Abstract
Vi utarbeidet en aerosol basert demetylering terapi for å oppnå terapeutisk effekt i premaligne eller in situ lesjoner av lungekreft, uten systemisk toksisitet. Optimale regimer med aero azacytidin (AZA) ble utviklet og brukt i ortotopiske menneske ikke-småcellet lungekreft xenograft modeller. Den terapeutiske effekt og toksisitet av aerosol Aza ble sammenlignet med intravenøst administrert Aza. Vi har observert at 80% av dråpene i den aerosol-Aza målt ~0.1-5 mikron, noe som resulterte i avsetning i nedre bronkial luftveiene. En dyremodell som phenocopies felt carcinogeneisis hos mennesker ble utviklet ved intratrakeal inokulasjon av de humane lungekreftceller i mus, noe som resulterer i sin fordeling gjennom hele luftrommet. Aerosolized Aza signifikant forlenget overlevelse av mus med endo-bronkial lungesvulster. Den aerosol behandling ikke forårsake noen påvisbar lungetoksisitet eller systemisk toksisitet. En pre-farmakokinetisk studie på mus viste at lungedeponering av aero Aza var betydelig høyere enn intravenøst. Lungesvulster ble resected etter aerosol behandling og metylering nivåer av 24 arrangører av tumor-supres gener relatert til lungekreft ble analysert. Aerosol Aza betydelig redusert metylering nivået i 9 av disse promotorer og reexpressed flere gener som ble testet. I konklusjonen, aerosol Aza på ikke-cytotoksiske doser synes å være effektiv og resulterer i DNA demetylering og tumorsuppressorgenet re-uttrykk. Den terapeutiske indeks av aerosol Aza er 100 ganger høyere enn for intravenøs Aza. Disse resultatene gir et preklinisk begrunnelsen for en fase I klinisk utprøving av aerosol Aza skal igangsettes ved vår institusjon
Citation. Qiu X, Liang Y, selgere RS, Perez-Soler R, Zou Y (2014) Aerosol azacytidin Hemmer ortotopiske lungekrefttilfellene i Mus gjennom DNA demetylering og Gene Reaktive Effects. PLoS ONE 9 (10): e109874. doi: 10,1371 /journal.pone.0109874
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 19 mars 2014; Godkjent: 12 september 2014; Publisert: 27 oktober 2014
Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien støttes av en NIH stipend 5R01CA154755. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft hevder 1,4 millioner liv hvert år (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/index.html~~number=plural) [1], [2]. Lungekreft oppstår som et resultat av kumulativ skade i bronkialepitelet forårsaket av innånding karsinogener. Fordi den kumulative skader påvirker hele luftveiene, er skadet luftveisepitel utsatt for å utvikle flere primære svulster i løpet av individets levetid [3]. Alle ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) stammer fra bronkialepitelet dekker store eller små luftveiene, noe som gir opphav til sentrale eller perifere svulster. For eksempel, plateepitelkreft lungekarsinom oftest oppstår sentralt i store bronkiene, lunge adenokarsinomer vanligvis utvikle perifert i de mindre luftveiene, og det kan oppstå store celle lungekarsinom i begge steder. Men alle tumorer stammer fra transformerte luftveis-epitelceller. Derfor selektiv terapeutisk intervensjon for tumorer begrenset til luftveiene bør effektivt å inhibere eller forsinke dannelsen uten å forårsake systemforgiftning [4] – [7]. Dessverre, ingen terapi spesielt rettet mot bronkialepitelet er for tiden tilgjengelig
Økt kunnskap innen epigenetikk og kreftutvikling har ført til den konklusjon at avvikende epigenetiske forandringer spille en viktig rolle under lunge kreftutvikling.; Dessuten er disse endringene opprettholdes gjennom hele prosessen med sykdomsprogresjon [8], [9]. For eksempel har stanse av tumorsuppressorgener (TSGs) ved avvik hypermethylation blitt funnet å spille en viktig rolle i kreft initiering og utvikling i flere krefttyper [10] – [19]. TSG promoter hypermethylation har også vist seg å korrelere med dårlig prognose og resistens mot kjemoterapi [20] – [26]. Spesielt kan alle genetiske lesjoner i lunge cancer, inkludert p53 og K-ras-mutasjoner, være konsekvensen av avvikende epigenetiske endringer [10], [27], [28]. Epigenetiske endringene er reversible kreftfremkallende hendelser [10], [29]. Kreften-spesifisitet av disse epigenetiske endringene gjør dem unike mål for spesifikke epigenetiske terapier [30]. Derfor hypoteser vi at ved å målrette den luftveisepitelet med en demethylating middel ved aerosol administrasjon, kan vi påvirke positivt naturhistorie for lungekreft.
