Abstract
Vi rapporterer her utviklingen, funksjonell og molekylær karakterisering av en isogen, sammen blærekreft cellekulturmodellsystem for å studere platina medikamentresistens. Den 5637 human blærekreft cellelinje ble dyrket over ti måneder med trinnvise økninger i konsentrasjon av oksaliplatin å generere en resistent 5637R sub cellelinje. MTT-analysen ble anvendt for å måle cytotoksisitet av flere blærekreftlegemidler. Væskescintillasjonstelling tillates kvantifisering av cellulært medikamentopptak og utstrømning av radiomerket oksaliplatin og karboplatin. Virkningen av intracellulær medikament inaktivering ble bestemt ved kjemisk modulering av glutathione nivåer. Oksaliplatin og karboplatin-DNA adduktdannelse og reparasjon ble målt ved anvendelse av akselerator massespektrometri. Ende motstandsfaktorer inkludert apoptose, vekstfaktor signalisering og andre ble vurdert med RNAseq av begge cellelinjer, og med bekreftelse av utvalgte transkripter ved RT-PCR. Oksaliplatin, karboplatin, cisplatin og gemcitabin var betydelig mindre cytotoksisk til 5637R-celler sammenlignet med 5637 celler. I motsetning til dette, doksorubicin, metotreksat og vinblastin hadde ingen cellelinje avhengig forskjell i cytotoksisitet. Ved eksponering for terapeutisk relevante doser av oksaliplatin, 5637R cellene hadde lavere legemiddel DNA adduktpartiklene nivåer enn 5637 celler. Denne forskjellen ble delvis utgjorde av pre-DNA-skade mekanismer som for eksempel medikamentopptak og intracellulær inaktivering av glutation, så vel som raskere oksaliplatin-DNA-addukt reparasjon. I motsetning til dette, begge cellelinjene hadde ingen signifikante forskjeller i karboplatin celleopptak, efflux og medikament-DNA adduktdannelse og reparasjon, noe som tyder på distinkte resistensmekanismer for disse to nært beslektede stoffer. De funksjonelle studiene ble forsterket av RNAseq analyse, som viser en signifikant endring i uttrykket av 83 transkripsjoner, inkludert 50 kjente gener og 22 nye transkripsjoner. De fleste av transkripsjoner var ikke tidligere forbundet med blærekreft chemoresistance. Dette modellsystem og tilhørende fenotypiske og genotypisk data har potensial til å identifisere noen nye detaljer av resistensmekanismer av klinisk betydning for blærekreft
relasjon:. Wang S, Zhang H, Scharadin TM, Zimmermann M, Hu B Pan AW, et al. (2016) Molekylær Disseksjon av indusert Platinum Resistance gjennom Funksjonell og analyse av genuttrykk i en cellekultur modell av blærekreft. PLoS ONE 11 (1): e0146256. doi: 10,1371 /journal.pone.0146256
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 08.07.2015; Godkjent: 15 desember 2015; Publisert: 22 januar 2016
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Eventuelle RNA Seq data ikke presentert i avisen er tilgjengelig elektronisk på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SRA. RNA Seq data har blitt tildelt tiltredelse ID-numre SRR1820076 og SRR1820077 for 5637 foreldrelinjen; . Og SRR1820079 og SRR1820080 for 5637R linjen (som representerer to uavhengige eksperimenter for hver cellelinje)
Finansiering: AMS Prøvene ble analysert ved Lawrence Livermore National Laboratory i regi av DOE kontrakten DE-AC52-07NA27344 og støttet ved NIH /NCRR ressurs for Biomedical Accelerator massespektrometri P41 RR013461 og DOE LDRD gi 08-LW-100 (PTH og KT), og av American Cancer Society Institutional stipend (CXP). Denne studien ble også støttet av VA Career Development Award-2 (CXP), en NCI Cancer Center Support Grant (RDW) en Cancer Clinical Investigator teamet Leadership Award (CXP), og NIH utmerkelser HHSN261201200048C, HHSN261201200084C, R01CA155642 (PTH) og T32 CA108459-08 (TS). Forfatterne ønsker å takke for den Susan og Gerry Knapp Family Fund. Dette arbeidet ble utført, delvis, i regi av det amerikanske Department of Energy ved Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344. Arbeidet rapportert her representerer ikke synspunktene eller meninger av Department of Veterans Affairs eller myndighetene i USA
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser : Chong-Xian Pan, Paul Henderson og George Cimino er aksjonærer i Accelerated Medical Diagnostics Incorporated, som har som mål å kommersialisere bruken av narkotika-DNA addukter som biomarkører av cellegift motstand
Innledning
. platinabaserte legemidler er blant de hyppigst foreskrevne legemidler mot kreft, inkludert cisplatin, karboplatin og oksaliplatin. Cisplatin har vært brukt til å behandle et bredt spekter av ondartede sykdommer, slik som testikkel, lunge, ovarie, blære, hode og hals karsinomer og andre. For alle platinabaserte midler, er egenverdi eller ervervet narkotika motstand den viktigste årsaken til behandlingssvikt (figur 1A).
