Abstract
Studier har vist at MIR-221 og MIR-222 er deregulert i mange kreftformer, blant annet prostatakreft. Likevel, den biologiske rolle og de underliggende mekanismene for MIR-221 og MIR-222 i patogenesen av androgen-uavhengig prostatakreft er fortsatt ikke klart. Den spredning, apoptose, cellesyklus utmerkelse, og migrasjon kapasitet av prostata celler ble bestemt etter transfeksjon av MIR-221 eller MIR-222-hemmer. Den biologiske effekten og regulering av SIRT1 på prostata kreft celler ble undersøkt. MiR-221 og MIR-222 ble sterkt uttrykt i PC-3 celler sammenlignet med i LNCaP celler. Etter MIR-221 eller Mir-222 uttrykk ble hemmet, spredning og migrasjon priser av PC-3 celler redusert og apoptose hastigheten økes. Videre SIRT1 protein ble oppregulert i celler etter at de ble transfektert med MIR-221 eller MIR-222-hemmer. Celler transfektert med siSIRT1 viste økt migrasjon og apoptose en redusert hastighet, men det var ingen signifikant effekt på celleproliferasjon sammenlignet med kontrollene. Det var en negativ sammenheng mellom MIR-221 eller MIR-222 og SIRT1, men ingen direkte mål forholdet ble identifisert. Disse dataene viser at MIR-221 og MIR-222 er sterkt uttrykt i PC-3 celler. Deres inhibering fører til redusert celleproliferasjon og migrasjon og økt apoptose i prostatakreftceller. Disse effektene er potensielt mediert av oppregulering av SIRT1
Citation. Yang X, Yang Y, Gan R, Zhao L, Li W, Zhou H, et al. (2014) nedregulering av mir-221 og mir-222 Beherske Prostate Cancer Cell Proliferation og migrasjon som er delvis mediert av Aktivering av SIRT1. PLoS ONE 9 (6): e98833. doi: 10,1371 /journal.pone.0098833
Redaktør: George Calin, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 25 februar 2014; Godkjent: 07.05.2014; Publisert: 03.06.2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National Kina og Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (81170257 og Y2110513). Denne studien ble også delvis støttet av MD Anderson Cancer Center Oppstart Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en av de vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftdød for menn i den vestlige verden. Omtrent 238 590 nye tilfeller ble diagnostisert i 2013 [1]. De fleste PCas vokser sakte og er avhengig av androgen for vekst; dermed de svare på androgen deprivasjon behandling (ADT). ADT er effektive, men de fleste pasienter «sykdom vil til slutt bli ildfast og fremdrift fra androgen-avhengige PCa til androgen-uavhengig (kastrering-resistent) PCa, som førte store utfordringer til behandling av PCa [2]. Dermed identifisere en ny og effektiv terapeutisk tilnærming har blitt fokus i kampen mot PCa.
microRNAs (mirnas) er små (ca. 21-23 nukleotider), ikke-protein-kodende RNA som fungerer som post- transcriptional regulatorer av målgener. Disse molekylene blir i hovedsak funnet i eukaryoter og er helt eller delvis integrert, på en komplementær måte, med det mål-mRNA 3’UTR, noe som resulterer i nedbrytning eller oversettelse inhibering av mål-mRNA. miRNA funksjoner i den transkripsjonelle og post-transkripsjonell regulering av genekspresjon, som påvirker mange cellulære biologiske prosesser [3]. mirnas er involvert i flere celledifferensiering, spredning og apoptose prosesser som er nært knyttet til tumorigenesis [3]. Nylig, ble enkelte avvikende uttrykt mirnas oppdaget i PCa og andre kreftformer, noe som indikerer at de spiller en avgjørende rolle i den molekylære mekanisme av kreft patogenese og progresjon [2], [4] – [8]. Videre har studier vist at MIR-221 og MIR-222 er deregulert i mange kreftformer, inkludert PCa [9] – [14], og de to mirnas spiller en viktig rolle i tumorigenese og progresjon fra androgen-avhengige PCa til androgen-uavhengig PCa [15] – [17]. Likevel, resultatene er inkonsekvent og selv kontroversiell, og de underliggende mekanismene er fortsatt ikke klart.
