Abstract
Bakgrunn
Eggstokk karsinomer bestå av minst fem forskjellige sykdommer: høyverdig serøs, lavgradig serøs, klarcellet, endometrioid, og mucinkjertler. Biomarkør og molekylær karakterisering kan representere en mer biologisk relevant grunnlag for å gruppere og behandling av denne familien av svulster, snarere enn stedet opprinnelse. Molekylære karakteristika har blitt den nye standard for klinisk patologi, men utviklingen av skreddersydde type-spesifikke terapier blir hemmet av en svikt i grunnleggende forskning for å erkjenne at modellsystemer som brukes til å studere disse sykdommene må også være lagdelt. Urelaterte modellsystemer gjøre tilbudet verdi for studier av biokjemiske prosesser, men bestemt cellulær sammenheng må brukes for å vurdere relevante terapeutiske strategier.
Metoder
Vi har fokusert på identifisering av klarcellet karsinom cellelinje modeller. Et panel av 32 «ovarian kreft» cellelinjer har blitt klassifisert i histotypes ved hjelp av en kombinasjon av mutasjonsprofiler, IHC mutasjons surrogater, og en validert immunhistokjemiske modell. Alle cellelinjer ble identitet bekreftet ved hjelp STR analyse.
Resultater
Mange beskrevet eggstokkene klare cellelinjer har karakteristiske mutasjoner (inkludert
ARID1A Hotell og
PIK3CA
) og en total molekyl /immuno-profil som er typisk for primære svulster. Mutasjoner i
TP53
var til stede i de fleste av høy klasse serøs cellelinjer. Avansert genomisk analyse av bona-fide klart cellekreft cellelinjer også støtte kopiantall endringer i typiske biomarkører slik at
MET Hotell og
HNF1B
og en mangel på noen tilbakevendende uttrykte re-ordninger.
Konklusjon: Som med primære ovarietumorer, mutasjonsstatus av kreftgener som
ARID1A Hotell og
TP53
og en generell immun-profil tjene godt for å etablere histotype av eggstokkreft celle Vi beskriver spesifikke biomarkører og molekylære funksjoner for å re-klassifisere generiske «eggstokkkreft» cellelinjer til typespesifikke kategorier. Våre data støtter bruk av prototyper klare cellelinjer, slik som TOV21G og JHOC-5, og stiller spørsmål ved bruk av SKOV3 og A2780 som modeller av høy klasse serøs carcinoma
Citation. Anglesio MS, Wiegand KC, Melnyk N, Chow C, Salamanca C, Prentice LM, et al. (2013) typespesifikk cellelinje Modeller for typespesifikke Ovarian Cancer Research. PLoS ONE 8 (9): e72162. doi: 10,1371 /journal.pone.0072162
Redaktør: Goli Samimi, Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, Australia
mottatt: 19 april 2013; Godkjent: 07.07.2013; Publisert: 04.09.2013
Copyright: © 2013 Anglesio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støtte for dette prosjektet ble gitt til Ovarian Cancer Research team of British Columbia (OVCARE; https://www.ovcare.ca) gjennom BC Cancer Foundation, The VGH og UBC Sykehus Foundation og den kanadiske Institutes for Health Research (CIHR) Emerging teamet Grant : Personlig siRNA-Based Nanomedicines (FRN: 111627). Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
eggstokkreft er et mangfoldig sett av sykdommer og blant de mest klinisk signifikante, epiteliale eggstokkreft (EOC), minst fem atskilte enheter eksisterer [1] – [9]. På et bredt nivå, vilkårene type I og type II EOCs blir ofte brukt, hvor høy grad serøs karsinom (HGSCs) er type II og alle andre histologier er type I kreft [8]. Men selv innenfor type I, eksisterer atskilte enheter, nemlig lavgradig serøs karsinom (LGSC), endometrioid karsinom (ENOCa), klarcellet karsinom (CCC) og mucinous karsinom (MUC). Det er betydelige data som tyder på at et flertall av HGSC stammer fra egglederen epitel [1], [10] – [13], mens lav grad av serøs svulster er generelt fortsatt tenkt å oppstå fra eggstokkene overflaten epitel – selv om dette forholdet er å være utspurt [7], [14]. ENOCa og CCC tumorer forekomme i en bakgrunn av endometriose og kan representere et spektrum av fortrengt, ondartet endometrium [15] -. Endelig mucinkjertler svulster er svært sjelden og deres sanne opprinnelse er vanskelig å fastslå med undergrupper av distinkt histologi. Deres likhet med andre mucinkjertler epiteliale kreftformer, særlig mage kreft, har lagt til forvirring av deres opprinnelse [3], [21] – [23]
Kliniske svar og epidemiologiske forskjellene er også tydelig mellom histotypes.. Høy grad av serøs kreft vise de beste innledende responsrater til dagens standard kjemoterapi regime av platina og taxaner [24], [25]. Familiær
BRCA1 /BRCA2
mutasjoner også synes i stor grad begrenset til denne histologi [26] – [28]. Omvendt, de mindre histotypes en tendens til å forekomme hos yngre pasientpopulasjoner og mer ofte tilstede ved lavere trinn [29] – [31]. En liste over noen av de mer særtrekk mellom histotypes typer er gitt i tabell 1.