(A) De viktigste veier av platina (Pt) legemiddelindusert celledød. Etter administrasjon, cellulært opptak og dyseutstrømningen bestemmer den intracellulære akkumuleringen av Pt midler som kan aktiveres av de intracellulære tiol-inneholdende molekyler. Til slutt, Pt agenter indusere DNA-skade, herunder narkotika-DNA-addukter, som utløser cellesyklus arrest og DNA reparasjon. DNA adduktdannelse og reparasjon bestemmer skjebnen til cellene, selv om andre faktorer også spille en viktig rolle, slik som pro- og anti-apoptotiske proteiner. (B) Diagram som viser dannelsen av carboplatin- og oksaliplatin-DNA-addukter og posisjonene til de radiocarbon etikettene på hvert legemiddel som brukes for dette studiet for å muliggjøre kvantifisering av medikament-DNA adduktdannelse og reparasjon av akselerator massespektrometri.
kreft virkningen av platinabaserte legemidler er best kjent for cisplatin, som trer celler av både passiv diffusjon og aktiv transport. For eksempel, er en kobber transportør (CTR1) kjent for å bidra til cisplatin tilstrømning og modulerer medikamentsensitivitet in vitro [1, 2]. To kobber-effluks-transporterende P-type adenosin trifosfater (ATP7A og ATP7B) også medierer intracellulære nivåer cisplatin [3]. Andre aktive transportører omfatter den humane organisk kation transporter (hOCT) og det humane multimedikament og toksin ekstrudering (hMATE), som er funnet bare i visse typer av humane celler, i overensstemmelse med den observasjon at forskjellige vev kan variere i deres platina akkumulering [4] .
Når cisplatin er inne i cellen, glutation (GSH) og andre tiol fungere som reduksjonsmidler for å slukke platina toksisitet. Det er høy korrelasjon mellom intracellulære GSH nivåer og motstand mot cisplatin
in vitro product: [5-7]. Metallothionein proteiner er en familie av sulfhydryl rike proteiner som deltar i heavy metal binding og avgiftning og er økt i noen cisplatin motstandsdyktig blæren svulster [8]. Endringer av GSH-nivåer og gener som er involvert i GSH-syntese, så vel som metalloproteiner, er også blitt rapportert for oksaliplatin resistent cancercellelinjer [9, 10].
Cisplatin og dens aquated eller hydroksylerte metabolitter virke som bifunksjonelle alkyleringsmidler for DNA [11]. De resulterende medikament-DNA-addukter blokkere replikasjon og celledelingen, og aktiverer apoptose [2]. Andre arter, som for eksempel cisplatin-DNA-protein-tverrbindinger, er også sannsynlig å bidra til cisplatin toksisitet [12, 13].
cellulær respons overfor karboplatin (se struktur i figur 1B) er antatt å være meget lik cisplatin eksponering siden begge legemidlene danne identiske tverrbindings medikament-DNA-strukturer, bortsett fra at karboplatin reagerer med DNA saktere enn cisplatin [14]. Klinisk, cisplatin og karboplatin har lignende, men ikke identiske effekt, sannsynligvis på grunn av forskjeller i biokjemi og doseringsregimer.
oksaliplatin (figur 1B) virker på samme måte som cisplatin ved å utøve sin toksisitet via medikament-DNA adduktdannelse [15 -17]. Siden oksaliplatin-DNA-addukter har ulike kjemiske og biologiske egenskaper fra cisplatin-DNA-addukter, det viser ikke fullstendig kryssresistens med cisplatin og er mer effektiv i, for eksempel, å hemme DNA-syntese [18-20]. Også forskjeller mellom cisplatin og oksaliplatin er blitt beskrevet for intracellulære kaskader som induseres av legemiddel-DNA-skade knyttet til apoptose og cellesyklus-stans [21].