I pattedyr, lydløs informasjon regulator 1 (SIRT1) er et medlem av Sirtuin familie og har vist seg å være svært homolog med SIRT2 i gjær [18]. SIRT1 er også kjent som NAD-avhengige histon deacetylase og er involvert i regulering av mange fysiologiske prosesser, slik som celleproliferasjon, inflammatorisk respons, cellesyklus, og cellevandring [19]. Det er imidlertid ikke kjent hvorvidt SIRT1 virker som en promotor-gen eller suppressor-gen på grunn av sin kompleksitet [20] – [23]. Dens rolle i kreft har ikke blitt godt definert. For eksempel, SIRT1 viste anti-onkogen handling og dens uttrykk nivå var assosiert med prognosen i tykktarmskreft [24], [25]. Likevel er det ansett som et onkogen i brystkreft [26]. I PCA er imidlertid rollen SIRT1 fortsatt kontroversiell [27], [28].
I denne studien undersøkte vi deres regulerende rolle MIR-221 og MIR-222 og deres potensielle molekylære mekanismer ved PCA ved trans MIR-221 eller MIR-222 inhibitor i PCA celler.
Materialer og metoder
Cell kultur og plasmid transfeksjon
Menneske PCa PC-3 celler (androgen-uavhengig ) og LNCaP celler (androgen-avhengige) ble kjøpt fra institutt for biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Celler ble opprettholdt i F12 (Gibco, Carlsbad, CA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en 5% CO2-atmosfære.
pcDNA3.1- tom vektor (pEX-5), pcDNA3.1-HSA-Mir-221 hemmer svamper (MIR-221-hemmer), pcDNA3.1-HSA-MIR-222 hemmer svamper (MIR-222-hemmer), pGPU6-tom (pGPU6) og pGPU6-siSIRT1 (siSIRT1) ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). Villtype SIRT1 3’UTR regionen ble bygget i psiCHECK-2 av GenePharma (Shanghai, Kina). PC-3-celler ble dyrket til 80% -90% konfluens og transfektert med plasmider ved hjelp av Lipofectamine 2000 (DNA /Lipofectamine 2000 = 1/2) i henhold til produsentens instruksjoner. Fire timer etter transfeksjon, ble kulturmediet erstattet med friskt F12 inneholdende 10% FBS. En stabil transfeksjon ekspresjon av cellelinjer ble etablert etter at cellene var blitt inkubert i komplett F12 medium med G418 (1000 ug /ml) i 15 dager. Vi bekreftet kloner bruker western blot og real time PCR, og samlet de vellykkede kloner for forsøkene. Verifiserings Resultatene av western blot er vist i figur S1. I tillegg ble alle eksperimentene bekreftet også ved forbigående transfeksjon.
celleproliferasjon og cellesyklusanalyse
For det celleproliferasjonsanalyse, podet vi PC-3-celler med etablert stabil ekspresjon (pEX- 5, MIR-221-hemmer, MIR-222-hemmer, pGPU6, eller siSIRT1) i 96-brønners mikroplater med en tetthet på 2 × 10
3 celler per brønn og inkubert dem for ulike tidsperioder (1 til 7d). Etter at 10 ul av celleteller leder-8 (CCK-8) reagens til hver brønn og inkuberes cellene ved 37 ° C i 1,5 timer. Absorbans ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en elektroluminescens immunosorbent analyse (ELISA) leser.
For cellesyklusanalyse, transfekterte celler ble sådd i 12-brønners plate i 48 timer. Cellene i hver brønn ble samlet, og fiksert med 70% iskald etanol i 24 timer ved -20 ° C. Etter å ha blitt vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) tre ganger, ble de inkubert med RNase i 1 time på is og farges med propidiumjodid i 15 minutter på is. DNA Fordelingen ble målt ved strømningscytometri i 4 timer.
Apoptose assay
stabilt transfekterte celler ble sådd i 12-brønns plater og dyrket i 48 timer. Cellene ble deretter høstet og oppsamlet ved sentrifugering ved 2000 rpm. Etter å ha blitt vasket med PBS tre ganger, ble de farget med Annexin V-forbedret grønt fluorescerende protein (FITC) og propidiumjodid (PI) i 15 min, beskyttet mot lys. Cellen apoptose hastigheten ble bestemt ved flowcytometri i en time.