Uansett opprinnelse eller histologiske likheter og forskjeller, biomarkør og genomiske studier har blitt brukt til å skille hver histotype og kan representere en langt mer biologisk relevant basis for klassifisering og deretter behandles EOCs. Selv om dette konseptet er godt akseptert, og få trekkraft på å bli en ny klinisk standard, tvetydige cellelinje modeller foreviget gjennom molekylærbiologi benk forskning hemme utviklingen av skreddersydde typespesifikke behandlingsformer. De som bruker benk eksperimentmodellsystemer må erkjenne at, som primære kreft, modellene som brukes til å studere disse sykdommene må også stratifisert. Selv om biokjemiske studier kan generere nyttig informasjon fra å bruke en rekke urelaterte modellsystemer, sykdomsspesifikke studier må bruke mobilnettet sammenheng. De aller fleste av forskning ansette funksjonelle studier på «ovarian kreft» cellelinjer ikke skal fastslå på bakgrunn av sine modellsystemer. Resulterende konklusjoner kan være vanskelig å tolke og verdien av potensielle terapeutiske mål kan være tvilsom som er den egentlige betydning for en bestemt sykdom.
-cellelinje studier av ovarial cancer er blitt alvorlig hemmet på grunn av mangel på riktig annotering av «ovarie carcinom cellelinjer». En gang i kultur, celler ikke lenger ha lett identifiserbare morfologiske trekk til hjelp i histologiske klassifikasjon. I tillegg har menneskelige feil, feilsetting og generisk funksjon i «epitel-lignende» cellelinjer førte også til å blande ups av cellelinjer og forurensning som har resultert i un-tolkbare data [32], [33]. I post-genom era, er biomarkører og genomiske funksjoner for ovarialcancer subtyper svært godt etablert. Screening teknikker for å analysere biomarkører og verifisere genomiske funksjoner er også allment tilgjengelig. Her presenterer vi et panel av biomarkører og molekylære funksjoner over 32 brukte og in-house avledet eggstokkkreft cellelinjer. Vårt første mål var å etablere en bona-fide liste over CCC cellelinjer for vårt eget forskningsprogram, men vi foreslår at det etableres type spesifisitet for disse cellelinjene skulle ble den nye standarden i planlegging og gjennomføring av eksperimenter rundt noen studie på epitelial ovarialcancer.
Metoder
Cell kultur
Celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO
2. Se tabell S1 for en liste over cellelinjer, dyrkningsforhold og bidrar laboratorier og repositories. Noen cellelinjer ble avledet in-house (merket med «VOA #») gjennom kontinuerlig
in vitro
kultur primære pasientmateriale innhentet gjennom OVCARE Tumor banken. Alle pasienter med vev deponert i OVCARE svulst banken gitt skriftlig samtykke til eksperimentelle studier inkludert sekvensering, IHC karakterisering og avledning av langsiktige cellelinjer fra vevsprøver. Den OVCARE svulst bank Studien ble godkjent i henhold til University of British Columbia og British Columbia Cancer Agency forskningsetikk Board H05-60119 protokollen.