Nesten alle platinabasert medikament-DNA-addukter er substrater for nukleotid eksisjon reparasjon (NER) [2]. Økt DNA reparasjonspriser er dokumentert å korrelere med resistens mot platina narkotika [5, 22-25]. Platinum-DNA addukter er også substrater for DNA mismatch repair system (MMR). MMR proteiner har en mye høyere affinitet for cisplatin- enn for oksaliplatin-DNA-addukter [26, 27]. Det har blitt rapportert at en defekt MMR-aktivitet resulterer i en øket motstand på cellelinjer for cisplatin, men ikke for å oksaliplatin [19], noe som kan forklare den relative effekten av oksaliplatin i kolorektal kreft som ofte er defekte i MMR [28, 29] .
molekylær pathway analyse har vært svært vellykket i laboratorieforsøk for å belyse platinabaserte legemiddelresistensmekanismer. Men de resulterende molekylære signaturen til medikamentresistens er sjelden anvendes på klinikken. En viktig årsak til den enorme gapet mellom laboratorieforskning og klinisk anvendelse er svært komplekse natur av resistensmekanismer mot cytostatika. På cellenivå, er over 700 gener som er involvert i cellulær respons overfor platinabasert behandling [30].
Denne kompleksiteten motivert oss til å generere en nesten isogene blærecancercellelinje i den hensikt å forlenge den mekanistiske analyse av platina motstand mot blærekreft, hvor platinabasert behandling er første linje i fase II og høyere sykdom [31, 32]. Vi presenterer i dette papiret en fenotypisk og genotypisk analyse av en foreldreblærecancercellelinje 5637 og en datter cellelinje som ble gjort resistent mot platinabaserte medikamenter ved å utsettes for økende konsentrasjoner av oksaliplatin over flere måneder. Vi antok at dette paret av cellelinjer ville oppvise forskjeller i platina medikament akkumulering, intracellulær inaktivering og medikament-DNA formasjon og reparere samsvar med deres følsomhet for hvert medikament, og at genekspresjon analyse av disse nesten isogene cellelinjer vil resultere i rimelig antall testbare hypoteser som kan være spesifikke for blærekreft. Cellelinjene ble testet for følsomhet for flere kjemoterapeutiske midler som vanligvis anvendes i behandlingen av blærekreft. Cellelinjene ble også vurdert i nærmere detalj med hensyn til mekaniske forskjeller i respons på [
14C] oksaliplatin og [
14C] karboplatin. Den
14C tracer aktivert bestemmelse av medikamentopptak og utstrømming av væske-scintillasjonstelling (LSC) og medikament-DNA adduktdannelse og reparasjon av akselerator massespektrometri (AMS). De cellelinjer ble også analysert for RNA-transkript uttrykk endringer ved RNAseq, noe som førte til identifisering av flere kjente og noen nye transkripter med hensyn til platinabasert medikamentresistens. Bidraget av genene representert ved disse transkripsjonene til chemoresistance er i stor grad ukjent. Opplysning av disse mekanistiske detaljer i det videre arbeidet kan til slutt hjelpe design personlig terapi for å overvinne chemoresistance og lede utviklingen av nye terapeutiske midler mot blærekreft.
Materialer og metoder
Drugs
oxaliplatin (5 mg /ml) ble kjøpt fra Sanofi-Aventis (Bridgewater, NJ, USA) og
14C-merket oxaliplatin ([
14C] oksaliplatin) (spesifikk aktivitet på 58 mCi /mmol) og [
14C] carboplatin (54 mCi /mmol) ble kjøpt fra Moravek Biochemicals. Blandinger av radioaktivt-merkede og ikke-merkede oksaliplatin eller karboplatin (USP Pharmaceutical Grade) ble anvendt for å minimalisere bruken av radioaktivt, og oppnå de forskjellige spesifikke aktiviteter som kreves for denne studien. Medikamentløsninger ble fremstilt umiddelbart før bruk. Andre legemidler ble hentet fra UC Davis Cancer Center Pharmacy (USP Pharmaceutical Grade).