Sårtilheling analyse og transwell migrasjon analysen
En sårheling analysen ble utført for å etterligne celle migrasjon [26]. I korte trekk, ble transfekterte celler sådd ut i en seks-brønns plate ved en tetthet på 1 x 10
6-celler per brønn. Cellene ble dyrket til 80% konfluens og flere såret linjer ble ripete vertikalt til bunnen med en 200 mL pipette tips. Etter å ha blitt vasket med PBS tre ganger, ble cellene inkubert i vekstmedium inneholdende 1,5% serum. Såret bredde ble bestemt hver 24. time i løpet av en periode på 72 timer ved 100 x under et Nikon Eclipse TS100 mikroskop (Nikon, Japan). Verdier ble uttrykt som prosentandelen av lukking av sår, som ble beregnet som følger: Prosent av sårlukking = 1- (bredde
t
/bredde
0
) x 100 %.
for celletranswellmigreringsanalyse, cellene ble sultet i 24 timer, resuspendert med serum-fritt F12-medium og utsådd (5 x 10
4-celler) i en 24-brønners transwell med en 8- mikrometer pore membran innsats (Corning, USA). F12-medium, supplert med 10% FBS, ble plassert i det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Celler ble inkubert i 72 timer. Celler som gjennomtrengt membranen ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og farget med krystallfiolett i 30 min ved omgivelsestemperatur og fotografert under et mikroskop (Nikon, Japan). Invaderte celler ble eluert nedover med eddiksyre. Absorbans ble målt ved 590 nm i en ELISA-leser.
Revers transkripsjon og real-time PCR
Førtiåtte timer etter transfeksjon, total-RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved anvendelse av TRIzol (Invitrogen , USA) etter produsentens protokoller. For miRNA og SIRT1 revers transkripsjon, ble 500 ng av total RNA revers transkribert til cDNA med miRNA-spesifikke RT primere (RiboBio, Kina) og tilfeldig primer (Takara, Japan), henholdsvis. Genekspresjon ble målt ved hjelp av sanntids-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (PCR) ved anvendelse av en Applied Biosystems 7500 Fast Sequence Detection System og SYBR grønn PCR Kit (Qiagen, Tyskland) under de følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 10 sek og glødning og forlengelse ved 60 ° C i 30 sek. De relative miRNA og mRNA-ekspresjonsnivåene ble normalisert ved U6 og β-aktin, respektivt.
Western blot-analyse
syttito timer etter transfeksjon, ble cellene høstet og lysert i nærvær av en protease inhibitor cocktail og sentrifugert ved 12500 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fraksjon ble samlet og proteinkonsentrasjonen ble målt under anvendelse av en syre bicinchoninic proteinanalysesett (Shenggong Bio Tech Co Ltd, Shanghai, Kina). En alikvot på 80 ug av denaturert protein fra hver prøve ble påført på 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført på nitrocellulosemembraner. Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med primært antistoff (1:2000 fortynning, Abcam, USA) ved 4 ° C over natten og pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:1000 fortynning, Abcam , USA) i 1 time ved omgivelsestemperatur. Blottene ble deretter inkubert med forbedret kjemiluminescens i 2 min. Signalene ble påvist og kvantifisert ved densitometri hjelp Antall ett-maskinen. β-actin ble brukt som en endogen kontroll normal ekspresjonsdata
SIRT1 mål prediksjon og luciferase aktivitetsanalyse
miRNA mål ble spådd å bruke Miranda database (http:. //www.microrna. org /). For luciferase aktivitetsanalyse, nukleotider 2341-2731 (hele spådd MIR-221 og Mir-222 mål området av SIRT1-3’UTR) ble innsatt nedstrøms Renilla luciferase genet i en Renilla /ildflue luciferase reporter plasmid, psiCHECK- 2 (GenePharma, Shanghai, Kina). PC-3 celler ble transfektert med 0,5 mikrogram av reporter plasmider per brønn pluss MIR-221 eller MIR-222 inhibitor plasmid. Førti-åtte timer etter transfeksjon, Renilla /ildflue luciferase aktivitet ble målt ved dual luciferase reporter analysen (Promega, USA) i en automatisk mikroplateleser (Thermo, USA).
Statistisk analyse
All statistiske analyser ble utført ved anvendelse av SPSS programvareversjon 17,0 (Chicago, Illinois, USA). Data ble uttrykt som middelverdi ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt ved en analyse av varians eller to-halet t-test. En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle forsøkene ble utført minst tre ganger.