Alle cellelinjer ble utsatt for identitets testing med STR genotyping (AmpFlSTR Identifiler, Applied Biosystems) ved College of American patologen tallet (CAP) akkreditert senter for translasjonell og Applied Genomics (CTAG) i henhold til produsentens instruksjoner. Kun linjer med profiler som sams offentlig register poster, rapporterte STR [32], og /eller originale pasient svulster (i tilfelle av interne avledet cellelinjer) ble beholdt for videre studier.
Immunohistochemistry og kalkulator av Undergruppe Prediction (COSP)
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP ble skrapet fra kultur plater, vasket 2 x med PBS og pelletert. Cellepelletene ble resuspendert i rundt 500 ul 10% nøytral bufret formalin (NBF) og tillatt å feste over natten. Celler ble pelletert på nytt og på nytt suspendert i en Histo-gel (Thermo Fisher) plugg før innstøping i parafin. En vev microarray (TMA) ble konstruert som tidligere beskrevet [4] som tar 3 x 2 mm kjerner fra cellelinjen plugger. Immunhistokjemi (IHC) ble utført på 4 um seksjoner på en Ventana Discovery XT system som tidligere beskrevet [2], [34], se tabell S2 for detaljer vedrørende antistoffer som brukes. Histotype prediksjon ble gjort ved hjelp av kalkulatoren av Undergruppe Prediction (COSP) [2] i tumor bank modus. Tumor bank-modus ble valgt på grunn av beskaffenheten av de faste cellelinjer og den kontrollerte fiksering periode lik den tumorbanken prosess som denne prediktor ble trenet. Scoring kriterier for IHC ble gjort visuelt og fulgt nøyaktig retningslinjer som foreslås i den opprinnelige COSP artikkel [2]. IHC for mismatch reparasjon (MMR) proteiner (tabell S5) ble utført som beskrevet i [35], et fullstendig fravær av farging for en gitt MMR-protein resulterte i en score på 0 (negativ), og er antatt å resultere i MMR mangel.
mRNA transkripter
RNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp Qiazol-miRNeasy kit (Qiagen) protokoll og fra primærsvulster, 12 tilfeldig valgt fra hvert histotype, ved hjelp av miRNeasy FFPE kit (Qiagen). Alle RNA transkripsjonsnivåer ble målt ved hjelp av NanoString NCounter system [36] og data normalisert med nSolver programvare v1.1 (NanoString Inc.) ved hjelp av endogene kontrollgener (
ACTB, SDHA, RPL19, POLR1B, PGK1
) som per produsenter direktiver. I tilfelle av
TFF3
mRNA nivåer vi har vurdert eventuelle prøven med påvisbare transkripsjoner å være positiv og erstattet en score på «1» i stedet for TFF3 IHC ved bruk COSP. Deteksjonsgrensen (DT) for mRNA ble ansett for å være den maksimale telling fra pigg-i negative kontroll sondene (på tvers av alle cellelinje prøver) pluss 2 standardavvik. Statistiske tester ble beregnet ved hjelp GraphPad Prism v6.0c programvare
Mutation Testing og Genomisk analyse
Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av standard metoder (Gentra Puregene kit, Qiagen).. Regioner som omfatter mutasjoner av kjent signifikans (Kreft hotspots) var Sanger sekvensert ved hjelp av M13-merkede primere. Sekvensering av
ARID1A
ble gjort gjennom en kombinasjon av tilpassede hybrid fangst og transkriptom sekvensering på en Illumina GAII neste generasjons sekvensering (NGS) system som beskrevet tidligere [16], [37]. Associated rådata avsettes i NCBI Sequence Les Arkiv henhold BioProjects PRJNA209481, PRJNA209482, og PRJNA209484. Alle bemerket varianter ble enten verifisert av Sanger-sekvensering eller anses godkjent hvis registrert i Kreftcellelinje Encyclopedia (CCLE) [38] og /eller den kosmiske databasen [39]. Uttrykt re-ordninger ble spådd fra transkriptomet sekvense data for CCC cellelinjer TOV21G, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, og RMG-2 bruker uskadeliggjøre [40] (tabell S3).
Kopier nummer analyse
DNA kopiantall ble utledet fra Affymetrix SNP 6,0 genom-wide mikromatriser. Arrays ble kjørt som per produsenter direktiver og kopiantall forholdet generert fra en uparet referanse. Påvisning av kopitall endret regioner ble gjort ved hjelp av en segmentering algoritme. All analyse og visualisering ble henrettet med Partek Genomics Suite 6.6, er rådata tilgjengelige fra NCBI GEO [Tiltredelse GSE48351].