Cellelinjer
Menneskelige blærekreftcellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA ) og dyrket med den anbefalte medium med mindre annet er spesifisert. Å utvikle Pt-resistente sub-cellelinjer, ble 5637 (HTB-9) celler dyrkes rundt IC
50 konsentrasjoner av oksaliplatin periodisk med trinnvis økning av konsentrasjon av oksaliplatin. Oksaliplatin Konsentrasjonene som ble anvendt varierte fra 1,5 uM til 15 uM, som er fysiologisk relevante vurderer maksimale plasmakonsentrasjon hos mennesker er omtrent 10 uM [33]. Etter 10 måneder dyrkning ble det motstandsdyktig sub-cellelinje 5637R utviklet. For å bekrefte at 5637R stammer fra foreldre 5637 cellelinje, ble prøver av begge kulturene sendes til ATCC cellelinje Authentication Service for celle bekreftelse per ATCC protokollen. Spesielt femten kort tandem repeat (STR) loci pluss kjønn bestemme locus, amelogenin, ble forsterket ved bruk av kommersielt tilgjengelige PowerPlex
® 16HS Kit fra Promega. Cellelinjen prøven ble behandlet ved hjelp av ABI Prism
® 3130 xl Genetic Analyzer. Data ble analysert ved hjelp GeneMapper ID v 3.2 programvare (Applied Biosystems). Passende positive og negative kontroller ble brukt i hele testprosedyren.
MTT-analyse for å fastslå IC
50
IC
50 verdier ble bestemt etter inkubasjon celler i 72 timer med ulik konsentrasjonene av kjemoterapeutiske midler som vanligvis brukes i behandling av blærekreft, som tidligere beskrevet [34].
oksaliplatin og karboplatin eksponering og AMS analyse
Cellene ble sådd ut i 60 mm skåler i en tetthet på 1 x 10
6 celler /skål og fikk feste seg over natten i en 37 ° C fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. På timers 0 ble cellene dosert og inkubert med 10 mm oksaliplatin supplert med 5000 DPM /ml [
14C] oksaliplatin eller 100 mikrometer carboplatin, supplert med 50 000 dpm /ml [
14C] carboplatin. Den 24-timers inkubasjon ble anvendt for å etterligne
in vivo
oksaliplatin halveringstid (16,8 timer) hos pasienter [35, 36]. Cellene ble deretter vasket to ganger med fosfat-bufret oppløsning (PBS) og holdt deretter med medikamentfritt kulturmedier. DNA ble høstet på tidspunkter i løpet av 24-48 timer, som angitt, og renses med et Promega Wizard DNA rensing kit. Ti mikrogram av DNA per prøve ble omdannet til grafitt og målt ved AMS for
14C kvantifisering som tidligere beskrevet [37]. Tredoble sett med AMS eksperimenter ble utført og data ble plottet som tiden vs oksaliplatin-DNA addukter per 10
8 nt.
Fastsettelse av intracellulære nivåer av glutation
Intracellulær total glutation (GSH) nivået ble oppdaget med en kolo GSH deteksjon kit per produksjon protokoll (BioVision, Mountain View, California). Omtrent 10
7 celler ble vasket med iskald PBS og lysert i lyseringsbuffer GSH. Etter inkubering på is i 10 minutter, ble sulfosalisylsyre tilsatt, og supernatanten ble samlet for måling av absorbans ved 410 nm. GSH standard inkludert i settet ble brukt til å generere en standardkurve for å bestemme prøve GSH konsentrasjoner.
statistikker
Vi brukte kvantitative oppsummeringer av DNA-skader, IC
50 og AUC ( Arealet under kurven) verdier, separat ved eksperiment, cellelinje og tid (gjennomsnitt og standardavvik). Statistikk ble beregnet med n = 3 for hver cellelinje. ANOVA analyse av IC
50 og AUC-data var basert på en ensidig
t
-test. Alle testene var på et eksperiment messig feilrate på 0,05 og alle analyser brukes SAS /STAT
® eller MedCalc
® programvare.