Resultater
Uttrykk for mir-221 og mir-222 i PCA celler
MIR-221 ble sterkt uttrykt i PC-3 -celler sammenlignet med LnCap (P 0,05) (figur 1A). Tilsvarende MIR-222 ble også markert økt i PC-3 celler sammenlignet med LNCaP (P 0,01) (figur 1B). Transfeksjon med MIR-221 inhibitor dramatisk trykkes uttrykk for MIR-221 i PC-3 celler (P 0,05) (figur 1C). Likeledes MIR-222 uttrykk ble betydelig redusert etter transfeksjon av MIR-222 inhibitor (P 0,01). (Figur 1D)
(A) MIR-221 nivåer i PC-3 og LNCaP celler. (B) MIR-222 nivåer i PC-3 og LNCaP celler. (C) MIR-221 nivåer i PC-3 celler etter transfeksjon med PEX-5 (tom vektor plasmid) eller MIR-221-hemmer. (D) MIR-222 nivåer i PC-3 celler etter transfeksjon med PEX-5 eller MIR-222-hemmer. Data representerer middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter.
* P 0,05,
** P. 0,01
Effekter av mir-221 hemmer og mir-222 inhibitor på celleproliferasjon, cellesyklus distribusjon, og apoptose i PC- 3 celler
Som vist i figur 2, sammenlignet med celler transfektert med tom vektor (pEX-5), celler transfektert med MIR-221-inhibitor eller MIR-222-inhibitor viste signifikant redusert spredning på den femte, sjette, og sjuende dagen (P 0,01 til 0,05).
PC-3 celler ble transfektert med tom vektor plasmid (pEX-5), MIR-221-hemmer, eller MIR-222-hemmer. Celleformering ble analysert ved hjelp av en CCK-8-analyse. Proliferasjonen av celler transfektert med MIR-221-inhibitor eller MIR-222-inhibitor ble redusert sammenlignet med den transfektert med pEX-5. Data representerer middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter.
*, # P 0,05 vs PEX-5,
**, ## P 0,01 vs PEX-5
En flowcytometri analyse viste at 70,2 ± 1,8% av. celler transfektert med pEX-5 var i G0 /G1 faser, mens 87,1 ± 2,0% og 81,9 ± 0,9% av cellene transfektert med MIR-221-inhibitor og MIR-222-inhibitor var i G0 /G1, henholdsvis (P 0,01) ( figurene 3 A og B). Transfeksjon med MIR-221-inhibitor eller MIR-222-inhibitor som resulterte i en mye lavere prosentandelen av celler i S-fasen sammenlignet med de som er transfektert med pEX-5 (4,9 ± 1,9% eller 9,9 ± 1,1% vs. 21,9 ± 1,7%, P 0,01 ). Det var ingen signifikante forskjeller i cellene i G2 /M faser mellom gruppene.
(A) Cell DNA innhold distribusjon i hver fase. (B) Prosent av celler fordelt i hver fase av cellesyklusen. **
## P 0,01 vs PEX-5
apoptose utbredelsen av PC-3 celler transfektert med MIR-221-hemmer eller MIR-222 inhibitor ble økt med 2,8 ganger. og 2,6 ganger, sammenlignet med de som er transfektert med pEX-5 (P 0,05). (figurene 4A og B)
(A) apoptotisk celle fordeling av PC-3-celler transfektert med pEX-5 mir -221 inhibitor eller MIR-222-inhibitor ved strømningscytometri. (B) Relativ apoptose sats på hver gruppe. Data representerer gjennomsnittsverdien ± SEM fra tre separate forsøk (
*, # P. 0,05 vs PEX-5
Effekter av mir-221 hemmer og mir-222 inhibitor på PC-. 3 cellemigrering
som vist i figurene 5A og B, kan lukkehastigheten av MIR-221-inhibitor og MIR-222 hemmer grupper var lavere enn den var av pEX-5 gruppe. for eksempel, lukke ratene var 25 ± 1,5% og 34 ± 2,9% for henholdsvis MIR-221 og MIR-222 inhibitorer, sammenlignet med 57 ± 7% for pEX-5 (P av 0,01 til 0,05) etter 48 timer, og 47 ± 2,7% og 59 ± 9.9 % mot 100% (P 0,01).. 72 h Lignende funn for inhibering av migrering ble observert ved bruk av et transwell assay Som vist i figurene 5C og D, ble cellemigrasjon signifikant redusert etter transfeksjon med MIR-221-inhibitor eller MIR-222 hemmer sammenlignet med i celler transfektert med pEX-5 (P 0,01).
(A) Sårtilheling analysen viser nedleggelse priser celler transfektert med pEX-5 (tom vektor plasmid), MIR-221-hemmer, eller MIR-222-hemmer. (B) Kvantifisering av sår nedleggelse priser på ulike tidspunkter. (C) Transwell-analysen viser at cellene penetrert innsatsen membranen. (D) Kvantifisering av antall celler som gjennomtrenges innsatsen membranen. Data representerer middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter.
