Abstract
Overveldende bevis har vist at den avvikende uttrykk for den menneskelige trophoblast celleoverflate antigen (TROP2) var assosiert med tumor aggressivitet og dårlig prognose i en rekke humane kreftformer, men rollene TROP2 i livmorhalskreft er ikke undersøkt. Formålet med studien var å belyse den prognostisk betydning TROP2 ekspresjon hos pasienter med kreft i livmorhalsen og bestemme dens virkning på tumorprogresjon. Immunhistokjemi analyse viste at 88,7% (94/106 tilfeller) av livmorhalskreft prøvene ble positivt farget med TROP2, og overekspresjon av TROP2 var nært beslektet med FIGO stadium, histologiske karakterer, lymfatisk metastaser, invasiv interstitiell dybde og høy uttrykk for Ki-67 . Pasienter med TROP2-positiv farging viste en signifikant redusert total overlevelse og progresjonsfri overlevelse; Det var også en uavhengig prediktor for prognose ifølge multivariat analyse. Videre nedregulering av TROP2 mediert av siRNA i Siha og CaSki celler resulterte i en sterk hemming av spredning og invasjon, TROP2 oppheve også forhøyet apoptotiske forholdet og forårsaket G1 arrest. Motsatt, håndhevet uttrykk for TROP2 i HeLa og C33A celler bemerkelsesverdig fremmet cellevekst, migrasjon og invasjon. I tillegg ble tumorigen funksjon av TROP2 i forbindelse med den økte uttrykk for cyklin D1, cyklin E, CDK2 og CDK4 men redusert ekspresjon av p27 og E-cadherin via aktivering av ERK1 /to signalveien. Videre hemming av TROP2 uttrykk i livmorhalskreft cellelinjer øker følsomheten for cisplatin. Denne studien tyder på at overekspresjon av TROP2 kan spille viktige roller i utviklingen og patogenesen av menneskelig livmorhalskreft, derfor TROP2 kan representere en potensiell prognostisk indikator og en potensiell terapeutisk mål av livmorhalskreft
Citation. Liu T Liu Y, Bao X, Tian J, Liu Y, Yang X (2013) Overuttrykte TROP2 Spår dårlig prognose for pasienter med livmorhalskreft og Fremmer spredning og invasjon av livmorhalskreftceller ved Regulering ERK signalveien. PLoS ONE 8 (9): e75864. doi: 10,1371 /journal.pone.0075864
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: Mai 10, 2013; Godkjent: 22 august 2013; Publisert: 27.09.2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet ble støttet av National Natural Science Foundation of China and Science (nr 81372809) and Technology Development Planning i Shandong-provinsen (No. 2011GSF12121). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje mest utbredte malignitet blant kvinner over hele verden [1], med en anslått ca 530 000 nye tilfeller og 275.000 kvinner død hvert år.
Tidlig stadium pasienter (i-IIA) kan få et tilfredsstillende resultat gjennom radikal kirurgi eller strålebehandling, med en samlet 5-års overlevelse av 65%. Likevel kan pasienter med avansert stadium (IIB-IV) bare behandles med strålebehandling eller pluss kjemoterapi, 5-års overlevelse for pasienter med stadium III er 25 til 35%, men for stadium IV er 15% eller mindre [2] , [3]. Det er flere høye risikofaktorer antas å være nært knyttet til ugunstige kliniske utfall, inkludert avansert International Federation of obstetrikk og gynekologi (FIGO) scenen, stor svulst størrelse, lymfeknutemetastase, deep cervical stromal invasjon og lymphovascular plass invasjon. Pasienter med høy risikofaktorer alltid utvikle resistens mot kjemoterapi og strålebehandling, og til slutt døde av lokalt residiv eller fjernmetastaser. Derfor er det et presserende behov for å se etter nye biomarkører som en komplementær prediktiv indikator for tidlig diagnose og nøyaktig prognose vurdering, som vil være nyttig i målretting behandling av livmorhalskreft.
