Abstract
I denne studien, vurderte vi de globale DNA metylering endringer i menneskelig lymfoblastoid (TK6) celler
in vitro
svar på 5 direkte og 10 indirekte virkende gentoksiske stoffer. TK6 celler ble eksponert for de valgte midler i 24 timer i nærvær og /eller fravær av S9 metabolsk blanding. Væskekromatografi-massespektrometri ble brukt for kvantitativ profilering av 5-metyl-2′-deoksycytidin. Effekten av eksponering på 5-metyl-2′-deoksycytidin mellom kontroll og eksponerte kulturer ble bestemt ved å anvende den marginale modell med korrelerte rester i% global DNA-metylering av data. Vi rapporterte induksjon av global DNA hypometylering i TK6 celler som respons på S9 metabolsk mix, under dagens eksperimentelle innstillinger. Benzen, hydrokinon, styren, karbontetraklorid og trikloretylen skapt global DNA hypometylering i TK6 celler. Videre viste vi at dosen ikke har en effekt på global DNA metylering i TK6 celler. Avslutningsvis kan vi rapportere endringer i global DNA metylering som en tidlig hendelse i respons til agenter tradisjonelt ansett som gentoksisk
Citation. Tabish AM, Poels K, Hoet P, Godderis L (2012) epigenetiske faktorer i kreftrisiko: effekt av kjemiske karsinogener om Global DNA Metylering Pattern i Human TK6 Cells. PLoS ONE 7 (4): e34674. doi: 10,1371 /journal.pone.0034674
Redaktør: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, Italia
mottatt: 29 november 2011; Godkjent: 06.03.2012; Publisert: 11 april 2012
Copyright: © 2012 Tabish et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Katholieke Universiteit Leuven forskningsfond. Finansiører spilt noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Miljøkreftfremkallende er en kjent risikofaktor for kreft hos mennesker [1]. I sin klassiske modellen, karsinogenese initierer og fortsetter gjennom endringer i genomet (dvs. genetiske effekter) [2]. Dermed måling carcinogen-indusert DNA skade dvs. DNA addukter dannelse og kryssbinding, og DNA mutasjoner har vært ansatt i klassiske kreft risikovurderings tilnærminger, f.eks Ames test, kometmetoden og mikronukleus [3] – [5]. Kreftfremkallende-indusert DNA skade er en viktig tidlig hendelse under den innledende fasen av kreftutvikling, noe som reflekterer en permanent og irreversibel endring i initierte celler [6], [7]. Imidlertid initiering
per se
i en klassisk modell karsinogenese er ikke tilstrekkelig for tumorutvikling, noe som resulterer fra bredere endringer i cellulær homeostase, hovedsakelig på grunn av manglende evne av initierte celler til på riktig måte å styre og regulere genekspresjon [ ,,,0],8].
eksponering for kreftfremkallende, i tillegg til deres genetiske effekter, kan omfatte en rekke ikke-genotoksiske effekter i celler [9]. Ikke-genotoksiske effekter i celler kan spille en viktig rolle i utviklingen av kreft [10]. Bevis tyder på at ikke-gentoksiske endringer i celler, for eksempel endringer i mobilnettet epigenome, kan resultere i fremveksten av epigenetiske omprogrammeres celler [11]. Disse epigenetiske omprogrammeres cellene viser et epigenetisk profil lik den som hyppig observert i kreftceller, slik som endrede histon modifikasjon mønstre, hypometylering av DNA-repeterende elementer og proto-onkogener og hypermethylation av tumorsuppressorgener. Altered epigenetisk status confers genom ustabilitet og tap av kontrollerte vekstsignaler, som vanligvis observeres i kreftceller [12]. Epigenetiske forandringer i stedet for spesifikke genetiske mutasjoner
per se
rapporteres for klonal ekspansjon av endrede lever preneoplastiske foci og tumor utvikling [13].
