisitet enn PNAP-1, -2H, og -4H i våre tester. Dette fenomen viser at innføring av hydroksylgrupper i C-6 stillingen av naftalenringen og C-4-stillingen av fenylringen forbedrer cytotoksisitet. Intriguingly de to 2-phenylnaphthalenes PNAP-3H og 6H, som inneholder en hydroksylgruppe i C-7-stillingen av naftalenringen, oppviste bedre cytotoksiske aktivitet mot MCF-7 cellelinje (sammenlign PNAP-3h til -2H og sammenligne PNAP-6t til 5H). Disse resultatene tyder på at cytotoksisiteten er markant fremmet av nærværet av en hydroksylgruppe i C-7-stillingen av naftalenringen. Videre bør det bemerkes at PNAP-6h oppviste den beste aktivitet mot MCF-7 cellelinje (IC
50 = 4,8 uM). Dette resultatet indikerte også at innføring av en hydroksylgruppe i C-4-stillingen av fenylringen ville forbedre aktivitetene mot MCF-7-cellelinjen. I motsetning til nærværet av en hydroksylgruppe i C-3-posisjonen av fenylringen i PNAP-7h kan vesentlig redusere cytotoksisitet (sammenlign PNAP-6H og 7H). I tillegg er sammenligningen av de cytotoksiske aktivitetene til PNAP-6H og PNAP-8h antyder at tilstedeværelsen av en hydroksylgruppe, som tjener som en H-bindingsdonor, på naftalenringen gir bedre aktiviteter enn nærværet av en metoksygruppe, som fungerer som en H-bindingen akseptor. Basert på cellen levedyktighet og SAR resultater, vi videre undersøkt mulige årsaker til nedgangen i celle levedyktighet indusert av PNAP-3t og 6H og belyst den underliggende mekanismen.
Effekt av PNAPs på de morfologiske egenskapene til MCF -7-celler
Først ble effekten av PNAP-en, 3H og 6H på cellulær morfologi observert ved fasekontrastmikroskopi. MCF-7-celler behandlet med enten en bærerkontroll (0,05% DMSO) eller 5 til 25 uM PNAP-1 viste tette cellepopulasjoner under et fasekontrastmikroskop (figur 2A-2D). MCF-7 celler ble vanlig i form og størrelse, med eksentriske kjerner og en forholdsvis liten mengde av cytoplasma. Den celletetthet og struktur av celler behandlet i 48 timer med 5 til 25 uM PNAP-3H og 6H viste tydelige endringer (figur 2E-2J). Cellene ble avrundet og krympet og mistet kontakten med tilstøtende celler. I tillegg er de apoptotiske celler ikke lenger klebet til substratet, noe som får dem til å løsne fra kulturplater og flyte i kulturmediet. Således PNAP-3H og 6H førte til en reduksjon i levedyktige MCF-7 celleantall på en konsentrasjonsavhengig måte, som vist i tabell 1.
MCF-7-celler ble behandlet med PNAP-1, -3H, og -6H ved tre konsentrasjoner (5, 10, og 25 uM) i 48 timer, og deretter, (A-J) morfologi ble observert ved lysmikroskopi (100 x). Cellene ble farget med Hoechst 33342, og deretter, (K-T) morfologi ble observert ved fluorescens mikroskopi (x 200). (A /K) kontroll; (B /L) 5 uM PNAP-1; (C /M) 10 uM PNAP-1; (D /N) 25 uM PNAP-1; (E /o) 5 uM PNAP-3h; (F /P) 10 uM PNAP-3h; (G /Q) 25 mikrometer PNAP-3t; (H /R) 5 mikrometer PNAP-6h; (I /S) 10 mm PNAP-6h; og (J /T) 25 uM PNAP-6h.