RNAseq og QRT-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp av Qiagen RNeasy mini kit. Ko-renset genomisk DNA ble kvantifisert ved anvendelse av en 18S genspesifikke kvantitativ PCR-analyse med humant genomisk DNA som mengden standard. Etter total RNA hadde høye nivåer av genomisk DNA-forurensning (anslått til å utgjøre 15-68% av total leser), et ytterligere DNase behandlingstrinn ble tilsatt til den RNA-renseprotokoll. Dette trinnet redusert DNA-kontaminering til nivåer som forventes å produsere 0,33% av total leser. rRNA ble tømt fra prøvene ved hjelp av Epicentre sin RiboZero H /M /R kit. Sekvense bibliotekene ble laget fra 40 ng av rRNA utarmet RNA ved hjelp av Epicentre sin ScriptSeq v2 RNA-Seq Bibliotek Forberedelse Kit. Disse prøvene ble sekvensert på 1/3 av en HiSeq PE 101 kjørefelt hver ved Los Alamos National Laboratory
Rå sekvense data ble behandlet av casava 1.8 software. (Illumina, San Diego, CA) og trimmet for kvalitet (Q
30, Phred skala). Analyse av RNA-Seq data ble utført ved hjelp av en standard Hat-Mansjettknapper arbeidsflyt med menneskelige genom enheten (februar 2009, GRCh37 /hg19) [38, 39]. Ekspresjonen av et transkript ble ansett som betydelig hvis regulert FDR (p-verdi korrigert for multippel testing) var mindre enn 0,05.
For QRT-PCR, ble RNA isolert fra subsammenflytende retter med den Qiagen RNeasy Mini Kit ifølge produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert ved hjelp av Thermo Scientific RevertAid RT kit. QRT-PCR ble utført ved hjelp av EconoTaq PLUS 2X mester mix på en BioRad CFX96 Real-Time System instrument. Følgende primere ble brukt: TSPAN7 (ACCAAACCTGTGATAACCTGTCT, AGGGAGATATAGGTGCCCAGA), AKR1C2 (ATTGGAATGACATACTGCATCCT, GTTCAACCGTTTCTTACCTGTGG), AKR1C1 (CGCCTGCAGAGGTTCCTAAAA, ATCAATATGGCGGAAGCCAG), CYR61 (CCCGTTTTGGTAGATTCTGG, GCTGGAATGCAACTTCGG), HTRA1 (TCCCAACAGTTTGCGCCATAA, CCGGCACCTCTCGTTTAGAAA), og AQP3 (CCGTGACCTTTGCCATGTG, CGAAGTGCCAGATTGCATCATAA). Eventuelle RNA Seq data ikke presentert i avisen er tilgjengelig online på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra. Raw RNA Seq data har blitt tildelt tiltredelse ID-numre SRR1820076 og SRR1820077 for 5637 foreldrelinjen; og SRR1820079 og SRR1820080 for 5637R linjen (som representerer to uavhengige eksperimenter for hver cellelinje).
Resultater
Den generasjonen av 5637R cellelinje via indusert resistens er beskrevet nedenfor, sammen med en rekke fenotypiske og genotypiske karakteristikker. Med mindre annet er angitt, er sammenligninger mellom de to cellelinjene presentert i den rekkefølgen av 5637R versus henholdsvis 5637,.
Induksjon av Platinum Drug Resistance
5637R cellelinjen ble utviklet over 10 måneder av kultur med en trinnvis økning i konsentrasjon av oksaliplatin i media. Den cytotoksisitet av oksaliplatin til 5637R linjen redusert med omtrent 10 ganger i forhold til foreldrenes cellelinje (IC
50 av 26,1 mikrometer versus 2,45 mikrometer, p 0,0001, Tabell 1). Uventet, var vi ikke i stand til å utvikle en resistent 5637 derivat på lengre eksponering for karboplatin. For å sikre at 5637R stammer fra foreldre 5637-celler, ble en aliquot av hver cellelinje som sendes til ATCC for bestemmelse av klonal gjengivelse. Den 15 korte tandem repeat (STR) loci pluss amelogenin av 5637 cellelinje som brukes i denne studien var en eksakt match for ATCC human cellelinje 5637 (HTB-9) i ATCC database. Den 5637 linjen hadde tre alleler som 5637R manglet mens alle andre alleler undersøkt var de samme for begge cellelinjer, noe som tyder på at 5637R er et derivat av 5637.