Tidligere har vi observert at hypermethylation i arrangøren regionen i Rassf1 genet i menneskets NSCLC cellelinje H226 kan reverseres ved demethylating agenten azacytidin (Aza). Vi har også demonstrert ved hjelp av en klinisk relevant dyremodell utviklet av vår lab, som intratrakeal injeksjon (en lignende form for lokal administrasjon som aerosol) av Aza på sub-toksiske doser kan øke overlevelsen av mus orthotopically implantert H358 og H460 lungekreft [31 ], [32]. Dette klinisk relevant dyremodell var et bevis på konseptet at luftveis rettet epigenetisk terapi kan ha en fordel i forebygging og behandling av tidlig NSCLC. Her kan vi rapportere om effekten av aerosoliserte Aza i behandlingen av ortotopiske humane NSCLC-xenograft-modeller i mus, så vel som effekten av behandlingen på demetylering av spesifikke promotorer av TSGs i tumorvev. For å belyse de epigenetiske terapeutiske mekanismer, vi resected tumorvev fra xenopodet dyr behandlet med aerosol Aza, analysert metylering status for arrangører av 24 lungekreftrelaterte TSGs, og bestemt protein uttrykk nivåer av disse genene som viste betydelig promotering demetylering etter aerosol Aza behandling.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Menneskelig NSCLC cellelinjer H226, H358 og H460 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og holdt i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2 og 95% luft.
Dyr
Male og kvinnelig ICR og atymiske nakne mus, 6-8 uker gamle (Harlan) ble plassert i dyret anlegget på Albert Einstein College of Medicine. Alle dyrestudier ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen (protokollen Nummer: 20130312) ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Albert Einstein College of Medicine. I overlevelses studien ble dyrene observert daglig. Humane endepunkter ble brukt i denne studien: døende ble humant avlivet. Vi brukte to kriterier for å identifisere de døende dyr basert på vår bruk dyr protokoll: 1) mus har problemer med å puste, spise, eller drikke; 2) en mus taper ≥15% av kroppsvekten i 4 dager. Musene ble avlivet av CO2 i et innånding kammer fulgt av blodtapping. Anestesi ble brukt til å redusere ubehag under intratrakeal injeksjoner.
intratrakeal injeksjon
For intratrakeal (IT) injeksjon, ble en bolus av celler i suspensjon eller narkotika injisert inn i luftrøret. Fremgangsmåten anvendt til IT-injeksjon er tidligere beskrevet av oss [33]. I korthet, blir musene bedøvet med isofluran med en fordamper ved 2,5% isofluran levert av 2,0 PSI av oksygen og immobilisert ved hjelp av en sikringsanordning. Munnen blir åpnet med en tang og en liten rørformet lysanordningen er satt inn i munnen for å lokalisere luftrøret, hvis det er nødvendig. A 22 G foringsnål festet til en 1 ml sprøyte inneholdende cellesuspensjonen eller medikamentløsningen føres inn i luftrøret. Omtrent 3 pl oppløsning /g legemsvekt injiseres deretter intratrakealt. Musen er frigjort fra holdeanordning ved fullføring av prosedyren og observert inntil full utvinning fra anestesi.
ortotopiske endobronchial lungekreft xenograft modeller
atymiske nakne mus ble bedøvet som tidligere beskrevet og menneskelig NSCLC-kreftceller i suspensjon ble forsiktig inokulert inn i luftrøret (ca. 2-4 x 10
6 celler /mus) ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor. I disse modellene, flere svulster vokse innenfor lunge luftveiene. Levetiden av dyrene korrelerer med tumorbyrden, som er relatert til størrelsen av inokulum.
