Abstract
Bakgrunn
Hvert år ca 74 000 kvinner dør av livmorkreft, hovedsakelig på grunn av residiverende eller metastatisk sykdom. Tilstedeværelsen av tumor infiltrerende lymfocytter (Tīlss) samt progesteronreseptoren (PR) positivitet har blitt korrelert med forbedret prognose. Denne studien beskriver to mekanismer som progesteron hemmer metastatisk spredning av livmorkreft: ved å stimulere T-celle infiltrasjon og ved å hemme epitel-til-mesenchymale celle overgang (EMT)
Metodikk og hovedfunnene
Parafin seksjoner fra pasienter (n = 9) eller uten (n = 9) progressiv endometrial cancer (tilbakevendende eller metastatisk sykdom) ble undersøkt for tilstedeværelse av CD4 + (hjelper), CD8 + (cytotoksiske) og foxp3 + (regulatoriske) T-lymfocytter og PR uttrykk. Progressiv sykdom ble observert å være forbundet med betydelige tap av Tīls og tap av PR uttrykk. Frosne tumorprøver, som brukes for genome-wide uttrykk analyse, viste betydelig regulering av trasé som er involvert i immunesurveillance, EMT og metastasering. For en rekke gener som CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 og WIF1, kvantitativ RT-PCR ble utført for å bekrefte opp- eller nedregulering i progressiv sykdom. For å underbygge den rollen progesteron i å regulere invasjon, Ishikawa (IK) livmorkreft cellelinjer stabilt transfektert med PRA (IKPRA), PRB (IKPRB) og PRA + PRB (IKPRAB) ble dyrket i nærvær /fravær av progesteron (MPA) og brukes for genom-wide uttrykk analyse, Boyden- og sårtilheling migrasjon analyser, og IHC for kjente EMT markører. IKPRB og IKPRAB cellelinjer viste MPA indusert hemming av migrasjon og tap av mesenchymale markør vimentin på invasiv forsiden av sårheling analysen. Videre sti analyse av betydelig MPA regulerte gener viste signifikant nedregulering av viktige veier som er involvert i EMT, immunesuppression og metastase:. Som IL6-, TGF-β og Wnt /β-catenin signal
Konklusjon
Intakt progesteron signalisering i ikke-progressiv endometrial cancer synes å være en viktig faktor for å stimulere immunosurveilance og inhibering av overgangen fra en epitelial til en mer mesenchymale, mer invasive fenotype
relasjon:. van der Horst PH, Wang Y , Vandenput jeg, Kühne LC, Ewing PC, van IJcken WFJ, et al. (2012) Progesteron hemmer epithelial-til-Mesenchymale Overgang i livmorkreft. PLoS ONE 7 (1): e30840. doi: 10,1371 /journal.pone.0030840
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 23 juni 2011; Godkjent: 22 desember 2011; Publisert: 25 januar 2012
Copyright: © 2012 van der Horst et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet av LJB og MvdZ er støttet av en bevilgning fra den nederlandske Cancer Society (EMCR 2008-4056). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hvert år, over hele verden, mer enn 287,000 kvinner utvikle livmorkreft og er den mest vanlige gynekologisk kreft i verden og den fjerde vanligste kvinnelige malignitet i utviklede land [1]. Vanligvis livmorkreft oppdages på et tidlig stadium og kirurgi er hjørnesteinen i behandling. Der hvor det er gjennomgående eller metastatisk sykdom, derimot, er situasjonen en annen. (Neo) adjuvant strålebehandling og /eller systemisk behandling i kombinasjon med kirurgi er vanligvis angitt og generelt, har progressiv sykdom en dårlig prognose regnskap for 74.000 dødsfall på verdensbasis hvert år [2], [3]. Prognostiske faktorer for residiverende eller metastatisk livmorkreft inkluderer kirurgisk FIGO stadium, grad av differensiering, histopatologiske subtype og myometriets og lymphovascular invasjonen [2], [4], [5], [6], [7].