Kjemoterapi narkotika cytotoksisitetstester
Celler ble dyrket med en rekke konsentrasjoner av cisplatin, karboplatin, gemcitabin, doksorubicin, metotreksat og vinblastin i 72 timer etterfulgt av vurdering av levedyktighet ved MTT-assayet (gjennomsnittsverdier gjengitt i tabell 1). Disse stoffene ble valgt på grunn av deres hyppige anvendelse i behandlingen av blærekreft. Den 5637R-cellelinjen var også mer resistente overfor cisplatin, men til en mye mindre grad enn for oksaliplatin (IC
50 2,99 uM versus 0,59 uM for 5637, p = 0,049), og for å karboplatin (IC
50 = 72,18 iM versus 24.34 mikrometer, p 0,0001). Det var også mer motstandsdyktig mot gemcitabin (IC
50 = 1,44 uM versus 0,12 uM, p = 0,0015), men begge cellelinjene var like følsomme overfor doksorubicin (IC
50 = 0,27 versus 0,29 uM, p = 0,45) , metotreksat (IC
50 = 1,24 mikrometer versus 2,01 mikrometer, p = 0,18) og vinblastin (IC
50 = 0,61 nM versus 0,60 nM, p = 0,48).
Opptak og utstrømming
for å finne narkotika opptak ble cellene inkubert med [
14C] oksaliplatin eller [
14C] carboplatin og samplet på ulike tidspunkter i løpet av 24 timer etterfulgt av isolering av celler og LSC analyse av intracellulær akkumulering av legemidlet . Den 5637R linjen hadde en beskjeden, men signifikant lavere peak intracellulær oksaliplatin nivå på 24 timer (248,6 ± 24,7 X 10
6 molekyler per celle versus 303,7 ± 14,2 X 10
6 molekyler per celle for 5637 celler, p = 0,290 ) (figur 2A). I motsetning til dette, begge cellelinjene hadde tilsvarende nivåer av karboplatin-opptaket ved 24 timer (1241 ± 192 X 10
6-molekyl per celle sammenlignet med 1113 ± 58 X 10
6-molekyl per celle, p = 0,334), (Fig 2B ).
(AB) Sammenligning av celleopptak og effluks. A. celle opptak av oksaliplatin. 5637R cellene hadde gått ned celleopptak. B: 5637 og 5637R hadde lignende celle frigivelshastigheter. (CD) oksaliplatin og karboplatin mobil efflux forskjeller mellom de to cellelinjene var ikke statistisk signifikant.
For å finne narkotika efflux, celler ble utsatt for [
14C] oksaliplatin eller [
14C ] karboplatin i 4 timer, vasket med PBS og dyrket i stoff-fri medium i 24 timer. Dyrkningsmediet ble tatt prøver av LSC ved forskjellige tidspunkter for bestemmelse av graden av effluks. Det var ingen signifikant forskjell i oksaliplatin eller karboplatin utstrømning mellom de to cellelinjer (utstrømningen ved 24 timer var 1514 ± 78 X 10
6 molekyler versus 1693 ± 244 X 10
6 molekyler pr celle for oksaliplatin, p = 0,293 (fig 2C), og 542,3 ± 44,5 X 10
6 molekyler versus 482,5 ± 35,9 X 10
6 molekyler per celle for carboplatin, p = 0,14) (figur 2D)
Intracellulær inaktivering.
5637R-celler hadde en signifikant høyere middel GSH-konsentrasjon enn 5637 celler (53,91 ± 0,83 nmol /mg protein sammenlignet med 46,93 ± 1,20 nmol /mg protein. p = 0,003) (figur 3A). For å bestemme om den høyere GSH-konsentrasjon bidratt til chemoresistance, begge cellelinjene ble dyrket i nærvær av buthionine sulfoksimin (BSO), en inhibitor av gamma-glutamyl-syntetase, som er nødvendig for GSH-biosyntese [40]. BSO behandling redusert GSH i begge cellelinjer på en doseavhengig måte (figur 3B). Eksponering av 5637R celler til 50 mikrometer BSO etterfulgt av [
14C] oksaliplatin øker eksponeringen bety oksaliplatin-DNA adduktpartiklene nivåer på 24 timer fra 285,4 ± 15,3 addukter per 10
8 nukleotider til 424.6 ± 67,7 addukter per 10
8 nukleotid, men dette var ikke statistisk signifikant (p = 0,113). Imidlertid BSO behandling signifikant redusert oksaliplatin IC
50 fra 26,08 uM for 5637R celler til 12,95 uM for BSO behandling (p = 0,002, figur 3C). I kontrast, BSO behandling hadde liten effekt på følsomheten av 5637 celler til oksaliplatin (IC
50 på 2,45 mikrometer ubehandlet versus 2,36 mikrometer med BSO eksponering, data ikke vist. Uventet, BSO eksponering hadde ingen innvirkning på carboplatin IC
50 verdier for hver cellelinje (data ikke vist).