aerosolformulering
azacytidin (Sigma) ble oppløst i sterilt normalt saltvann ved 10 mg /ml rett før dosering. Den aerodynamiske størrelse aerosol Aza ble bestemt med ekstrudering-nedbør metode med en 7-trinns Cascade Impactor knyttet til PARI er forstøversystem i henhold til produsentens instruksjoner [34]. Aerosol administrasjon. Aerosol ble generert ved hjelp av en PARI personlige kompressor og LC stjerne forstøversystemet. Den aerosol-genereringshastighet var 0,25 ml /min. En nese-bare eksponeringssystem (CH Technologies Inc. Westwood, New Jersey) knyttet til PARI s aerosol system i en lukket kjemisk hette ble anvendt for aerosol-administrering til mus. Aerosol-administrering (min) (T) var strengt kontrollert. Aerosoldosen avsatt i lungene (mg /m
2) (D) ble beregnet ved å multiplisere tiden for eksponering (min) av aerosolinhalehastighet (ml /min) (R) og medikamentkonsentrasjon (mg /ml) (C) som tidligere beskrevet av oss [34], dvs. D = TRCI /W, hvor i er kroppsoverflate /vekt indeks (mg /m
2: mg /kg) (3 for mus) og W er dyrets kroppsvekt (kg). I en tidligere studie, målte vi aerosolinhalator hastighet i mus, definert som volumet av flytende aerosol avsatt i lungene mus i 1 min ble omtrent 10
-4 ml /min for en 25 g mus [34]. Den ønskede avsatte dose er oppnådd ved å styre den tid som aerosolen T = DW /RCI. For eksempel er aerosoladministrering tid for et avsatt dose på 2,5 mg /m
2 i en 25 g mus ved anvendelse av en 10 mg /ml konsentrasjon Aza oppløsning er T = 2,5 x 0.025 /10
-4 x 10 x 3 = 20,83 min.
Toksisitetsstudier studier~~POS=HEADCOMP
ICR mus (6 /gruppe) ble behandlet med aerosol Aza på 2,5 eller 75 mg /m
2 daglig × 7 dager. En gruppe mus ble behandlet med IT Aza på høyeste tolererte dose på 270 mg /m
2 som positiv kontroll for lungetoksisitet. Lungene ble resektert 7 dager etter den siste aerosoladministrering. Lungen toksisitet ble bestemt ved patologisk vurdering (3 lungene /gruppe) ved anvendelse av en tidligere beskrevet metode [34]. I tillegg er levedyktigheten til luftveis epitelceller ble også bestemt (3 lungene /gruppe). Kort beskrevet i lungevevet ble spaltet med liberase (Roche) og filtrert for å oppnå en enkel cellesuspensjon, som ble merket med anti-muse-Ep-CAM antistoff og fluorescens-konjugert geit-anti-rotte-sekundært antistoff (Biolegend, San Diego, CA), og sortert ved strømningscytometri. Prosenten av levedyktige celler ble bestemt ved utelukkelse av 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol farging. Den systemiske toksisitet ble bestemt ved å måle blod-celletellinger som en indikator av myelosuppresjon (det vanlig bivirkning IV Aza) [35]. Blodprøver ble tatt ved tidspunktet for avlivning ved hjertepunktur 7 dager etter siste behandling. Det totale antall hvite blodceller (WBC) ble bestemt etter fjerning av røde blodlegemer som tidligere beskrevet [32].