Resultater
Histotype av COSP i eggstokkreft cellelinjer
ovarian cancer-cellelinjer dyrket i kultur har ikke de samme histologiske fenotyper som er nyttige for klassifisering i de store sykdomstyper. Vår gruppe har beskrevet et stort antall av immunhistokjemiske biomarkører som viser bestemte profiler på tvers av disse histotypes [4], [41] – [43]. En kjerne panel av 9 IHC markører kombinert med en prediktiv algoritme, Kalkulator for Ovarian Undergruppe Prediction (COSP), kan brukes til pålitelig skille mellom typer [2]. Vi har tidligere vist en høy grad av samsvar mellom våre prediktiv immun-klassifikator og konsensus ekspert gynecopathological review [2],. Innledningsvis påføres vi dette panelet (fig 1A-B), og den COSP prediktiv algoritme, for å 32 eggstokkkreftcellelinjer av tvetydig histotype å fastslå om cellelinjer beholdt representative egenskaper tilstrekkelige til å klassifisere cellelinjer til deres sanne sykdom opprinnelse og gi rom for typen -spesifikk eggstokkreft modellutvikling. Den TFF3 IHC markør, som normalt er sterkt forbundet med mucinous typen og sett ved moderat frekvens i ENOCa og LGSC [2], var negative for alle prøvene (tabell S4), noe som tyder på dette utskilt faktor, hvis uttrykt i det hele tatt, kan bli utvist raskt fra cellene og vaskes bort i media. Følgelig kan TFF3 IHC ikke være en pålitelig måling biomarkør for bruk med dyrkede celler. Men forekomsten av
TFF3
mRNA i primærprøver viste lik som rapporteres av IHC [2], [44], med gjennomgående høyere uttrykk i mucinkjertler karsinom (p 0,01; Fig. 1C). Vi byttet derfor påvises
TFF3
mRNA for IHC og scoret noen cellelinje med påvisbare mRNA som «1» i vår COSP algoritme (Fig. 1D og tabell 2).
(A-B) representant IHC fra en typisk høyverdig serøs ovarialcancer cellelinje, Kuramochi, og en klar karsinom cellelinje, TOV21G. I tillegg til de ni-markør COSP panel, er IHC for ARID1A (BAF250a) også vist som en mutasjon surrogat. (C)
TFF3
mRNA uttrykk fra 60 eggstokkreft prøver (12 av hver histotype). Som nevnt tidligere er høy ekspresjon er mest utbredt i MUC, etterfulgt av ENOCa og LGSC [2], [4]. Uttrykk i vår pilot kohort antyder de høyeste nivåene av TFF3 i MUC, som var betydelig høyere enn alle andre grupper (Tukey justerte p 0,01); ingen andre parvise sammenligninger hadde p 0,05. (D)
TFF3
mRNA påvist i ovarie cancer-cellelinjer ble anvendt i stedet for en IHC poengsum som det utskilte TFF3 ble betraktet som en dårlig biomarkør for cellekulturbetingelser. Enhver cellelinje med målbar
TFF3
mRNA over NanoString deteksjonsgrensen (se metoder) ble ansett som positive (score 1 for bruk i COSP algoritme).
Mange tidligere beskrevet CCC linjer viste funksjoner karakteristisk for deres forventede opprinnelse. I tillegg til den COSP 9-markør panel, la vi IHC for ARID1A (BAF250a). Gitt den sterke negative sammenslutning av mutasjonsstatus og påviselig protein uttrykk [16] vi betraktet denne analysen som et surrogat mutasjon test nyttig i segregerende endometriose forbundet eggstokkreft fra andre undergrupper, særlig høyverdig serøs, som
ARID1A
mutasjoner synes å være svært sjelden i denne subtype [16], [45]
mutasjons Profiler. Clear celle spesifikke molekylære funksjoner
Vi neste testet cellelinjer for mutasjoner i vanlige eggstokkreft forbundet gener (Tabell 2 og Tabell S5). Som noen av cellelinjene vi testet er også en del av en større kreftcellelinje Encyclopedia (CCLE) depotet datasett [38], vi krysser-godkjent våre mutasjonstesting med denne databasen, så vel som den kosmiske databasen [39]. Vi har fokusert på områder med kjent betydning i vanlige kreftgener inkludert hotspots i
BRAF, KRAS, NRAS, erbB2, EGFR, CTNNB1, PIK3CA, PPP2R1A Hotell og
DICER1
. Alle koding eksoner av
TP53
ble bekreftet i alle cellelinjer.