*, # P 0,05 vs PEX-5,
**, ## P 0,01 vs PEX-55)
Hemming av mir-221 og mir-222 øker. SIRT1 protein uttrykk
Western blot analyse viste at SIRT1 protein nivåer av celler transfektert med MIR-221 hemmer og MIR-222 inhibitor ble markert økt sammenlignet med de av celler transfektert med pEX-5 (P 0,05 og P 0,05 vs PEX-5,
## P. 0,01 vs PEX-5
Effekter av SIRT1 på spredning, apoptose, og migrasjon i pc-3 celler
SIRT1 ekspresjon ble betydelig undertrykt i celler transfektert med siSIRT1 sammenlignet med de transfektert med pGPU6 som en kontroll (figur 7A). Det var ingen signifikante forskjeller i celleproliferasjon mellom celler transfektert med siSIRT1 og pGPU6 (figur 7B). Imidlertid, celler transfektert med siSIRT1 resulterte i en to-gangers reduksjon i apoptose hastighet sammenlignet med den i celler transfektert med pGPU6 (P 0,01) (Figurene 8A og B). Interessant, migrering av celler transfektert med siSIRT1 ble signifikant økt sammenlignet med den til celler transfektert med pGPU6 (P 0,05). (Figurene 9A og B)
(A) SIRT1 proteinnivåer i PC-3-celler transfektert med pGPU6 (tom vektor plasmid) eller siSIRT1 (pGPU6-si-SIRT1) av Western blot analyse. (B) Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av en CCK-8-analyse. Det var ingen signifikante forskjeller mellom de to gruppene (P 0,05). Data representerer gjennomsnittsverdien ± SEM fra tre separate forsøk.
(A) Apoptose ble målt ved flowcytometri inPC-3 celler transfektert med pGPU6 eller pGPU6-siSIRT1. (B) Relativ apoptose sats på hver gruppe. Data representerer middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter.
** P. 0,01 vs pGPU6
(A) En transwell analysen ble brukt til å måle migrering av celler transfektert med pGPU6 eller pGPU6-siSIRT1. (B) Antall celler trengt innsatsen membranen. Data representerer middelverdi ± SEM fra tre separate eksperimenter.
* P. 0,05 vs pGPU6
SIRT1 er ikke et direkte mål for mir-221 og mir-222
Som Miranda data viser, MIR-221 og MIR -222 bundet til en av de målsekvenser som befinner seg i det 3′-UTR av SIRT1 mRNA (figur 10A). For å finne den direkte interaksjonen mellom MIR-221 eller MIR-222 og SIRT1 mRNA-3’UTR, ble luciferase aktivitetsanalyse utført. Imidlertid luciferase-aktivitet viste ingen statistisk signifikante forskjeller i MIR-221 eller MIR-222 nivå i PC-3-celler ko-transfektert med SIRT1-3’UTR bindende sekvens reporter plasmid sammenlignet med kontrollgruppen (figur 10B). Med andre ord, det gjorde MIR-221 og MIR-222 ikke binde til SIRT1 sekvensen direkte og ikke utøve en direkte biologisk interaksjon.
(A) Den komplementære bindingssteder av MIR-221 og MIR-222 på SIRT1-3’UTR spådd av Miranda database. (B) Luciferase Aktiviteten ble gjennomført for å verifisere bindingen og samhandling av MIR-221 og MIR-222 med SIRT1. Det var ingen forskjeller i luciferase aktivitet mellom gruppene (P 0,05). Data representerer gjennomsnittsverdien ± SEM fra tre separate forsøk.