Pre-farmakokinetisk studie
Normale ICR-mus ble gitt aero Aza ved 2,5 mg /m
2 ved anvendelse av metoden beskrevet ovenfor. På hvert utformet tidspunkt (5 min, 20 min, 2 timer, 6 timer og 24 timer), tre mus ble avlivet og lungene ble resektert etter høyre ventrikkel perfusjon med saltvann. Azacytidin i lungene ble ekstrahert og kvantitativt målt ved hjelp av en tidligere rapportert fremgangsmåte ved hjelp av LC-MS system [36]. Den kvantitative påvisning ble utført av Millis Scientific Inc. Følsomheten var en ng Aza /ml prøve. Den Aza konsentrasjonen i vev vs. time data ble analysert og simulert med den beste montering (den høyeste R
2-verdi) i henhold til Microsoft Excel-programmet. Utlikningen av de simulerte kurvene C = f (t) ble anvendt for å beregnet AUC fra 0 til 24 timer som AUC = ∫
0-24 f (t) dt. Topp tid (T) og maksimal konsentrasjon ble oppnådd direkte fra observasjon av kurvene.
Antitumor effekt
Ti dager etter intratrakeal inokulasjon av tumorcellene, nakne mus ble tilfeldig delt inn i 3 grupper (6 mus /gruppe): 1) aerosolized Aza på 2,5 mg /m
2 daglig i 7 dager, 2) aerosolized normal saltløsning (kjøretøy) daglig i 7 dager, 3) eller IV Aza på 75 mg /m
2 daglig i 7 dager. I denne studien overlevelse ble observert daglig dyrene. Humane endepunkter for eutanasi (tidligere beskrevet) ble brukt i denne studien og døende mus ble humant avlivet og mus ble obdusert. Den Økt levetid (% ILS) [37] ble brukt til å vurdere effekten av hvert testet middel.
Histologi av lungekreft xenografter
Mus fra anti-tumor effekt studien ble obdusert etter døden og lunge- og tumor prøver for histologi ble samlet og plassert i 10% bufret formalin nevrale. Prøvene ble overført til 70% etanol og sendt til histologi og Comparative Patologi delt ressurs på Einstein for rutinemessig behandling til parafin. Vev ble seksjonert til 5 mikrometer, farget med hematoxylin og eosin (H E), og evaluert av et styre sertifisert veterinær patolog
Analyse av metylering status i lungesvulster
Mus peiling orthotopic lunge. svulster ble delt inn i 3 grupper og behandles med aerosol Aza, aerosol kjøretøy, eller IV Aza. To uker etter siste behandling, ble musene avlivet og synlig lungesvulster (1~3 mm) ble resected, frosset på tørris, og brutt ned i mindre ( 0,5 mm) biter av en Eppendorf-rør homogenisator. Hver tumor prøve ble delt i to porsjoner: en for metylering analyse og en annen for western blot. Metyleringen status av promotorområdene av 24 tumorsuppressorgener som er involvert i lunge karsinogenese ble målt ved anvendelse av en metylering qPCR matrise metode ved Qiagen (SA Bioscieces) som tidligere beskrevet [38].
Analyse av protein ekspresjon i lungetumorer
den andre alikvot av lungetumorprøver ble anvendt for å bestemme protein ekspresjon av TSGs. De TSGs viser betydelig promotering demetylering etter aerosol Aza behandling som analyseres ved metylering qPCR utvalg ble valgt for evaluering av western blot. De frosne vev ble homogenisert i kald RIPA-buffer med protease inhibitor cocktail (Sigma) ved bruk av en hånd-homogenisator, etterfulgt av ultralydbehandling. Proteinprøver ble fremstilt for Western blot etter en rutine protokoll fra Life-teknologi (Grand Island, New York). Primære antistoffer mot humant H-cadherin, OPCML, Rassf1a (Abcam), SFRP1 (Epitomics, Burlingame, CA), og beta-aktin (Santa Cruz Biotechnology) ble brukt til å identifisere målrettede proteiner. LI-COR C-sifret Blot Scanner ble brukt til å skanne de vestlige blotter; båndene ble analysert av Image Studio programvare (LI-COR). Det tetthetsforhold av målrettet protein vs. aktin lasting kontroll av hver prøve ble anvendt for å presentere de protein ekspresjonsnivåene semi-kvantitativt.