i flere typer kreft, har tilstedeværelsen av tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss) blitt korrelert med forbedret prognose, og mye forskning har vært utført på dette emnet [8], [9], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. Begrunnelsen er at godt differensiert kreft fremkaller en betennelsesreaksjon som ligner på en akutt skade som etter sekvensiell infiltrasjon av ulike dendrittiske celle populasjoner, til slutt resulterer i T-lymfocytter infiltrasjon [16]. Infiltrasjon av Tīls som en positiv prognostisk faktor ble først beskrevet i kutant melanom, hvor tilstedeværelsen av Tīls var prediktiv for bedret overlevelse [8]. Galon et al. i 2006, viste at infiltrasjon av lymfocytter av det adaptive immunsystemet til sentrum og invasiv margin av tykktarmskreft var positivt korrelert med redusert tilbakefall og forbedret overlevelse [10]. I 2009 Kilic et al., Viste at høye nivåer av Tīlss innenfor ikke-små-celle lungekreft korrelert med redusert tilbakefall og forbedret overlevelse [12]. I eggstokkreft, ble nærværet av intratumorale T-lymfocytter også positivt korrelert med forbedret overlevelse og forsinket gjentagelse av sykdommen [15]. Videre Tīlss i eggstokkreft var også forbundet med økte nivåer av INF-γ, IL2 og chemokiner som indikerer T-celleaktivering og tiltrekning [15].
Tilstedeværelsen av Tīlss har ikke blitt grundig undersøkt i livmorkreft . I livmorkreft, infiltrasjon av cytotoksisk (CD8 +) T-lymfocytter i området av lesjonen har blitt beskrevet som en selvstendig prognostisk faktor og er positivt korrelert til sykdom fritt og total overlevelse [17], [18]. I tillegg har en høy cytotoksisk T-lymfocytt /regulatoriske T-lymfocytter (CD8 /foxp3) ratio blitt beskrevet å være korrelert til økt overlevelse i type I livmorkreft [17].
Ved siden av tilstrømningen av T -lymphocytes inn i tumorområdet, er nærværet av progesteron-reseptorer (PR) også beskrevet som en viktig ressurs i prognose og behandling for livmorkreft [19], [20], [21]. I godt differensiert endometriecancer PR uttrykk er vanligvis opprettholdt, og behandling med medroksyprogesteronacetat (MPA), av disse pasientene med godt differensiert sykdom som valgte å bevare fruktbarhet, er vanligvis vellykket [22], [23]. Tap av PR, er imidlertid en negativ faktor prognostisk og er forbundet med progressiv sykdom hvor MPA behandling er vanligvis bare temporært vellykket i 15-20% av tilfellene [24].
Nylig har vår gruppe har studert mekanisme som progesteron kan indusere differensiering under normale menstruasjonssyklusen og kan hemme godt differensiert endometrial kreft vekst. Det ble observert at progesteron behandling resulterer i induksjon av ekspresjon av to viktige inhibitorer av Wnt /β-catenin signale: DKK1 og FOXO1 [25], [26]. I livmorkreft, er aktivering av Wnt /β-catenin signale observert hos 30-40% av godt differensierte endometrioid karsinomer [27] og progesteron indusert inhibering av Wnt signalveien er antatt å være en viktig mekanisme for å redusere kreft progresjon [25] .
i denne studien vi forsøkte å undersøke hvilken rolle progesteron som en direkte hemmer av de trekkende kapasiteter for livmorkreftceller og dens rolle i T-lymfocytter forbundet hemming av progressiv sykdom.