Diskusjoner
Flere studier har vist at MIR-221 og MIR-222 er oppregulert i ulike kreftformer og er dermed Regnes onkogener [9], [13], [29]. Faktisk har studier funnet at mirnas påvirker en rekke biologiske prosesser gjennom komplementær binding til ett eller flere mål gener. For eksempel, p27, TRPS1, PTEN, ARHI, TIMP3, HECTD2 og RAB1A var målgener av MIR-221 og MIR-222 [10], [11] ,. Disse funnene tyder på at disse mirnas er et terapeutisk mål. Vi har vist at nivåene av MIR-221 og MIR-222 ble signifikant økt i PC-3-celler, sammenlignet med i LNCaP-celler, noe som er i overensstemmelse med andre funn [34]. Nedregulering av MIR-221 eller MIR-222 ekspresjon hemmet celleproliferasjon og migrasjon og økt apoptose i PC-3-celler. Videre effektiv transfeksjon av MIR-221-inhibitor eller MIR-222-inhibitor som resulterte i en høyere prosentandel av celler i G0 /G1 faser og en lavere prosentandel av celler i S-fasen. Disse funnene indikerer at hemming av MIR-221 eller Mir-222 uttrykk utøver viktige biologiske effekter på celleproliferasjon, apoptose, cellemigrasjon, cellesyklus distribusjon, og celle overgang i PC-3 celler. Uttrykket av SIRT1 ble økt i PC-3 celler etter MIR-221 og MIR-222 var nedregulert. Dette funnet tyder på at SIRT1 spiller en undertrykkende rolle mot svulsten fremmende virkning av MIR-221 og MIR-222. SIRT1 har blitt rapportert å hemme LNCaP-celleformering [35]. Wang et al. demonstrert redusert SIRT1 uttrykk ved PCA vev sammenlignet med i benign prostatahyperplasi vev [27]. SIRT1 kan tjene som en svulst promoter eller tumor suppressor, avhengig av onkogene sti spesifikke for bestemte tumorer [19], [22], [24]. SIRT1 kan fungere som et onkogen ved inhibering av tumorsuppressorgener slik som p53 [36], og kan virke som et anti-onkogen ved å undertrykke flere onkogener eller oncoproteiner som β-catenin og Survivin [37], [38].
i vår studie, slå ned SIRT1 i PC-3 celler førte til økt cellemigrasjon og en redusert apoptose rate, men ingen signifikant forskjell ble observert i celleproliferasjon. Disse funnene tyder på at SIRT1 deltar i migrasjon undertrykkelse og apoptose opprykk i PC-3 celler, men har liten rolle i regulering av celle levedyktighet. Hemme MIR-221 og Mir-222 uttrykk forbedret SIRT1 uttrykk, noe som tyder på at den observerte økt apoptose og redusert migrasjon etter transfeksjon med MIR-221 eller MIR-222 inhibitor er regulert av SIRT1 aktivering. Disse cellene «spredning-undertrykkelse kapasitet etter MIR-221 og MIR-222 nedregulering kan moduleres gjennom andre molekylære stier, for eksempel p27 [31] eller ARHI [39]. Selv SIRT1-3’UTR eksisterer i bindingsstedene for MIR-221 og MIR-222, hadde en luciferase reporter analysen ikke identifisere en direkte binding sammenheng mellom SIRT1 og MIR-221 eller MIR-222. Dette tyder på at MIR-221 og MIR-222 indirekte begrense uttrykket av SIRT1 gjennom andre molekylære stier. Videre studier er nødvendig for å illustrere de mekanismer og molekylære veier av MIR-221, MIR-222, og SIRT1 som er involvert i patogenesen ved overekspresjon PCa de to microRNAs og modulering av ekspresjon av SIRT1 i forskjellige cellelinjer. Undersøkelse av biologiske funksjoner av MIR-221/222 og SIRT1 og deres forhold in vivo ved hjelp av dyremodell bør også vurderes.
I sammendraget, MIR-221 og MIR-222 høyt uttrykt i PC-3 celler . Hemming av MIR-221 eller Mir-222 uttrykk reduserer celleproliferasjon og migrasjon og øker apoptose i PCA celler. SIRT1 protein er oppregulert i celler etter transfeksjon av MIR-221 eller MIR-222-hemmer. Celler transfektert med siSIRT1 viser økt migrasjon og en redusert apoptose rate, men ingen effekt på celleproliferasjon. Disse data indikerer at de biologiske effektene av MIR-221 og MIR-222 i prostatakreftceller er forbundet med SIRT1. Modulering av ekspresjonen av disse molekylene kan påvirke tumorigenesis av prostatakreft. Disse funnene kan gi en potensiell terapeutisk tilnærming til prostatakreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. Autentisering av celler transfektert med MIR-221 eller MIR-222 inhibitor av Western blot. 1-8: nummererte kloner. Vellykket kloner indikert med piler ble slått sammen for å verifisere de biologiske eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0098833.s001 plakater (TIF)
Figur S2. Uttrykk for SIRT1 mRNA. Real time PCR ble utført for å måle SIRT1 mRNA endringer i PC-3 celler transfektert med PEX-5, MIR-221-hemmer eller MIR-222-hemmer. Det var ingen statistisk forskjell mellom gruppene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0098833.s002 plakater (TIF)