Nylig har en rekke studier har rapportert at de kreftfremkallende effekter indusert av 2-acetylaminofluoren, tamoxifen, trikloretylen, aflatoksin B1, okratoksin, nikkel og krom ikke følger en klassisk kreft modell, men snarere innebære et spektrum av cellulære endringer som omfatter de epigenetikk. [8], [14] – [16]. Epigenetiske faktorer spiller en viktig rolle i kreft etiologi; Men det er for lite kunnskap i å knytte epigenetiske faktorer til miljø carcinogenesen i premaligne vev [17]. Basert på stadig dokumenterte epigenetiske forandringer i kreft etiologi, målet med denne studien er å vurdere om endringer i global DNA metylering er en tidlig cellulær hendelse i respons til gentoksiske karsinogener med en velkjent virknings (addukter bearbeiding og kryssbindingsmidler ). I denne studien brukte vi fem direkte og 10 indirect- konstituert gentoksiske karsinogener å avsløre menneskerettighets lymfoblastoide celler (TK6) i 24 timer. TK6 celler ble eksponert for kreftfremkallende på 3 doser (lav, middels og høy) i duplikater. S9 metabolsk blanding ble lagt i kulturer i halvparten av forsøkene fordi indirect- virkende karsinogener kreve S9 metabolsk mix å bli funksjonelle kreftfremkallende. Vi brukte menneskelige tymidin kinase heterozygote TK6 celler i denne studien fordi de uttrykker villtype p53, vokse raskt i suspensjon (befolkning dobling tid på 12-14 h), og blir rutinemessig brukt i genetiske toksisitetsstudier. Etter eksponering ble cellene høstet, ble DNA ekstrahert, hydrolysert, og global DNA-metylering nivåer ble kvantifisert i TK6 celler.
Materialer og metoder
Cell Kultur
TK6 cellene kjøpt fra europeiske Innsamling av cellekulturer (ECACC, Wiltshire, UK). Celler ble delt inn i 15 behandlingsgrupper og 2 kontrollgrupper (kontroll S9-, kontroll S9 +), og dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% varme-inaktivert hesteserum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 2 mM l -glutamine ved 5% CO2 og 37 ° C. Celler ble opprettholdt ved en tetthet på 10
6 celler /ml og eksponert i 24 timer til kreftfremkallende. Vi setter opp to biologiske replikater per kjemisk dose, 10 kontroll S9- replikat, og fem kontroll S9 + replikerer.
På grunn av kravet om enzymatisk biotransformasjon av procarcinogens til å bli aktive kreftfremkallende, en blanding av S9 (1% v /v) fra human lever ble tilsatt til kulturen i halvparten av forsøkene [18], [19]. Lever S9-fraksjoner ble hentet fra Celsis (Neuss, Tyskland), og inneholdt narkotika-enzymer, inkludert cytokrom P450, Flavin monooxygenases og UDP glukuronyltransferaser. Et eksogent NADPH-regenererende system (1,3 mM NADP +, 3,3 mM glukose-6-fosfat, 0,4 U /ml glukose-6-fosfat dehydrogenase, og 3,3 mM magnesiumklorid, BD Biosciences, Erembodegem, Belgia) som kreves av lever S9 for å fase I oksydasjon ble inkludert i forsøkene. Celler ble utsatt for karsinogen i duplikater med eller uten S9 metabolsk mix.
Kjemi, livskraftig Analyser og Dose Utvalg
Vi valgte kjemikalier med godt beskrevet gentoksiske egenskaper [20]. En liste over de valgte agenter, er deres klassifisering og eksponering dose gitt i tabell S1. Alle kjemikalier ble innkjøpt fra Sigma Aldrich, og oppløst og fortynnet i dimetylsulfoksid (DMSO). Levedyktighets analyser ble brukt for å velge doser per middel. Vi brukte 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) levedyktighet analyse [21], og også telles andelene av levende og døde celler ved anvendelse av en Countess ™ Automated celleteller ( Invitrogen, Carlsbad, California). Basert på levedyktighet analyser, valgte vi tre doser per kjemisk, dvs. en dose med 95% cellulær levedyktighet (høy dose), 1/10 av høy dose (middels dose) og 1/100 av høy dose (lav dose).
DNA Extraction, konsentrasjon og renhet
etter 24 timer med behandling, celler ble umiddelbart behandlet for DNA-ekstraksjon. DNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol® reagens med PureLinkTM Micro-til-Midi System® henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, California). DNA kvantitet og kvalitet ble målt ved Nanodrop Spektrofotometri og Agilent 2100 Bioanalyzer.