Statistisk analyse
Forskjeller mellom forskjellige grupper ble analysert ved to-side- log-rank (Mantel-Cox) test. En forskjell ble ansett som statistisk signifikant når p. 0,05
Resultater
ortotopiske NSCLC modeller
NSCLC er en sykdom i luftveiene epitel som følge av kronisk eksponering av luftbårne kreftfremkallende . For å etterligne dette spesielle tumorvekst i luftveiene i en xenograft modell, vi intra-trakealt inokulert humane NSCLC-celler direkte inn i luftveiene, og deretter sammenlignet denne modusen for transplantasjon til IV-injeksjon av tumorceller inn i nakne mus. Histologisk undersøkelse av lungene viste at svulst fordeling og vekstmønster var mer lik human lungekreft i IT-implantasjon modell: hoveddelen av kreftceller frø på overflaten av luftveisepitel på omtrent en uke etter implantasjon. Ved 3 uker, ble det observert små slimhinnetumorknuter lokalisert inne i luftveiene eller lunge vev tilstøtende til luftveiene, noe som indikerer primær tumorvekst i luftveiene og invasjon til lunge parenchyma (figur 1 øverste rad). Svulsten vekst og størrelse er celle line- og podestoff størrelse-avhengig. I vår erfaring, H460 (stor celle karsinom) svulster utvikles raskere enn H358 (bronchioalveolar karsinom) og mye raskere enn H226 (plateepitelkarsinom) når inokulert IT hos mus. I fravær av noen intervensjon, mus bukke til lungesvulster mellom dager 40 og 102. Det var ingen identifiserbare fjernmetastaser. I motsetning til nesten all synlig /påvisbar IV implantert kreftceller sådd i det kapillære system av lungen og forholdsvis langt borte fra luftveiene (figur 1 nederste rad), ligner mer metastatiske tumorceller som migrerer fra andre organer til lungen. Tumorene også utviklet raskere enn etter IT-implantering, og musene vanligvis døde på dagene 35-68 (data ikke vist). Våre resultater tyder på at IT implantasjon er et mer passende orthotopic xenograft modell for å etterligne menneskelig NSCLC enn IV modell eller andre ektopiske modeller.
Modellen ble opprettet av intratrakealt injisere NSCLC H460 celler i nakne mus. Topp: H E farget lunge seksjoner fra IT inokulert mus på dag 35. svulster (T) oppstår i luftveiene og vokse vicinally inn i lungeparenkym. Bunn: H E farget lunge seksjoner fra IV inokulert musene på dag 35. Svulster oppstår i små fartøy i lungeparenkym. Målet forstørrelse var 40X. Skalaen barer var 50 mikrometer.
Aerosol formulering
Vi har utviklet en aerosol formulering for proto demetylering agent, azacytidin (Aza). Formuleringen er sammensatt av Aza og injeksjons karakter sterilt normalt saltvann eller vann. Den Aza kraft kan hurtig oppløses ( 30 sek) i den vandige oppløsning rett før aerosol administrering. Det har blitt foreslått at aerosoldråpene mindre enn 5 um, spesielt 3 um i diameter innskudd oftest i de nedre luftveier, og derfor er egnet for farmasøytisk inhalering av aerosol-preparater av mennesker [39] [40]. Vi målte den aerodynamiske størrelsen av Aza aerosolpreparat under vårt aerosol-genereringssystemet med ekstrudering-utfellingsmetoden [34], og fant at omtrent 80% av dråpene (vekt%) var mellom 0,25 til 5 pm i diameter, og ca. 71% mellom 0.25~3 mikrometer (figur 2). Våre resultater tyder på at ca 71~80% av dråpene skal sette i distal luftveiene hos mennesker [39] [40].
T bestemmes med ekstrudering-nedbør metode med en 7-trinns Cascade Impactor knyttet til PARI s personlig kompressor og LC stjerne forstøversystemet. Aza-løsning (4 ml) ble aerosolisert ved en luftstrømhastighet på 5 l /min. De kondenserte aerosol Prøver ble tatt ved 3 forskjellige intervaller fra 1 til 1,5 minutter fra 3 til 3,5 minutter, og 5 til 5,5 min. Aerodynamisk størrelse og fraksjon av aerosol med et spesielt størrelsesområde ble målt og beregnet i henhold til produsentens protokoll. Dataene var gjennomsnitt ± standardavvik av den aerodynamiske størrelsen basert på vekt (solid barer) og kumulativ vekt (tom bar) fra 3 uavhengige eksperimenter.