Materialer og metoder
Pasient materialer
Primær endometrial carcinoma vev fra kvinner med (n = 9) og uten (n = 9) en kjent episode av tilbakefall eller metastaser, ble innhentet fra pasienter behandlet mellom 1997 og 2006 i Universitetssykehuset Gasthuisberg, katolske universitetet Leuven, Belgia. Fra dette punktet, er ikke-tilbakevendende sykdom omtales som ikke-progressiv sykdom og tilbakevendende /metastatisk sykdom som progressiv sykdom. Histopatologiske gradering, iscenesettelse og skrive ble bestemt i henhold til retningslinjene fra WHO og FIGO [28], [29] og alle svulster ble revidert av en patolog med erfaring i gynaecopathology (PCE). Pasienter med en endometrioid type og en FIGO stadium I endometrial carcinoma ble inkludert. Pasienter som behandles med radio- eller kjemoterapi før operasjonen, ved hjelp av hormonelle steroider eller med en andre malignitet ble ekskludert. Komplett anamnese ble innhentet fra alle pasienter og oppfølging ble revidert til dato. Prøver som ble hurtigfrosset i flytende nitrogen for RNA-isolering eller fiksert i formalin og innstøpt i parafin for immunhistokjemi (IHC). For microarray analyse, fra 4 ikke-progressive og 4 progressive pasienter, snap frosne vevsprøver ble brukt. Disse ble valgt fordi de inneholdt 80% tumorvev og god kvalitet RNA kan bli isolert fra dem. For RT-PCR, ble 6 ikke-progressive og 6 progressive snap frosne pasient vevsprøver brukt. For IHC ni ikke-progressive og 9 progressive parafin innebygd pasient vevsprøver var tilgjengelig. Tissue og klinisk datainnsamling for dagens forskning Studien ble godkjent av Medical Etisk komité Universitetssykehuset Gasthuisberg og pasienter ga skriftlig informert samtykke for vev innsamling og klinisk datainnsamling for alle forskningsformål.
Cell kultur
For alle cellelinje eksperimenter, Ishikawa endometrial cancer-cellelinjer som stabilt transfektert med PRA (IKPRA-1), PRB (IKPRB-1) eller PRA og PRB (IKPRAB-36) (som tidligere beskrevet av Smit-Koopman et al. [30]) ble dyrket og opprettholdt i vanlig dyrkningsmedium (DMEM /F12 Glutamax, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i nærvær av 5% føtalt kalveserum (Invitrogen) supplert med penicillin og streptomycin (Invitrogen). Neomycin (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) og hygromycin (Invitrogen) 1:200 ble anvendt for å opprettholde valg. For alle analyser, ble cellene dyrket i DMEM /F12 Glutamax dyrkingsmedium supplert med penicillin og streptomycin (Invitrogen) inneholdende 5% trekull strippet FCS (Invitrogen) med tilsetning av hygromycin og neomycin.
Immunhistokjemi
IHC studier for CD4 (Sanbio BV, Uden, Nederland), CD8 (Dako, Glostrup, Danmark), foxp3 (Natutech, Frankfurt am Main, Tyskland) og PRA + PRB (Progesteron Receptor Ab-8, Neomarkers, Fremont, CA, USA) ble utført på 4 mikrometer parafinsnitt på Starfrost-lysbilder (Knittel, Braunschweig, Tyskland). Før inkubering med det primære antistoff, ble objektglassene deparaffinized i xylen og rehydratiseres til 70% etanol. For CD4 + og CD8 + T-lymfocytt-farging, ble objektglass varmes i mikrobølgeovn på 850 Watt i Tris /EDTA, pH 9,0 i 15 min. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 30% H
2o
2 i PBS i 5 min. Primære antistoffer ble tilført ved henholdsvis 1:160 (CD4) og 1:200 (CD8) i Tris /HCl, pH 8,0 og inkubert ved romtemperatur i 30 min. Etter vasking med Tris /HCl pH 8,0 ble snittene inkubert i 30 min. ved romtemperatur med biotinylert sekundært antistoff (Dako, 1:400). Etter vasking med Tris /HCl, ble substratet Diaminobenzidin (Dako) som brukes for visualisering av antigen-antistoff-reaktivitet.
For foxp3, ble slides blokkert (peroksydase deaktivering) i 20 minutter ved romtemperatur (RT) i 30 % H
2o
2 i metanol og kokt (antigen gjenfinning) i en citrat-buffer pH 6,0 i 15 min. Primært antistoff ble påført på 1:25 og inkubert ved 4 ° C over natten. Etter vasking med PBS, ble objektglass inkubert i 30 min. med et sekundært kanin-anti-rotte-antistoff (DAKO, 1:150) og inkubert i 30 min. med AB-kompleks (Dako). Substratet Diaminobenzidin (Dako) ble anvendt for visualisering av antigen-antistoff-reaktivitet.