Vi har også observert kjernemorfologi av MCF-7-celler som er utsatt for Hoechst 33342 fluorescent farging etter behandling i 48 timer med tre konsentrasjoner (5, 10 , og 25 uM) av PNAP-en, 3H, og 6H (fig 2L-2T). Kjerner av kjøretøy kontrollcellene vises en intakt oval form og ble vist en svak blå fluorescens (figur 2K). Men cellene behandlet med PNAP-3t (25 mm) og PNAP-6h (5, 10 og 25 mm) viste typiske apoptotiske funksjoner, for eksempel kjernekraft krymping, kjernekraft fragmentering, og kjernekraft hypercondensation (Fig 2Q-2T). Basert på disse mikroskopiske observasjoner, foreslår vi at den observerte cytotoksisitet kan være delvis mediert gjennom PNAP-3H-og-6H-indusert apoptose.
Effekt av PNAPs på MCF-7 cellesyklus fase fordeling
Fordi celleproliferasjon reguleres av cellesyklusen, ble effekten av PNAP-en, 3H og 6H på cellesyklusprogresjon i MCF-7 cellelinje undersøkt ved strømningscytometri og western blot analyser. Resultatene av flowcytometrisk analyse indikerte at behandling med PNAP-6H i 48 timer økte sub-G
en populasjon (figur 3A). Den sub-G
1 topp, som besto av celler med redusert DNA-innhold, representerte tilstedeværelse av apoptotiske celler [27,28]. I tillegg PNAP-6H-indusert cellerest på G
2 /M-fasen oppnådd ved lavere konsentrasjoner (5 og 10 uM) ble ledsaget av en reduksjon i prosentandelen av celler funnet ved Go /G1 fase. PNAP-5H og 6H forårsaket S-fasen rest ved høyere konsentrasjon (25 pM) førte til et lavere antall replikerende celler, og undertrykket celleproliferasjon. Imidlertid PNAP-1-behandlede celler viste ingen signifikant endring i cellesyklusfordelingen sammenlignet med kjøretøyet kontrollcellene.
MCF-7-celler ble behandlet med PNAP-en, 3H, og 6H på tre konsentrasjoner (5, 10 og 25 uM) i 48 timer, og deretter, (A) ble cellene fiksert og farget med propidiumjodid for å analysere DNA-innhold ved strømningscytometri. (B, C) Cell syklus-assosierte proteiner (cyklin D1, CDK4, cyklin E, CDK2, p21, p27, cyklin B1, og CDK1) ble påvist og analysert ved western blot. Uttrykket ble kvantifisert med det elektroniske Gel-Pro Analyzer bildeanalysesystem. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. * P 0,05 og ** P 0,01 er signifikant forskjellig fra kontroll
Basert på disse observasjoner av cellesyklusfordelingen av MCF-7-celler, analyserte vi endringene i overflod av cellen. syklusregulerende proteiner. Cyklin-CDK-komplekser er de primære regulatorer av cellesyklusprogresjon [7], og aktiviteten av cyclin /CDK-komplekser er negativt regulert av CDK-inhibitorer, slik som p21 og p27 [29]. PNAP-3h (ved 25 uM) og PNAP-6h ført til celle arrest i S-fasen, mest sannsynlig på grunn av økte nivåer av p21 og p27 og reduserte nivåer av cyklin D1, CDK4, cyklin E, og CDK2, som bestemt gjennom western blot-analyse (figur 3B og 3C). I tillegg PNAP-6H induserte hemming av CDK1 kinase-aktivitet og en reduksjon i cyklin B1 uttrykk, mest sannsynlig fører til G
2 /M arrest. Derfor foreslår vi at hemming av cellelevedyktigheten av PNAP-3t og 6H kan være delvis mediert gjennom cellesyklus og apoptose.