ARID1A
mutasjoner ble testet ved hjelp av en tilpasset NGS gen hybrid fangst strategi [37] i RMG-en, RMG-2, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, TOV21G, og ES-2; for alle andre cellelinjer vi brukte
ARID1A
data fra COSMIC og CCLE i tillegg til IHC som en
ARID1A
mutasjonstesting surrogat (tabell 2).
Som med vår IHC data fleste CCC linjer opprettholdes en profil i samsvar med CCC histotype inkludert mutasjoner i
PIK3CA Hotell og
ARID1A
. Videre, tap av ARID1A uttrykk, demonstrert av IHC, viste god samsvar med tilstedeværelse av kjente avkorting mutasjoner, som nevnt for primær vevsprøver [16]. Som forventet IHC for p53 korrelert godt med forekomst av mutasjoner. For cellelinjer med en innspilt mutasjon (på tidspunktet for innlevering) i enten CCLE eller kosmiske alle oppdagede mutasjoner matchet depotet poster, bortsett fra en homozygot /hemizygous 127-bp sletting av
TP53
påvist i MCAS. Vi antar at den 127-bp sletting i MCAS (på slutten av exon 4, Fig. S1) kan ha blitt oversett i CCLE ekson sekvense strategi som i vår erfaring falske negativer er utbredt i NGS datasett. Samlet, tillegg av mutasjonen data var spesielt nyttig i å støtte innledende klassifisering fra COSP (tabell 2).
Vi tok oppmerksom på at en rekke cellelinjer ofte brukes som høyverdig serøs modeller eller generisk som «ovarialcancer «hadde både
ARID1A
mutasjoner og immun-profiler i samsvar med endometrioid typen, den tredje vanligste typen regnskap for mindre enn 10% av eggstokkene karsinomer [3], [4]. Sammen med immun-klassifisering tilstedeværelsen av en
ARID1A
mutasjon gitt overbevisende bevis for en ikke-HGSC opprinnelse. Forekomsten av
TP53 Hotell og
ARID1A
mutasjon var nær gjensidig utelukkende med unntak av IGROV1 og 2008. IGROV1 bærer to frame shift mutasjoner i
ARID1A plakater (p.M274fs /p.G1847fs) og en mutasjon av ukjent betydning i
TP53 plakater (p.Y126C (het)), men p53 uttrykk ved IHC dukket normal. 2008 cellelinjen hadde ikke målbart ARID1A, noe som tyder på tap av funksjon, og også gjennomført to
TP53
mutasjoner (c.572_574 delCTC (het) /c.673-1 G T (het, spleisesete)) og tilsvar p53 IHC overekspresjon. Disse atypiske kombinasjoner av mutasjon kan plausibly forklares med en tilbøyelighet til å akkumulere mutasjoner i cellelinjer med DNA mismatch reparasjon (MMR) mangler, som har blitt rapportert for IGROV1, SKOV3, og A2780 [46], [47]. Vi validert MMR pathway proteinekspresjon med IHC for MLH-1, PMS-2, MSH-2, og MSH-6 (tabell S5) og observerte tap av to eller flere MMR proteiner i IGROV1, SKOV3, A2780 TOV21G, COLO-704 og Colo-720E; ingen MMR proteinmangel ble notert i 2008 cellelinjen.
Kopier Antall profiler av tydelige cellelinjer
Som vårt primære mål var å beskrive CCC cellelinjer vi generert kopi nummer profiler av bona-fide CCC cellelinjer ved hjelp av Affymetrix SNP6.0 mikromatriser. I samsvar med tidligere rapporter ved hjelp av primær tumorprøver, CCC linjer viste en moderat grad av kopiering antall avvik, noe som tyder på et genom som har gjennomgått en viss grad av genomisk ustabilitet.