For PRA + PRB-farging, ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert i 5 minutter ved romtemperatur i en 10% H
2o
2 i metanol-løsning, og objektglassene ble varmes i mikrobølgeovn (antigen gjenfinning) i en mikrobølgeovnen ved 850 watt i 10 nM sitronsyrebuffer pH 6,0 (DAKO) i 15 min. Etter avkjøling til romtemperatur Platene ble vasket med PBS og blokkert i 30 minutter med 0,3% BSA /PBS. Primært antistoff ble påført på 1:50 og inkubert ved 4 ° C over natten. Etter vasking med PBS, ble objektglass inkubert i 30 minutter med en biotinylert sekundært geite-anti-muse-antistoff (Dako, 1:400). Etter den andre vask lysbildene ble inkubert i 30 min med AB-kompleks (Dako, 1:1:50). Substratet Diaminobenzidin (Dako) ble anvendt for visualisering av reaktivitet. Alle lysbildene ble kontra med hematoksylin i 30 s, deretter dehydrert og montert.
For vimentin flekker, en sårhelende analysen ble utført i to-brønns kammermusikk lysbilder (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , USA), i nærvær eller fravær av 1 nM medroxy-progesteron-acetat (MPA), og avsluttet etter 48 timer. Cellene ble vasket tre ganger med PBS, fiksert med 4% formaldehyd /PBS i 15 minutter og permeabilisert med 0,3% Triton100 /PBS i 5 minutter. Etter vasking ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert med 10% H
2o
2 i metanol i 5 minutter. Platene ble vasket og deretter blokkert i 30 minutter med 0,3% BSA /PBS. Den anti-vimentin-antistoff (Invitrogen) ble påført på 01:50, og snittene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, ble objektglass inkubert med et GFP-fluorescerende geit-anti-muse-sekundært antistoff (Invitrogen) ved 1:500. Etter vasking ble platene inkubert i 5 minutter med DAPI Nucleic Acid fargeløsning (Invitrogen) for nukleær farging. Etter opphør av reaksjonen med dH
2o, lysbildene ble montert og fluoriserende bildene ble tatt med Axioplan to Imaging Fluorescent Microscope (Carl Zeiss AG, Jena, Tyskland).
Telle Tīlss
Etter farging ble lysbildene skannet med NDP lysbilde skanner (Hamamatsu, Hamamatsu by, Japan) og CD4, CD8 og foxp3 positiv tumor infiltrerer lymfocytter (Tīlss) ble talt opp ved hjelp av Image J programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD , USA). Antallet Tīlss ble bestemt på innsiden av tumor (intratumoral), ved svulsten kanten (Tumor kant) og ved endometrial /myometrial grensen (EM). Den komplette svulst kanten og livmor /myometriets grensen ble evaluert for tilstedeværelse av Tīlss. Den intratumoral tellingen ble utført ved å telle Tīlss i 10 forskjellige tilfeldig plukket områder (1170 mikrometer × 932 mikrometer) valgt av en uavhengig etterforsker, og dermed utrydde observatør bias.
WST1 analysen
For WST1 proliferasjonsanalyse, IKPRA-1, IKPRB-1 og IKPRAB-36 cellelinjer ble dyrket i fravær eller nærvær av MPA i en 96-brønners plate (Corning Costar, Cambridge, MA, USA). Ved tid 0 ble cellene inkubert med celleformering reagens WST1 (Roche, Basel, Sveits) i 3 timer ved 37 ° C, og absorbansen ble målt med mikroplateleser (BIORAD, modell 550, Hercules, CA, USA). Etter at utgangsmålinger cellelinjene ble dyrket i nærvær og fravær av 1 nM MPA i 96 timer og etter 96 timer ble det WST1 analysen ble gjentatt.
migrering assays
For det sårhelende analyse, IKPRA-1, IKPRB-1 og IKPRAB-36 cellelinjer ble dyrket i en 6-brønners plate (Corning Costar). Etter å indusere såret, ble celler inkubert med 1 nM MPA i 96 timer. Sårheling ble verifisert hver 24 timer ved fotografering, og analysert ved å måle lukking av såret.