toksisitet og dose utvalg
Fra vår tidligere studie har vi lært at den effektive demetylering konsentrasjon av Aza for dyrkede celler kan være 3 logger lavere enn IC
50. Antitumor effektive dose (7,5 mg /m
2 x 3) ved intratrakeal injeksjon av Aza i musemodellen ikke forårsake lungetoksisitet eller påvisbar systemisk akutt toksisitet, og lungetoksisitet bare forekom ved den høyeste dose på 270 mg /m
2, som var den høyeste tolererte dose av IV injeksjon [32]. Basert på disse resultatene, valgte vi en dose for aerosol Aza at vi forutsa ville ha demetylering funksjon og terapeutisk effekt uten signifikant toksisitet. Resultatene tyder på at den valgte aerosol dose på 2,5 mg /m
2 (ca. 21 min aerosoleksponering til en 25 g mus) daglig i 7 dager eller et høyere intratrakeal bolusinjeksjon dose på 75 mg /m
2 etter 5 dager ikke forårsake noen påvisbar lungetoksisitet (evalueres histologisk) eller systemisk toksisitet (målt ved myelosuppresjon) på dag 7 etter siste administrasjon (figur 3A, B). Pulmonær toksisitet (pneumonitt) (figur 3C) og myelosuppresjon (figur 3D) bare forekom når musene fikk den høyeste dose av intravenøs eller intratrakeal injeksjon av Aza ved 270 mg /m
2 (MTD for intravenøs Aza). Tilsvarende hadde den aerosol Aza ved den valgte terapeutiske dosen ikke forårsake noen død av luftveis-epitel-celler som bestemt ved strømningscytometri, sammenlignet med den positive kontrollen i mus behandlet med den høyeste IT-doser av Aza ved 270 mg /m
2 ( Figur 3E).
Lung deler av mus behandlet med aerosol Aza på 2,5 mg /m
2 × 7 (A), IT Aza på 75 mg /m
2 × 7 (B), og IT Aza på 270 mg /m
2 × 5 (C), henholdsvis viser ingen toksisitet ved 2,5 og 75 2,5 mg /m
2, men lungebetennelse på 270 mg /m
2. Målet forstørrelse var 40X. Skalaen barer var 50 mikrometer. Hvite blodlegemer forholdet (etter behandling sammenlignet med før behandling, n = 6) (D) og prosentandel av levedyktige celler av sortert luftveis-epitelceller (n = 6) (E), respektivt.
Terapeutisk effekt
Systemisk (IV) administrering av Aza har ført til begrenset effekt hos NSCLC pasienter [41] [42], som har blitt rekapitulert i våre eksperimentelle musemodeller av NSCLC som behandles med IV Aza, (figur 4A-C). Det er faktisk lite eksperimentelle bevis støtter bruk av en demetylering middel for effektivt å inhibere lungecancer i dyremodeller [43] [32]. En av de mulige grunner til dette er at meget ustabil stoffet ikke var effektivt leveres til lungesvulster. Vi var den første gruppen til å rapportere en proof of concept studie hvor administrasjonen av Aza direkte inn i luftveiene effektivt forlenget overlevelse av mus med ortotopiske lungekreft [32]. I denne studien, er vi rapporterer resultatene med aerosol Aza for behandling i menneskelige ortotopiske NSCLC xenograft i mus. Et mål var å vise at aerosol levering av Aza til luftveisepitel effektivt kan hemme veksten av klinisk relevante NSCLC-modeller. I tillegg ble disse studiene videre utformet for å undersøke hvorvidt aerosol levering av demethylating midlet kunne hemme veksten av tumorer i luftveiene ved lave doser demetylering snarere enn cytotoksiske dose (Figur 4A-C).