Enzymatisk hydrolyse av DNA
ekstrahert DNA ble hydrolysert til individuelle deoksyribonukleosider i en forenklet ett-trinns prosedyre [22]. Kort sagt, ble DNA fordøye blanding fremstilt ved tilsetning av 250 U Benzonase (Sigma Aldrich), 300 mU fosfodiesterase I (Sigma Aldrich), og 200 enheter alkalisk fosfatase (Sigma Aldrich) i 5 ml Tris-HCl buffer (pH 7,9, 20 mM) inneholdende 100 mM NaCl og 20 mM MgCl
2. 1 ug av DNA ekstrahert fra eksponerte og kontrollprøver ble hydrolysert i 100 ul av reaksjonen ved tilsetning av 50 ul fordøye blanding, og prøvene ble inkubert ved 37 ° C i 6 timer. Hydrolyserte prøver ble brakt til 1 ml ved å legge til HPLC-klasse H
2o.
kalibreringsstandarder
Kalibrerings standarder for 5’methyl- deoxycytidine ((5ME) DC) og deoxycytidine (DC ) ble kjøpt fra Sigma og oppløst i LC-MS grad vann (stamløsninger). En kalibrerings serien ble utarbeidet for 5 (Me) st og fm i en rekke 0.1-10 ppb og 10-100 ppb henholdsvis fra stamløsninger. De samme kalibreringsstandarder ble brukt i alle forsøkene.
LC-ESI-MS /MS Instrumental Analyse
Globalt DNA metylering ble oppnådd ved å kvantifisere (5ME) likestrøm og likestrøm ved hjelp av ultra-trykk væskekromatografi (UPLC) for fraksjonen separering og tandem massespektrometri (MS-MS) for kvantifisering. Analyser ble utført på Waters Acquity UPLC utstyrt med automatisk prøvetaker og Micromass Quattro MS Technologies Premier massespektrometer. En 10 fil prøve ble introdusert på en Acquity UPLC BEH C
18, 50 mm x 2,1 mm, 1,7 mikrometer kolonne, holdt ved 40 ° C. Mobil fase anvendes for kromatografisk separasjon var en blanding av 0,1% maursyre i vann (A) og 0,1% maursyre i acetonitril (B) ved bruk av den følgende gradient: 0 min: 90% A og 10% B, 2-2,5 min: 100% B, 3,9-4,0 min: 90% A og 10% B ved en strømningshastighet på 0,35 ml /min. Alle mobile fase bestanddeler var LC-MS klasse og ble kjøpt fra Biosolve (Valkenswaard, Nederland).
Først utførte vi full scan spekteret henhold electrospray ionisering (ESI) forhold. I full scan spekteret, natrium addukter 5 (Me) DC /DC [M + Na] + og 5 (Me) DC-DC dimer ble også observert, noe som er et vanlig fenomen i en ESI-MS full skanning [23]. Analyser ble utført i ESf-modus og en multippel reaksjon overvåking (MRM) metode ble anvendt med argon som kollisjonsgass ved et trykk på 2,88 10
-3 mbar. Overganger overvåkes var m /z 242,00 → 125,85 for fem (Me) likestrøm (kjegle spenning 14 V, kollisjonsenergi 10 eV) og m /z 228,10 → 112,00 for likestrøm (kjegle spenning 14 V, kollisjonsenergi 17 eV). Holdetid per overgangen var 100 ms.
Kalibreringskurve
Vi observerte lineær respons av standarder over en rekke konsentrasjoner (0,1-10 ppb og 10-100 ppb) for fem (Me) dC og dC med korrelasjonskoeffisienter på henholdsvis 0,9991 og 0,9970.
statistikker
andelen av global DNA metylering ble beregnet per kjemisk dose og uttrykkes som (5ME) dC /[(5ME) dC + dC]%. Vi brukte marginal modell for å utforske faktorer redegjort for i den observerte variasjonen i global DNA metylering i TK6 celler, dvs. kjemikalier, dose og S9. Rester ble plottet å verifisere forutsetningene for normalitet i den marginale modellen. Shapiro-Wilk test for rester ble vist å være ikke-signifikant, noe som antydet at tilnærmet en respons til en normalfordeling var hensiktsmessig. SAS 9,2 statistisk pakke ble brukt til å passe den marginale modell. Boksplott ble generert for kjemikalier med en betydelig effekt på global DNA metylering i TK6 celler ved hjelp av SPSS v.18.
Resultater
Globalt DNA metylering i kontroll og utsatte kulturer per kjemisk dose uten og med S9 metabolske blanding er gitt i tabell 1 og 2 henholdsvis. Våre resultater viser induksjon av global DNA hypometylering i respons til S9 metabolsk blanding som vist i figur 1.
Global DNA-metylering er uttrykt som en prosentandel av 5-metylcytosin i forhold til det totale antall cytosines til stede i genomet. Boksplottet beskriver median (linje tvers over boksen), inter-kvartil range og maksimums- og minimumsverdier (værhår). Slengere er vist som åpne sirkler utenfor endene av værhår.