For den modifiserte Boydon analysen ble cellene sådd ut i den øvre brønn i en modifisert Boydon kammer (Transwell, 8 um porer, 24 mm innsatser, 6 brønners plate, Corning Costar) ved 2,5 x 10
5 celler per brønn i nærvær eller fravær av 1 nM MPA. Dessuten som en kontroll, ble cellene dyrket i et Boyden kammer i nærvær eller fravær av 1 nM MPA i kombinasjon med 100 nM av anti-progestagin Org31489 (Organon, Oss, Nederland). Etter 96 timer, celler som hadde migrert gjennom filteret inn i den nedre brønnen eller til bunnen av innsatsen ble trypsinert og tellet under mikroskop.
Western blotting
IKPRA-1, IKPRB- 1, IKPRAB-36 og IKLV-8-cellelinjer ble dyrket i fravær eller nærvær av 1 nM MPA i 96 timer, og deretter lysert ved 0 ° C i Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) i 5 minutter . Deretter ble cellene skrapet, sentrifugert ved 14.000 rpm i 10 minutter og supernatanten ble fjernet. Proteinkonsentrasjonen ble beregnet ved anvendelse av Protein Assay Kit (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) og for hver prøve 4,5 ug protein i 30 ul lysisbuffer + BSA ble applisert på en 10% SDS-PAGE-gel. Western blotting ble utført i henhold til standardprosedyrer. Trekkpapiret ble blokkert i 30 minutter ved romtemperatur med blokkeringsbuffer (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, USA) og deretter inkubert over natten ved 4 ° C ved anvendelse av kanin-polyklonale anti-hFOXO1 antistoff (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) i blokkeringsbuffer (LI-COR Bioteknologi). Deretter ble blotting membranen inkubert med det sekundære geit-anti-kanin-IgG (IRDye 800CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology) i 30 minutter ved romtemperatur og vasket. Som et lastekontroll, ble membranen inkubert i 30 minutter med det monoklonale anti-β-aktin (1:1000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), vasket med PBS og inkubert i 30 minutter med den sekundære goat- anti-mus IgG (IRDye 680CW, 1:5000, LI-COR Bioteknologi). De spesifikke proteinbånd ble påvist ved hjelp av Odyssey Scanning System (LI-COR bioteknologi).
RNA-isolering, analyser genekspresjon og kvantitativ real-time RT-PCR
Pasient vevsprøver ble seksjonert (5 mikrometer, cryostat) og hver 10
th delen var HE farget og revidert av patologen (PCE) å vurdere tumor belastning. Kun deler som inneholder 80% tumor ble lysert i Trizol (Invitrogen) og lydbehandling i 1 min. PRA og PRB uttrykk Ishikawa cellelinje (IKPRAB-36) ble dyrket i 48 timer i fravær eller nærvær av 1 nM MPA (n = 3), plassert på is og lysert i Trizol (Invitrogen).
faseseparasjon ble utført med 0,2 ml kloroform og sentrifugering i 15 min. Supernatanten ble overført, og isopropanol ble tilsatt for RNA-utfelling. Det utfelte RNA ble vasket med 75% etanol. All RNA ble renset med RNeasy Minelute opprydding kit (Qiagen, Venlo, Nederland). Mengde og kvalitet av RNA ble vurdert ved hjelp av Nanodrop (Nanodrop, Wilmington, DE, USA) og Bio-analysator (Aligent, Santa Clara, CA, USA).
RNA isolert fra pasienten og cellelinje materiale ble merket i henhold til Affymetrix merking protokoller og merket RNA ble brukt til genom-wide uttrykk arrays (Affymetrix U133plus2 GeneChips inneholder 54,614 probe sett, som representerer ca 47.000 transkripsjoner (Affymetrix, Santa Clara, cA, USA)). Ved hjelp av RMA (Robust Multi-matrise analyse [31]), normalisering av rådata ble utført for å kunne produsere genet lister og til slutt beregne betydelig regulerte gener som bruker SAM (Stanford University, Stanford, CA, USA [32]). Lister over SAM regulerte gener (1,25 fold eller mer, delta-verdier som ligner p 0,05) ble lagt i Ingenuity pathway hjelpe programvare for å vurdere involvering av ulike biologiske baner (oppfinnsomhet, Redwood City, CA, USA). For pasienten materialer rå lister over regulerte gener (1,25 fold eller mer) ble lagt i Oppfinnsomhet
All microarray data er MIAME kompatibel og rådata er blitt deponert i MIAME kompatibel GEO database under serien. GSE29437 (bestående av GSE29435: cellelinje data, og GSE29436: pasientdata)
Gener for kvantitativ real-time RT-PCR ble identifisert ved microarray analyse og sti analyse.. RNA ble transkribert til cDNA ved bruk av den Affymetrix en syklus cDNA syntese kit (Affymetrix). For identifiserte gener, ble primere bestilt og testet (en liste over primere er inkludert i tabell S1). Husholdningsgenet β-aktin ble benyttet som en referanse genet. RT-PCR ble utført og analysert ved hjelp av CFX RT-PCR system (Bio-Rad, Veenendaal, Nederland).