(A) Sammenligning av karboplatin-DNA adduktdannelse mellom 5637 og 5637R. (B) sammenligning og korrelering av IC
50 verdier med carboplatin- adduktet AUC, adduktpartiklene nivåer fire timer etter dosering og DNA-reparasjon. (C) Sammenligning av celleopptak og utstrømming av karboplatin mellom 5637 og 5637R celler.
narkotika~~POS=TRUNC DNA addukt dannelse og reparasjon
Celler ble dyrket med [
14C] oksaliplatin på 10 mikrometer (omtrentlig topp menneskelig oksaliplatin plasmakonsentrasjonen under kjemoterapi) i 24 timer, etterfulgt av vasking og kultur i ytterligere 24 timer [33]. Denne protokollen primitivt ligner
in vivo
eksponering av oksaliplatin (eksponensiell reduksjon blodkonsentrasjon over ca en dag). Cellene ble høstet ved forskjellige tidspunkter i løpet av 48 timer for DNA-ekstraksjon og akselerator massespektrometri (AMS) analyse ved anvendelse av metoder som tidligere er rapportert [41]. I korthet virker AMS ved å bryte ned molekylene i en prøve inn i atomer som deretter identifisert og kvantifisert i en liten partikkelakselerator [42]. Hvis prøven er merket med et sjeldent isotop, for eksempel
14C, kan konsentrasjonen av radiocarbon atomer i partikkelstråle benyttes til å beregne konsentrasjonen av medikament i blod, vev, celler og sub-cellulære komponenter som proteiner og DNA. AMS analyse krever typisk omdannelse av prøvene til grafitt før analyse, noe som kan gjøres ved hjelp av en høy gjennomstrømning parallell prosess. Det var en tidsavhengig økning i oksaliplatin-DNA-addukt-nivåer i løpet av en 24-timers inkubasjon, etterfulgt av en gradvis reduksjon i løpet av de påfølgende 24 timer på grunn av en kombinasjon av DNA-reparasjon og fortynning av signalet ved DNA-syntese. Ved alle tidspunkter, de oksaliplatin-DNA-addukt-nivåene i 5637R-celler var lavere enn de addukt-nivåene i 5637 celler (figur 4A). Ved 48 timer, 5637R cellene hadde mye lavere DNA-addukter enn foreldre 5637-celler (78 ± 4 versus 505 ± 63 addukter pr 10
8 nukleotid, s 0,0001, tabell 2). AUC for oksaliplatin-DNA addukter integrert over 48 timer studietid var signifikant lavere for 5637R celler (9,426 ± 2457 addukter-hr per 10
8 nukleotider versus 27,720 ± 2985 addukter-hr per 10
8 nukleotider, p = 0,001, Tabell 2).
Sammenligning av oksaliplatin og karboplatin-DNA adduktdannelse mellom 5637 og 5637R celler. De kjemoresistent 5637R cellene hadde høyere oksaliplatin-DNA adduktpartiklene nivåer på alle tidspunkter i forhold til mer behandlings sensitive 5637 celler.
For DNA reparasjon studier ble cellene eksponert for [
14C] oksaliplatin for 24 timer, vasket og dyrket videre i oksaliplatin fritt medium. Reduksjonen av oksaliplatin-DNA-addukter ved flere tidspunkter i løpet av de neste 24 timene ble anvendt for å beregne medikament-DNA-addukt reparasjon hastighet. 5637R cellene hadde en reparasjon rate på 3,48 ± 0,15 addukter per 10
8 nukleotider /time og 1,34 ± 0,30 addukter per 10
8 nukleotider-time for 5637 celler (p = 0,0004, tabell 2).
dannelsen og reparasjon av karboplatin-DNA-addukter ble bestemt på lignende måte, men med kortere legemiddeleksponering (fire timers eksponering, etterfulgt av vasking og en tyve timers inkubering i medikamentfritt medium) for å etterligne den hurtigere
in vivo
plasma halveringstid sammenlignet med oksaliplatin. Karboplatin-DNA adduktpartiklene nivåer og narkotika-DNA reparasjons priser var ikke signifikant forskjellig mellom de to cellelinjer (AUC for 4527 ± 895 kontra 4211 ± 1678 monoadduct-hr /10
8 nukleotider, p = 0,69, tabell 2, og narkotika -DNA reparasjonsrater 6,30 ± 3,10 kontra 9,31 ± 6,74 addukter /10
8 nukleotider /time, p = 0,34 for 5637R og 5637 celler, henholdsvis (figur 4B).