Variasjon i global DNA metylering av kontroll og utsatte kulturer demonstrert normalfordeling (Figur S1). Forutsatt global DNA metylering å være normalfordelt, og vurderer hver kjemisk eksponering å være uavhengig, men replikering innen eksponering å være korrelert, en marginal modell, som fanger opp denne avhengigheten, ble brukt. Samvariasjon mellom modellrester, noe som tilsvarer uniform korrelasjon innenfor gjentatte prøver, ble estimert til å være 0,54. Ignorerer korrelasjonen innen replikert eksponeringer kan føre til en i nøyaktig anslag på betydningen av global DNA metylering. I våre resultater, observerte vi kjemikalier og S9 regnskap for den observerte variasjonen i global DNA metylering i TK6 celler (tabell S2). Dose ble funnet å være ikke-signifikant selv i fravær av S9 i den marginale modell. Modellen ble ombygget med unntak av dosen, og resultatene er gitt i tabell 3.
Videre viser vi at benzen og dets metabolitt hydrokinon og styren, karbontetraklorid og trikloretylen i betydelig grad påvirket den globale DNA-metylering i TK6 celler (tabell 3). Globale DNA-metylering-profiler ble observert med eksponering for disse kjemikaliene i TK6 celler uten og med S9 er vist i figur 2 og 3 henholdsvis.
Global DNA-metylering er uttrykt som prosentandel av 5-metylcytosin i forhold til det totale antall tilstedeværende cytosines i genomet. Boksplottet beskriver median (linje tvers over boksen), inter-kvartil range og maksimums- og minimumsverdier (værhår). Utliggere er vist som åpne sirkler utenfor endene av hårkrystaller.
Global DNA-metylering er uttrykt som prosentandel av 5-metylcytosin i forhold til det totale antall cytosines til stede i genomet. Boksplottet beskriver median (linje tvers over boksen), inter-kvartil range og maksimums- og minimumsverdier (værhår). Slengere er vist som åpne sirkler utenfor endene av værhår.
Diskusjoner
Den klassiske teorien om kreftutvikling er drevet av genetiske mutasjoner og kromosomavvik overdragelse genom instabilitet [24], [25 ]. Men, understreker studien viktigheten av global DNA metylering som en tidlig epigenetisk faktor som svar på gentoksisk eksponering.
Indirect- virker kreftfremkallende krever metabolsk aktivering for å bli reaktive kreftfremkallende. På grunn av den nødvendige metabolsk aktivering, en blanding av S9 leverekstrakt (1% v /v) ble tilsatt til halvparten av kulturene. S9 Blandingen inneholder enzymer som kreves for fase-I metabolsk aktivering av xenobiotics. Uttrykk av metabolske enzymer er knyttet til reaktive oksidativt stress trasé [26]. Oksidativt stress påvirker DNA-metylering ved å forandre S-adenosylmethionin (SAM) og S-adenosylhomocystein (SAH) ratio [27] – [29]. I denne studien tillegg av S9 metabolsk miks i TK6 cellekulturer resulterte i global DNA hypometylering (β = -0,9082,
p
0,0001) (tabell 3, figur 1). S9 skapt global DNA hypometylering i disse kulturene kunne mechanistically knyttet til induksjon av oksidativt stress veier. Oksidativt stress aktiverer cellulære og kjernefysiske signalveier, som har iboende histon acetyltransferase (HAT) og histondeacetylase (HADC) aktiviteter. I sin tur, blir disse proteiner bundet til DNA metyltransferaser (DNMTs) i atom veier som fører til konformasjonsendringer i histoner og kromatin struktur, og således de endre den cellulære transkripsjonsnivået [30], [31].