statistikker
For de statistiske analyser av CD4 +, CD8 + og foxp3 + celle teller, endret Boyden kammer analysedata, WST1 analysedata og RT-PCR data, SPSS 15.0 ble brukt (IBM, Armonk, NY, USA). For normale distribuerte data en t-test og for skjeve data ble utført en Mann-Whitney U-test for å vurdere P-verdier. En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. For å beregne p-verdien av regulerte veier, Oppfinnsomhet pathway hjelpe programvaren bruker en Fishers eksakte test.
Resultater
pasientkarakteristika (tabell 1)
Pasienter med (n = 9) og uten (n = 9) progressiv endometrial cancer ble inkludert. Alle inkluderte pasienter gjennomgikk primær total abdominal- eller laparoskopisk assistert vaginal hysterektomi og bilateral salpingo-ooforektomi kombinert med lymfeknute fjerning. Ingen av kvinnene fikk kjemoterapi og bare én kvinne i progressiv sykdom gruppen fikk strålebehandling etter operasjonen. Histopatologiske undergrupper var endometrioid (n = 17) og blandet endometrioid /mucinoid (n = 1). Tumor karakterer var ett (n = 7), 2 (n = 4) og 3 (n = 7) og Figo trinn var Ia (n = 11) og Ib (n = 7). I progressiv sykdom gruppen alle 9 pasienter hadde en eller flere episoder av lokalt residiv og 4 pasienter utviklet en eller flere fjernmetastaser. Tilbakefall var vaginal, bekken eller (retro) peritoneal, og metastaser i lungene var (n = 3), lever (n = 1), milt (n = 1) og hjerne (n = 1). Klinisk oppfølging oppdatert var tilgjengelig for alle pasienter. I den ikke-progressive gruppe 8 pasienter er nå fri for sykdom og en pasient døde i oppfølging. I progressiv sykdom gruppe 3 pasienter er fri for sykdom og 6 pasienter døde av sin livmorkreft relatert sykdom. Pasient egenskaper er beskrevet i Tabell 1.
Progesteron reseptor status og deteksjon av CD4 + T-hjelper, CD8 + cytotoksiske T-celler og foxp3 + regulatoriske T-celler i ikke-progressiv og progressiv sykdom
tilstedeværelsen av tumor infiltrerende lymfocytter er blitt korrelert til forlenget overlevelse i livmorkreft [17], [18]. Videre er tapet av progesteronreseptoren (PR) ekspresjon i endometrial kreft har blitt funnet å være en risikofaktor for progressiv sykdom [33]. For å underbygge forholdet mellom intakt PR signalering og tilstedeværelsen av infiltrerende lymfocytter i ikke-progressiv sykdom, immunhistokjemisk farging og, når det er hensiktsmessig, kvantitative målinger ble utført.
Som eksemplifisert i fig. 1A, i progressiv sykdom immunhistokjemisk farging for CD4 +, CD8 + og foxp3 + T-lymfocytter synes redusert i forhold til farging i ikke-progressiv sykdom. Kvantifisering av antall CD4 +, CD8 + og foxp3 + T-lymfocytter i progressiv sykdom faktisk bekreftet et lavere antall positive celler som ligger på (Fig. 1B, EM) endometrial-myometrial grensen, ved kanten av tumoren (fig. 1B, tumor kant), og inne i svulsten (fig. 1B, intratumoral). Enten de reduserte celletall var signifikant forskjellig mellom de ikke-progressive og progressive endometriekreft vev er angitt i figur (figur 1B.)