Mus inokulert intratrakealt med cellelinjene H226 (A), H358 (B), eller H460 (C) ble behandlet med aerosol Aza (rød tykk linje) ved 2,5 mg /m
2 daglig i 7 dager eller aerosol kjøretøy (blå tynn linje) med det samme volum. Behandling med IV Aza (stiplet linje) ved den optimale dose på 75 mg /m
2 daglig i 5 dager, ble anvendt som kontroll. Den statistiske sammenligning av overlevelseskurver ble utført med Log-rank (Mantel-Cox) test. P-verdier for H266, H358 og H460 modellene var 0,0135, 0,0150 og 0,0719, henholdsvis. Forhånds farmakokinetikken til aerosol Aza (D). ICR-mus ble behandlet med aerosol Aza ved 2,5 mg /m
2. De data ved hvert tidspunkt var det gjennomsnittlige ± standardavvik av prosent gitt /initial dose fra lungene til 3 mus. Ligningen for hver kurve ble simulert kurve med den beste montering (den høyeste R
2-verdi) i henhold til Microsoft Excel-programmet.
Våre resultater tyder på at en lav dose aerosol Aza betydelig forlenget levetid av mus med endobronchial tumorer. De% ILS og median overlevelse ble forlenget med 5.1- og 1,5-, (p = 0,0135), 6.4- og 1.9- (p = 0,0150), og 8.9- og 1,6- (p = 0,0719) fold i gruppene behandlet med aerosol aza ved anvendelse av en dose mer enn 20 ganger lavere enn dosen som anvendes ved systemisk behandling kontrollgruppen, i det H226, H358, H460 og modell, respektivt. Disse resultatene viser tydelig at aerosol administrering av Aza på demethylating, ikke-cytotoksiske doser er bedre enn systemisk administrering av Aza i form av tumorvekst hemmende effekt.
Pre-farmakokinetikken
For å finne avsetning av Aza i lungene gjennomførte vi pre-farmakokinetiske studier in vivo. Intravenøst injisert Aza med den samme dose ble anvendt en sammenligning. På det første tidspunkt (3 min, tidligst mulig tidspunkt), kan vi gjenvinne ~89% av den opprinnelige aerosol dosen fra lungen. Når imidlertid den samme dose ble gitt ved systemisk injeksjon, toppkonsentrasjon i lungene var bare 1,62% av den opprinnelige dose. Arealet under-konsentrasjon mot tidskurven (AUC
0~24 h) av aerosol-Aza var 15 ganger større enn den til IV Aza (tabell 1). Aza gitt via begge rutene viste en tilsvarende nedgang mønster: en rask nedgang i løpet av de første 2 timer etter administrasjon fulgt opp av en langsommere nedgang. Aerosolized Aza viste langsomt nedgang i langsommere fase mens IV Aza viste en forsinket hevings konsentrasjon i lungene (figur 4D). Disse data viser at aero Aza har høyere vev konsentrasjon i lungene med forutsigbare lavere systemisk eksponering enn IV Aza.
Aerosol Aza demetylering
For å analysere om Aza har en demethylating effekt i klinisk relevante NSCLC-modeller, høstet vi lungesvulster fra de xenograft-modeller som ble behandlet med aerosol Aza eller IV Aza og bestemt metylering status av promotorområdene av 24 tumorsuppressorgener, hvis promoter hypermethylation er rapportert som relevant i lungekreft litteratur. Normale bronkiale epitelceller fra dyr uten Aza behandling ble anvendt som grunnlinjekontroll metylering. De 24 TSGs valgt er APBA1, APC, CADM1, CDH1, CDH13, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CXCL12, CYP1B1, DLC1, FHIT, MLH1, MTHFR, PAX5, PRDM2, R R, RASSF1, RASSF2, SEMA3B, SFRP1, SLIT2, TCF21 og TGFB1. Vi fant at 11 av de 24 arrangører ble hypermethylated i tumorprøver fra 3 forskjellige xenograft modeller, og at aerosol Aza kunne demethylate fem av dem (figur 5A). I kontrakten, IV Aza i samme dose ikke viste noen demethylating effekt (figur 5B). Dataene vist i figur 5 avbilder metylering nivå detektert av en q-PCR metylering matrise og er presentert som% metylering av den totale CG cytosin av den spesielle promoter-regionen.
tumor-bærende mus fra 3 ortotopiske lungekreft modeller (H226-xeno, H358-xeno og H460-xeno) ble behandlet med aerosol Aza (A) eller IV Aza (B) på 2,5 mg /m
2 daglig × 7. Lungene ble resected 14 dager etter siste behandling og tumornoduler større enn 1,5 mm ble isolert for metylering påvisning av qPCR array-teknologi på Qiagen (SA biovitenskap). Dataene er% metylering av den totale CG cytosin av den aktuelle arrangøren regionen.