Et begrenset antall litteratur rapporter har markert gener med mutasjoner, overekspresjon og /eller forsterkning blant primær CCC, noen med et forhold til overlevelse eller avansert sykdom [4], [16], [45], [48] – [59]. Som vi har observert i mutasjonsprofiler, vår bona-fide CCC cellelinje panel var representant for clear-celle forbundet kopinummerendringer (figur 2, Tabell 3). Mest viste beskjeden kopitall gevinster for
HNF1B product: (5/7) og
MET (4/7)
, inkludert en med høyt nivå forsterkning (JHOC-5), i likhet med tidligere rapporter for CCC tumorer [53], [56], [57]. Selv om 3/7 CCC linjer viste kopiantall gevinst på
ErbB2
, i alle tilfeller amplicon segmentet også omfattet nærheten CCC biomarkør
HNF1B
, og ingen var positive for HER2 protein uttrykk ved IHC ( ikke vist). Kopier nummer tap rundt
TP53
ble kun observert i en enkelt CCC cellelinje (OVMANA; heterozygot tap) og, som nevnt ovenfor, alle CCC linjene syntes å ha en normal liknende uttrykk mønster for p53 (IHC scorer 1 ).
Et stort utvalg av kopinummerendringer er sett inkludert typiske Chr8 gevinster og Chr17 gevinster rundt CCC biomarkør
HNF1B
genet, se også tabell 3.
transkriptomet profil klare cellelinjer
Som med andre ovarialcancer typer, tilbakevendende trans blant CCC har ikke blitt beskrevet, men bare et minimalt antall studier har blitt gjennomført [16]. Vår transkriptomet sekvense data på RMG-en, RMG-2, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, TOV21G, og ES-2 antyder tilbakevendende uttrykt rearrangements er minst sjeldne og ble ikke oppdaget blant disse cellelinjene. En moderat antall uttrykt intra- og inter-kromosomale rearrangementer kunne påvises (tabell S4), selv om alle var unike for hver respektive cellelinje; noen var synlig ved multi-farget fisk (figur 3). Begge uttrykte og ikke-uttrykt trans resulterer i genet gevinst /tap av funksjon eller promoter utveksling kan tjene til å påvirke veien aktivering, og samlet uttrykk, profiler av CCC. En systematisk analyse ble ansett utenfor rammen av denne undersøkelsen, og det er for tiden et fravær av en tilsvarende kunnskapsbase avledet fra primære tumorer CCC for sammenligning.
En rekke translokasjoner og rearrangementer kan sees i hver representativ klon. Komplekset karyotype av hvert dominerende klone er kjent under de tilsvarende 24-farge FISH resultater. Ikke alle avledede kromosomer ble identifiserbar som resulterer i et stort antall tvetydige trans og fragmenter (merket med spørsmålstegn i Karyotype notasjoner). (B) Circos tomt på RNAseq data og uskadeliggjøre analyse skildrer uttrykt genomisk rearrangements i JHOC-9 cellelinje. Trans sett i 24-farge FISH profil er også synlige som uttrykkes transkripsjoner inkludert t (8; 19) observert i både 2N og 4N dominerende kloner. Ingen tilbakevendende trans ble sett på tvers av vår serie (se også tabell S3).
Diskusjon og konklusjoner
Som vår opprinnelige målet var å identifisere bonafide CCC cellelinjer, er vi glade for å rapportere at flertallet av rapporterte CCC linjene var representative for de primære svulster «molekylære og patologisk fenotype. Vår immuno-klassifisering ordningen, COSP, spådde de fleste å være CCC og våre egne mutasjons data, samt at fra COSMIC og CCLE, foreslo tap av funksjon
ARID1A
mutasjoner var utbredt i disse cellelinjene. Selv om tre CCC linjer ikke har identifiserbare
ARID1A
mutasjoner, bare JHOC-5 celler ut til å ha både villtype sekvens og påviselig protein uttrykk. Antallet ARID1A «normale» CCC linjer er lavere enn man skulle forvente gitt frekvens av
ARID1A
mutasjoner (og negative IHC) observert i primær CCC [16], [45] og kan indikere noen fortrinnsrett utvalg for
ARID1A
null CCC linjer for å tilpasse seg
in vitro
kultur. Men gitt den lille størrelsen på utvalget det kan godt være en sjanse forekomst og synes ikke å være betydelig. Andre påviste mutasjoner (
PIK3CA
,
PTEN
,
KRAS
,
PPP2R1A
) er alle i tråd med varierende frekvenser i CCC.