A:. Oversikt over immunhistokjemisk farging for CD4, CD8 og foxp3 i primærlivmor kreft prøver i ikke-progressiv sykdom (n = 9) sammenlignet med progressiv sykdom (n = 9) (forstørrelse 0,4x, innleggs 10x). Non-progressiv sykdom viser uttalt flekker, mens progressiv sykdom viser redusert flekker. Skalaen-linjen representerer 10 mm. B: Kvantifisering av CD4, CD8 og foxp3 celletall på tumorkanten (Tumor kant), i tumoren (intratumoral) og på den endometrial-myometrial grensen (EM kant). * Viser en p-verdi 0,05 (Mann-Whitney U-test). C og D: Representative ikke-progressiv (C) og (D) progressive pasientens vev ble farget for CD4, CD8 og PRA + PRB og viser en positiv korrelasjon mellom tilstedeværelsen av Tīls og ekspresjon av PR. Forstørrelse er 5x og skala-bar representerer 1 mm. Pasienter 6 og 11 var begge med i microarray analyser. Videre pasient 11 bare hadde tilbakevendende sykdom, mens pasienten 12 hadde tilbakevendende og metastatisk sykdom.
Videre gjennomgår påfølgende seksjoner i ikke-progressiv sykdom for ekspresjon av progesteron-reseptorer (PR) viste at nærværet av CD4 + og CD8 + T-lymfocytter ble positivt korrelert med tilstedeværelse av PR farging (fig. 1C og 1D).
Genome-wide uttrykk analyser av primær endometrial carcinoma vev
for å undersøke om sammenhengen mellom PR signalering og tilstedeværelsen av tumor infiltrere lymfocytter kan indikere en utløsende forhold, et genom-wide mRNA uttrykk analyse på snap-frosne primære livmorkreft prøver fra 4 pasienter uten og 4 pasienter med progressiv sykdom ble utført. På det enkelte gennivå ble det observert at en markert rekke kjemokiner og cytokiner ble differensielt regulert mellom ikke-progressiv og progressiv sykdom (tabell S2). For eksempel, chemokiner CCL21 (-1.5x), CXCL9 (-2.9x), CXCL10 (-2.1x) og CXCL14 (tre datasett stede: -33.0x; -20.5x, -6.4x, henholdsvis) var alle ned regulert i progressiv sykdom mens cytokinene IL8 (2.0x, 5.7x, 9.5x) og IL32 (1,9x) var oppregulert i progressiv sykdom (tabell S2). Videre har tidligere arbeid fra vår gruppe indikerte aktivering av Wnt /β catenin signal i progressiv sykdom [25] og i overensstemmelse med dette en rekke Wnt /β-catenin inhibitory- og målgener ble borte fra progressiv sykdom (DKK1, DKK4 og WIF1) (tabell S2).
er interessant at en rekke av de ovennevnte gener som ble nedregulert i progressiv sykdom, er blitt beskrevet i litteraturen for å være oppregulert ved progesteron (CXCL14 [34], DKK1 [25], MMP7 [35] og SFRP4 [36]). Dette er i samsvar med funn at PR uttrykk (på protein og mRNA uttrykk nivå (Fig. 1C og 1D og Tabell S2) blir nedregulert i progressiv sykdom.
Etter å ha gjennom pathways regulert mellom ikke-progressiv og progressiv sykdom, regulering av en rekke veier som er involvert i kreftutvikling og invasiv sykdom og er involvert i immunosurveillance ble funnet å være betydelig regulert: Intesigna, molekylære mekanismer for kreft, Antigen presentasjon Pathway, ikke-småcellet lungekreft Signa, IGF-1 signalering, rollen til Tissue Factor in Cancer, Leukocytt Ekstravasasjon Signa, ERK /MAPK Signa, tykktarmskreft metastaseSigna (som inkluderer Wnt /β catenin signal), FGF signale, FAK Signa, etc (den fullstendige listen over regulerte veier og deres påfølgende p-verdier kan nås fra tabell S3).
for en rekke gener (CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 og WIF1) en kvantitativ real-time RT-PCR ble utført for å verifisere regulering (fig. 2).