Et antall kjemikalier brukt i denne studien påvirket globale DNA-metylering forandringer i TK6 celler (tabell 3, figur 2 og 3). Vi observerte interessante globale DNA metylering mønstre. Benzen (β = -1,5289,
p
0,0295), og det metabolitt hydrokinon (β = -1,8029,
p
0,0108) eksponering skapt global DNA hypometylering i TK6 celler, mens styren eksponering (β = -1,7332,
p
0,0115) skapt global DNA hypometylering men metabolitten styrenoksyd eksponering ikke påvirke den globale DNA metylering i TK6 celler (β = -0,2999,
p
0,6547). Benzen eksponering har vist seg å være knyttet til reduserte metylering nivåer av DNA-repeterende elementer [32]. Benzen og hydrokinon eksponering aktiverer oksidativt stress trasé i celler som påvirker cellulær DNA metylering mønster [33]. Styren eksponering induserer DNA adduktdannelse og oksidativt stress i celler [34]. I tillegg til disse effektene, rapporterer vi induksjon av global DNA hypometylering av styren som en potensiell ikke-gentoksisk mekanisme, noe som kan gjøre rede for sin giftighet. Vi har også utsatt TK6 celler til karbontetraklorid og trikloretylen. Disse kjemikaliene hovedsakelig virker ved dannelse av reaktive mellomprodukter etter metabolsk aktivering. I denne studien ble det observert global DNA hypometylering indusert av karbontetraklorid (β = -1,3879,
p
0,0475) og trikloretylen (β = -1,5302,
p
0,0294) eksponering i TK6-celler (tabell 3, figur 2 og 3). Tidligere studier har også rapportert lignende funn om karbontetraklorid og trikloretylen (TCE) skapt global DNA hypometylering. Karbontetraklorid skapt global DNA hypometylering ble reddet av kosttilskudd med S-adenosylmethionine (SAM) i rottelever [35], [36]. Disse observasjonene antydet at karbontetraklorid indusert DNA hypometylering involvert metionin stoffskifte. I tillegg er disse kjemikaliene indusere oksidativt stress, noe som kan påvirke celle methylome.
I motsetning til andre studier, at vi ikke observere globale DNA metylering endringer i TK6 celler ved eksponering for poly-aromatiske hydrokarboner (PAH). Kronisk eksponering av benzo [a] pyren til mus embryonale fibroblaster
in vitro
skapt global DNA hypermethylation [37]. Også forskjeller i DNA-metylering nivåer har blitt rapportert i perifere blod lymfocytter av arbeidere kronisk eksponert for PAH sammenlignet med sine matchede kontroller [38]. Ulike eksperimentelle innstillingene som brukes i disse studiene i forhold til denne studien kan forklare heterogenitet observert i PAH indusert DNA metylering endringer. Videre ble det ikke observert noen globale DNA metylering endringer i TK6 celler for mitomycin C, formalin, cyklofosfamid, ethylenedibromide, epiklorhydrin og akrylamid. Globale DNA metylering endringer i respons til disse stoffene ikke rapportert andre steder. Subtile epigenetiske effekter, for eksempel histonmodifikasjonene og gen spesifikke DNA metylering, som svar på disse kjemikaliene kan ikke bli ignorert og vil bli utredet nærmere.
Globalt DNA hypometylering i TK6 celler indusert av direkte og indirect- opptrer gentoksiske karsinogener undersøkt i denne studien kunne innebære at cellene er under pre-neoplastiske tilstander. Hvis vedvarende global DNA hypometylering vedvarer, kan dette drive disse cellene til å neoplastisk fenotype. Men varighet og omfang av eksponeringen som kreves for vedvarende global DNA hypometylering å konferere neoplastisk fenotype må forstås fullt ut.
Konklusjon
I konklusjonen, rapporterer vi ikke-gentoksisk effekt, det vil si, endring i global DNA-metylering, som svar på et antall av kreftfremkallende, som er tradisjonelt anses for å virke gjennom genotoksiske mekanismer. Vi beskriver også at S9 metabolsk blanding endrer den globale DNA metylering mønster i TK6 celler. Fremtidig arbeid vil ta opp de doseavhengige effekter av S9 metabolsk mix
in vitro
og stier som er involvert i kreftfremkallende-indusert DNA metylering endringer. Våre resultater tyder på bruk av ulike cellelinjer og mer varierte metoder for å validere de ovennevnte funnene, og for å utforske de mekanistiske lenker.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Histogram og tetthet tomt på rest å vurdere normalitet. Normalitet forutsetning av respons (global DNA metylering) ble vurdert ved å plotte residualene (x-aksen). Tomten synes å indikere at denne forutsetningen er plausibel. Shapiro-Wilk test ble også utført for å bekrefte normalitet og restprodukter ble vist seg å være ikke-signifikant
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034674.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Oversikt over agenter, deres klassifisering og administrert doser brukt i behandlingen av TK6 celler.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034674.s002 plakater (docx)
Tabell S2.
Resultater av marginal modell som beskriver effekten av eksponering, dvs. kjemikalier, dose, og S9, på global DNA metylering i TK6 celler
in vitro
.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034674.s003 plakater (docx)
Takk
Vi vil gjerne takke Peter Collaerts og Karine Vranckx for deres hjelp i kjemisk eksponering TK6 cellekulturer.