TSG re-uttrykk
For å analysere om demetylering på arrangøren regionen TSGs kan aktivere den TSGs, resected vi lungesvulster og målte protein uttrykk for TSGs som arrangører var betydelig demetylert etter aerosol Aza behandling. Western blotting-analyse ble brukt for å påvise genekspresjon i tumorprøver fra samme mus brukt i demetyleringen studien. Vi valgte 5 TSGs som arrangører var betydelig demetylert etter aerosol Aza behandling. Vi fant ut at H-Cad og Rassf1 i H266 svulster, H-cad, OPCML, og SFRP1 i H358 svulster, og OPCML i H460 svulster ble reaktivert på proteinnivå (Figur 6A og B) etter aerosol Aza behandling. Ekspresjon av disse TSGs har vist seg å hemme eller forsinke kreftutviklingen i flere typer kreft, inkludert lungekreft. For eksempel har vi rapportert før at tap av H-cadherin i human NSCLC er forbundet med tumorgenisitet [44]. Promoterregionen av Rassf1a er også funnet sterkt metylert i lungekreft [45]. OPCML, en bred tumor suppressor opprinnelig funnet i eggstokkreft, er funnet metylert i mange lungekreft cellelinjer [46]. SFRP1 i Wnt signalveien er transcriptionally brakt til taushet av arrangøren hypermethylation i NSCLC [47]. Resultatene av denne in vivo studie antyder at aerosol demethylating behandling kan være effektive i å hemme endo-bronkial lungesvulster og bronchial premaligne lesjoner.
Western blotting-analyse ble brukt for å bestemme protein ekspresjon av TSGs med sterk promoter demetylering etter aerosol Aza behandling identifisert ved metylering q-PCR-array. De tumorprøver var de samme som anvendt i figur 5; Histogram av de vestlige blotter (B). Western blot foto filmene ble skannet og tetthetsforhold av målrettet protein vs. aktin lasting kontroll av hver prøve ble presentert som proteinet ekspresjonsnivået.
diskusjon
Lungekreft er vist som en «genetisk sykdom» [48], [49]. Ved demonstrasjonen som TSG deaktivering og onkogen aktivering spiller en avgjørende rolle i kreftutvikling, har de terapeutiske arbeidet gradvis skiftet fra å optimalisere uspesifikke stråling og kjemoterapi former for terapi som i hovedsak dreper raskt dele celler til å utvikle midler som er rettet mot de spesifikke genetiske endringer . Nyere bevis tyder på en direkte sammenheng mellom avvikende epigenetiske forandringer og kreftutvikling; indikerer det at kreften er også delvis et epigenetisk sykdom. I motsetning til genetiske endringer, epigenetiske endringene skjer tidligere i kreft progresjon og er reversible. Derfor bør en terapeutisk strategi med sikte på å reversere avvik epigenetiske endringene være en mer effektiv strategi enn de som fokuserer på bruk av ikke-spesifikke cytotoksiske midler eller på målretting irreversible genetiske defekter.
Ifølge feltet cancerization modell [3 ] [50], alle bronkiale epitelceller akkumuleres epigenetisk og genetiske lesjoner til en enkelt celle får en malign fenotype og gir opphav til en invasive svulster, mens de gjenværende av banen fortsetter å akkumulere epigenetisk og genetisk skade og er i fare for å utvikle andre primære lungekrefttilfellene (andre primærvalg) [51] [52]. I løpet av denne prosessen, avvikende epigenetiske endringer, for eksempel hypermethylation av arrangører av TSGs, inntreffer før og kan forårsake de påfølgende genetiske endringer, og de fortsetter i tumorceller gjennom hele prosessen med kreftutvikling.
På denne