CXCL14, ble DKK1, DKK4, WIF1 og PEG10 valgt fra mikromatrise resultater og bekreftet med real time RT-PCR. Betydning ble beregnet ved hjelp av en Mann-Whitney U-test. En p-verdi på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Effekt av progesteron på migrasjon av Ishikawa livmorkreft cellelinjer
For ytterligere å underbygge en mulig rolle for progesteron ved regulering av invasjon, Ishikawa endometrial carcinoma-cellelinjer som stabilt transfektert med PRA, PRB, eller PRA og PRB [30] ble dyrket i nærvær eller fravær av MPA i varierende tidsperioder og brukt i to forskjellige forsøk som måler cellemigrering. For å verifisere celleproliferasjonen i de forskjellige forsøk en WST1 proliferasjon test ble utført som viste at innenfor den indikerte tidsrammen ingen signifikante forskjeller i proliferasjon kunne påvises mellom celler inkubert med eller uten MPA.
I figur 3 er forskjellig Ishikawa celle linjer ble underkastet en sårhelende assay i nærvær eller fravær av MPA (1 nM) i opp til 96 timer. Det ble observert at i de stabilt uttrykker PRB (IKPRB-1) og PRA + PRB uttrykker (IKPRAB-36) Ishikawa cellelinjer, MPA hemmet lukking av manuelt påført sår (Fig. 3A-D). Videre, når vi farget kanten av såret for mesenchymale markør vimentin, ble det observert at i nærvær av MPA vimentin ekspresjon ble tydelig redusert (fig. 3E). Ved siden av dette detalj på uttrykk for vimentin, ble den samlede vimentin nivåer redusert i IKPRB-en og IKPRAB-36 cellelinjer inkubert med 1 nM MPA. Det ble også observert at i stabilt uttrykker PRA (IKPRA-1) Ishikawa cellelinje, hverken sårheling eller vimentin-ekspresjon ble påvirket av MPA (Fig. 3A og 3E).
IKPRA-1 (A), IKPRB-1 (B) og IKPRAB-36 (C) celler ble dyrket i fravær (hvite kuler) eller nærvær (sorte kuler) av 1 nM MPA og anvendt for en sårhelende analyse (n = 3) og lukking av sår ble målt som en prosent av total lukking (100% betyr at såret er åpen, 0% betyr at såret er lukket). D viser representative bilder av fremgangsmåten sårhelende med rødt såret. E viser IF for atomkjerner (DAPI) og vimentin uttrykk på invasiv foran manuelt påført sår. I denne figur, ble såret alltid ligger på høyre side.
i figur 4, ble en annen metode anvendt for å studere den vandrende kapasitet av forskjellige Ishikawa cellelinjer i nærvær eller fravær av progesteron. Det ble observert at for IKPRB-1, så vel som IKPRAB-36 celler, migrasjon i et modifisert Boyden kammer ble hemmet i nærvær av progesteron. Videre, for det IKPRA-1-cellelinjen ble ikke observert.
IKPRA-1, IKPRB-1 og IKPRAB-36 celler ble dyrket i fravær (sorte prikker en slik differensial regulering av migrasjon under påvirkning av MPA ) eller nærvær (hvite prikker) av 1 nM MPA i et modifisert Boyden kammer. Etter 96 timer ble celler som hadde migrert gjennom porene i den øvre vel telles. Figuren viser tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. * Viser en p-verdi på 0,05 (Mann-Whitney U-test)
Genome-wide uttrykk analyse av Ishikawa livmorkreft cellelinje
For ytterligere dokument progesterone-. induserte hemming av cellulær migrasjon og for å undersøke involveringen av progesteron signalisering i T-lymfocytt-infiltrering, IKPRAB-36 celler ble dyrket i 48 timer i nærvær eller fravær av 1 nM MPA og anvendt for genom-wide uttrykk analyse. Det ble observert at 1616 gener ble i betydelig grad regulert av progesteron i den IKPRAB-36-cellelinje (1029 oppregulert, 587 nedregulert, tabell S4).
Ved hjelp av oppfinnsomhet pathway analyse av betydelig regulerte gener, de følgende