RNAseq analyse av 5637 og 5637R celler
totalt RNA ble isolert fra subsammenflytende celler som var dyrket i fravær av kjemoterapi narkotika, og som brukes til analyse av RNA-seq. fra dupliserte uavhengige eksperimenter, var det en total av 83 RNA med statistisk signifikant ekspresjon endringer, hvorav 50 var assosiert med kjente gener, en kjent mikroRNA og 22 nye transkripsjoner. (p 0,05, S1 Fig og S1 Table) De resterende 10 transkripsjoner representerer gener som ikke gir målbare uttrykk i alle gjentak, men kan likevel være av betydning for resistens. Fire gener med kjent relevans for chemoresistance (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1, og CYR61) ble vist å være signifikant oppregulert i resistente cellelinje 5637R og to gener (HTRA1 og AQP3) ble nedregulert i forhold til foreldre cellelinje 5637 (Tabell 3). RNA-seq resultater ble ytterligere bekreftet ved QRT-PCR-analyse av utvalgte transkripsjoner av RNA isolert fra subsammenflytende kulturer dyrket uten bruk av medikamenter i to eksemplarer (figur 5).
Fire gener (TSPAN7, AKR1C2, AKR1C1, og CYR61) har økte nivåer i 5637R celler og to gener (HTRA1 og AQP3) har redusert nivå i resistente celler. (A) Brett endringer i chemoresistance gen-nivåer i forhold til de 5637 parentale celler som bestemt ved RNA-seq. (B) Brett endring i chemoresistance gen transkripsjonsnivåer i forhold til 5637 foreldre celler som bestemmes av QRT-PCR.
Diskusjoner
Etter ti måneder med cellekultur under press fra oksaliplatin eksponering den resulterende resistente cellelinje beholdt en 5637 avstamning som bestemmes av STR-analyse, som begrunnet sin betegnelse som 5637R. Våre resultater er sammenlignbare med andre tidligere funn om foreldre og oksaliplatin resistente kreftcellelinjer celler [43-46]. Det er merkelig og overraskende at karboplatin eksponering av 5637-celler under lignende forsøksbetingelser ikke produserte en karboplatin resistent cellelinje, selv om 5637R-celler er vesentlig motstandsdyktig mot karboplatin. Dette er et uventet resultat med tanke på nesten universelle kliniske utbruddet av motstand i avansert kreft ved behandling med platinum-basert regime. Vanskeligheten med å indusere karboplatin motstand i 5637-celler kan skyldes den kjente dårlig kryssresistens mellom oksaliplatin og karboplatin eller cisplatin, [2]. Oxaliplatin kan indusere et annet sett med mutasjon spektra sammenlignet med carboplatin, som har blitt rapportert i en
hprt
genmutasjonstest i CHO-celler for en sammenligning mellom cisplatin og oksaliplatin [47]. Uavhengig av hvordan de ble samlet, det resulterende par av cellelinjer representerer en nyttig modell system for indusert medikamentresistens, spesielt med tanke på deres forholdsvis få fenotypiske og genotypiske forskjeller.
5637R /5637 paret ble bedømt ved MTT-assayet for motstand mot oksaliplatin og flere stoffer som brukes i behandlingen av blærekreft. Oksaliplatin, karboplatin og gemcitabin var betydelig mindre cytotoksiske å 5637R celler. Doxorubicin, metotreksat og vinblastin var like toksiske for begge cellelinjer. Dette resultat er ikke overraskende med tanke ervervet resistens mot et medikament ofte velger for en eller flere av mekanistiske baner som har flere medikamenter som substrater. I klinikken, respons på førstelinjeplatinabasert terapi er 40-50% for muskel invasiv blærekreft, men når motstanden følger, påfølgende behandlinger har bare 10-25% responsrate [48, 49]. Selv om mye ekstra arbeid er nødvendig, MTT inn data fra modellsystemet viser at det er mulig å ha vesentlig cytotoksisk respons på kjemoterapi påfølgende etter utbruddet av platina medikamentresistens hvis riktig behandling er valgt.
Kanskje den mest felles legemiddelresistens mekanisme er modulering av intracellulær akkumulering av legemidlet via endringer i hastigheten av opptak og effluks [42].