PNAPs aktivere caspase sti og øke uttrykket av relative apoptotiske proteiner
Basert på resultatene ovenfor, har vi funnet at PNAPs kan forhindre spredning, indusere apoptose, og redusere cellenes levedyktighet i MCF-7-cellelinjen. Det er velkjent at mange kreftmedisiner megle apoptose ved å aktivere caspases [16]. For å demonstrere at den PNAP-indusert apoptose i MCF-7-celler skjer via caspaseaktivering, undersøkte vi uttrykket av viktige regulatoriske proteiner forbundet med caspase baner i MCF-7-celler ved eksponering for 5 til 25 uM PNAP-1, -3H, og 6H. Til tross for mangelen av caspase-3 i MCF-7-celler, caspase-7, en apoptose skarp, kan fungere som en erstatning [30]. Caspase-7 er i stand til å spalte spesifikke tetrapeptid-substrater (f.eks PARP), og PARP spalting er en viktig kjennetegn på apoptose [31]. Eksponering av MCF-7 celler til tre konsentrasjoner (5, 10, og 25 uM) av PNAP-3H og 6H i 48 timer signifikant økte nivåer av spaltede kaspase-7 og PARP og økt aktivitet av spaltede caspase-7 og PARP i en doseavhengig måte (figur 4A). Videre apoptose kan bli stimulert via den ytre og indre baner. Kaspase-8 er generelt ansett som en aktivator apoptose i den ytre vei, og caspase-9 spiller en viktig rolle i den intrinsiske reaksjonsvei [32]. Disse data viser at ekspresjonen av spaltede caspase-8 og caspase-9 i MCF-7-celler økte etter behandling med PNAP-3H og 6H på en doseavhengig måte. Dessuten spaltes caspase-8 og caspase-9 ble delvis inhibert av caspase-8-spesifikk hemmer Z-IETD-FMK og caspase-9-spesifikk hemmer Z-LEHD-FMK. Videre er de to inhibitorene også delvis hemmet caspase-7 spalting i PNAP derivat-indusert apoptose (figur 5A og 5B) og delvis reversert PNAP-6-indusert reduksjon i celleviabilitet, som observert ved mikroskopi og MTT-assay (fig 5C) . Disse resultatene tyder på at caspase-7-, caspase-8-, og caspase-9-medierte baner kan være delvis involvert i reguleringen av PNAP-indusert apoptose.
(A) MCF-7-celler ble behandlet med PNAP-en, 3H, og 6H ved tre konsentrasjoner (5, 10, og 25 uM) i 48 timer, og ekspresjon av spaltet caspase-7, -8, -9 og PARP ble bestemt ved western blotting. (C) MCF-7-celler ble behandlet med 25 uM PNAP-en, 3H, og 6H ved tre konsentrasjoner (5, 10, og 25 uM) i 48 h, og Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bax /BCL-2, bud, og Fas nivåene ble deretter oppdaget av western blot. (B, D) Uttrykket ble kvantifisert ved hjelp av en datastyrt Gel-Pro Analyzer bildeanalyse system. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. * P 0,05 og ** P 0,01 er signifikant forskjellig fra kontroll
MCF-7-celler ble inkubert i nærvær eller fravær av (A) den caspase-8-inhibitor z-IETD-. FMK eller (B) den caspase-9-inhibitor z-LEHD-FMK i 1,5 time før tilsetning av PNAP-6h. Western blot analyser ble utført med antistoffer mot kaspase-7, -8 og -9, og aktin. (C) MCF-7-celler ble behandlet med PNAP-6h i nærvær eller fravær av caspase-8-inhibitor, eller caspase-9-inhibitor, og morfologien ble deretter observert ved lysmikroskopi.
aktivering av caspase-8 er det første trinnet i kaskade av apoptotiske hendelser forårsaket av Fas stimulering [33], og aktivering av caspase-9 er regulert av BCL-2 familiemedlemmer [34-36]. Imidlertid er behandling av MCF-7-celler med 25 pM PNAP derivater som utøves en beskjeden effekt på ekspresjonen av Bcl-xl, Bax, og Bud proteiner ved tre tidspunkter (12, 24, og 48 h) (figur 4C og 4D) .