TP53
mutasjoner er spesielt fraværende i alle våre validerte CCC cellelinjer, som en de-facto karakteriserer, og bare en enkelt CCC linje hadde heterozygot kopiantall tap selv om den fremdeles beholdt normal-lignende p53 IHC.
Både CCC og ENOCa synes å skrive seg fra en bakgrunn av endometriose. Atypisk endometriose tilstøtende til, eller sammenhengende med, enten histotype er ikke uvanlig at enten CCC eller ENOCa [16], [60], [61]. Samtidig forekomst (noen ganger sammenhengende) av både CCC og ENOCa histologier i en blandet celletype svulsten har blitt rapportert [62] (og Dr. Blake Gilks, personlig meddelelse). Mutasjons profiler inkludert
ARID1A Hotell og
PIK3CA
, er felles for begge typer, samlet støtte en relatert opprinnelse og lignende rute til transformasjon [16], [45], [48], [49] . Vi fant at både ES2 og OVISE cellelinjer, angivelig stammer fra CCC, i stor grad lignet Immuno-profiler av ENOCa. Omvendt 2008-cellelinjen, avledet fra velig serøs karsinom [63], men ofte referert til som ENOCa [64], først på mer CCC-lignende fra COSP alene. 2008 linjen gjorde showet mutant p53 flekker og har to bekreftet
TP53
mutasjoner, atypiske for ekte CCC. IHC var negativ for ARID1A, støtte en ikke-serøs opprinnelse. Vi favorisert et oppdrag av ENOCa basen i stor grad på
TP53
mutasjon men merk at denne cellelinjen er ganske atypisk som det kan bære tap av funksjonsendringer for ARID1A, mutasjon av
TP53
, og er positivt for CCC biomarkør HNF1B. Uten tvil feil i cellelinje histotype rapporter kan forklares bare ved historisk dårlig reproduserbarhet i celletype oppdrag, men det er ikke mulig å forutse at den biologiske relasjonen mellom CCC og ENOCa kunne påvirke disse fenotyper. Gitt den høye grad av overlapping mellom mutasjons egenskapene til CCC og ENOCa, vår panelet var ikke i stand til å ytterligere skille eller avklare denne tilsynelatende forvirring. SKOV3 er en annen unik sak som det er immun-fenotype ligner mest HGSC, men det caries en avkorting mutasjon for
ARID1A
, en mutasjon som ikke har blitt observert i HGSC tross for omfattende testing [16], [45]. Tidligere studier med SKOV3 har pekt på en klar celle-lignende histologi når dyrket som xenograft [64] og dette kan også favorisere en endometriose-assosiert eggstokkreft diagnose som gjør tilstedeværelsen av en
PIK3CA
mutasjon. Endelig TOV112D cellelinje presenterer også som et unntak med en moderat sterk prediksjon av HGSC immuno-fenotype. På tross av dette funnet foreslår vi denne linjen er representativ for
TP53
mutant ENOCa, basert på tilstedeværelsen av en ENOCa karakteristisk
CTNNB1
mutasjon, patologisk gjennomgang av primærtumor materiale i opprinnelses laboratorium og uttrykk profilering eksperimenter som støtter denne konklusjonen [65]. Vi foreslår at disse atypisk CCC /ENOCa kan være nyttig i utforskningen av noen vanlige endometriose-forbundet eggstokkreft biologi om forsiktighet bør foretas for å tillate riktig tolkning av resultatene.
Dessverre vår COSP verktøyet er i stand til å skille LGSC . Basert på ekspert ny vurdering av primærmateriale er vi klar over to cellelinjer avledet fra LGSC primære svulster. Vi har derfor trygt favorisere denne klassifiseringen for VOA1056_CL og VOA1312_CL tross spådommer om HGSC eller ENOCa hentet fra COSP. Den VOA1056_CL linjen bærer en Ras-sti mutasjon som kan forventes av en LGSC svulst, men dette er en NRAS Q61R aktivere mutasjon. Aktivering NRAS mutasjoner ble nylig beskrevet i LGSC på 2012 AACR årsmøtet [66] men dette representerer den første validert rapporten fra en
NRAS
mutant LGSC svulst og den første validert LGSC avledet cellelinje som bærer denne mutasjonen. Den COSMIC database antyder cellelinjene LK-1 (G12D, definert som ovarialcancer, Typen er ikke spesifisert) og TYK-v (G12D og Q61K, definert som eggstokkreft «serøs carcinoma») også bærer aktivere
NRAS
mutasjoner men vi klarte ikke å kilden disse cellelinjene for å bekrefte /avvise sin histologisk identitet. I de tilfeller av LGSC cellelinjer som er dyrket i huset, mutasjoner av
TP53
ikke ble observert, i samsvar med IHC basert litteratur rapporter som tyder på dette er en stor molekylær discriminator mellom HGSC og LGSC [67].
til slutt bare en enkelt celle linje i vår samling ble rapportert å være av mucinous carcinoma opprinnelse. Mutasjonen profil cellelinje er i samsvar med denne diagnosen, blant annet en 127-bp
TP53
homozygot delesjon, overekspresjon av IHC, og
KRAS
G12V mutasjon.
Cell linje poster for epitelial ovarialcancer har nylig kommet inn spørsmålet med en rekke forurenset og redundante cellelinjer anerkjent i en fersk studie [32]. Mest spesielt 2008 (aka. Ov2008) ble rapportert å være ofte forurenset med, eller en feilmerket versjon av den HPV-positive ME-180 cellelinjen (ATCC HTB-33), den «sanne» HPV-negative 2008 linje definert i rapporten fra Korch et al. [32], er den som brukes i vår studie. Opprettholde aktuelle postene, testing og, viktigst, bør re-testing identitet cellelinjer i det enkelte laboratoriets aksjer være avgjørende selv om cellelinjer oppnås direkte fra depotene. Her kan vi rapportere bare på cellelinjer som passet den opprinnelige depotet STR DNA-profil eller STR profilen til deres opprinnelse primære tumorer (i tilfelle av in-house avledede linjer). Til tross for våre egne beste innsats vår trening gjorde gi oppdagelsen av 3 cellelinjer i våre egne aksjer som enten var feilmerket eller forurenset, inkludert våre opprinnelige beholdningen av 2008 cellelinjen nevnt ovenfor. Alle forurensede linjer har siden blitt forkastet /skiftes. Det bør bemerkes at ingen av våre analyser ble konstruert eller testet for å diskriminere ovarie fra ikke-eggstokkkreftformer, og selv om STR analyse ville ha eliminert noen tydeligvis hann kreftformer (ved deteksjon av Chr Y-markører), en viss grad av nøyaktighet i depotet rapportert opprinnelse av «eggstokkreft» må antas. I tilfelle av de mer atypiske cellelinjer er det mulig disse kan være av ikke-ovarie opprinnelse, f.eks endometrial carcinoma eller andre peritoneal kreft med ukjent primær, er vi i dag ikke klarer å vurdere denne ideen. Videre kan vår analyse bli forvirret av dominerende utvidelse av sjeldne kreftunder kloner [68], oppkjøp av spontane mutasjoner under dyrking, og MMR-mangel (enten kjøpt eller tilstede i den opprinnelige primærtumor). MMR manglene har blitt rapportert å være utbredt i endometriose-forbundet eggstokkreft (CCC og ENOCa) [69] – [72] og den potensielle oppkjøpet av mutasjoner som følge av MMR-mangel kan påvirke noen av de mer tvetydige biomarkør fenotyper innenfor denne gruppen samt observert atypiske mutasjonsmønster. Vi bemerket MMR mangler i de ikke-serøs linjer TOV21G, SKOV3, A2780, og IGROV1 samt HGSC cellelinjer Colo-704 og Colo-720E (tabell S5). MMR-protein mangler ble ikke observert i våre in-house avledet LGSC cellelinjer (eller deres tilsvarende primære svulster) eller i mucinous carcinoma linjen MCAS.
I spekteret av eggstokkreft karsinom, siste bevis støtter sterkt diagnose og behandling av de fem store histotypes av karsinomer som distinkte sykdommer.