trophoblast? Trophoblast celleoverflateantigen 2 (TROP2) er et 36 kDa transmembran-glykoprotein som hører til tumorassosiert kalsium signal transduser (TACSTD) genfamilien. Det ble opprinnelig identifisert i humane trophoblast cellelinjer, og forhøyet ekspresjon ble funnet i forskjellige typer av epitel-karsinomer mens lav eller begrensede ekspresjon ble funnet i normale vev [4]. Dess TROP2, er epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) genet i en annen sterkt konservert medlem av TACSTD genfamilien, men de deler 49% sekvenslikhet med både tyroglobulin type I og interleukin-2-reseptorene [5]. Selv om reguleringen av ekspresjonen av genet TROP2 ikke er fullt ut forstått, er fosforyleringsseter i den cytoplasmiske hale-regionen og et konservert tyrosin og serin fosforylering området anses å spille en viktig rolle i signaloverføring. Tidlige studier funnet at kryssbindings TROP2 med antistoffer føre til cytoplasmisk kalsium [Ca
2+] økt med tre ganger enn det basale nivå, noe som antydet en mobilisering av Ca
2+ fra indre lagre [6]. Når fosfatidylinositol 4, 5-bis-fosfat (PIP2) binding til den cytoplasmiske hale av TROP2, det potensielt kan resultere i en økning i inositol-1,4,5-trifosfat (IP3), som er avgjørende for Ca
2+ mobilisering . Med mer Ca
2+ frigjøres fra det endoplasmatiske retikulum, kan protein kinase C (PKC) aktiveres i en positiv feedback mekanisme som kan i sin tur føre til fosforylering av mer TROP2, kan denne prosessen ha en betydelig effekt på aktivering av Raf, MAPK og NF-kB stier og så videre [7].
Nyere arbeider vist at TROP2 oppførte seg som en sann onkogen fører til tumorigenesis og invasivitet i kolorektal kreft cellelinjer [8], og overekspresjon av TROP2 ble nært knyttet til kreft progresjon og dårlig prognose. Forskere har funnet ut at bicistronisk cyclin D1-TROP2 mRNA ble ofte uttrykt i eggstokkene, colonic og livmorkreft, og både TROP2 og cyclin D1-deler i den chimera kan indusere celle ondartet transformasjon [9]. Disse funnene tyder på at alle TROP2 er ikke bare en potensiell prognose biomarkør, men også kandidat som et terapeutisk mål som kan bli anvendt i å utvikle innovative behandlingsstrategier. I denne studien undersøkte vi TROP2 protein uttrykk og dens korrelasjon med clinicopathologic funksjoner og kliniske resultater i livmorhalskreft prøver. I tillegg vurderte vi effekten av TROP2 uttrykk på spredning, cellesyklus og invasjonen i fire livmorhalskreft cellelinjer, vi også bestemt om TROP2 spiller en rolle i kjemoterapi av livmorhalskreft. Disse data kan gi informasjon for prediksjon av livmorhalskreft prognose og etablering av målrettet terapi.
Metoder
Clinicopathologic Informasjon av livmorhalskreftpasienter
En totalt 160 prøver innhentet av slag biopsi, ble kjegle biopsi eller hysterektomi hentet fra Institutt for patologi, Qilu Hospital of Shandong University mellom april 2005 til oktober 2007 (tabell 1). Studien inkluderte 106 pasienter med livmorhalskreft (gjennomsnittsalder 43,6 ± 11,5 år), 34 pasienter med cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) (gjennomsnittsalder 40,2 ± 8,1 år) og 20 pasienter med normal cervical vev (gjennomsnittsalder 46,4 ± 4,8 år). Normale livmorhals vevsprøver ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk hysterektomi for godartet leiomyoma. Alle de registrerte deltakerne hadde intakt oppfølging informasjon og ble ikke utsatt for strålebehandling eller cellegift før kirurgisk reseksjon. Prøvene ble histopathologically bekreftet av tre patologer i henhold til de diagnostiske kriteriene. Klinisk stadium av livmorhalskreft ble klassifisert i henhold til International Federation of gynekologi og fødselshjelp (Figo) kriterier. I løpet av oppfølgingsperioden (median oppfølging 60 måneder; range 9.6-82.5 måneder), 68 pasienter (64,15%) var i live, og 38 pasienter (35,85%) var døde. Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Medical Ethics Committee of Qilu Hospital, Shandong University. Alle deltakerne gitt sitt skriftlige samtykke til å være involvert i dette arbeidet.
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging ble utført på fire-mikrometer tykke deler av parafininnstøpte vev, og fargeprosessen ble strengt utført i henhold til den streptavidin-biotin-peroksidasekompleks metode. Etter deparaffinisation og rehydratisering, ble delene behandlet med 3% hydrogenperoksyd for å blokkere endogen peroksidase. Ikke-spesifikk binding ble blokkert med normalt geiteserum i 30 minutter ved 37 ° C, deretter ble seksjonene inkubert med anti-TROP2 (Santa Cruz, USA, 1:500 fortynning) eller anti-Ki-67 monoklonalt antistoff (Dako, lostrup , Danmark, 1:100 fortynning) over natten ved 4 ° C. Etter vasking med PBS, ble seksjonene inkubert med et pepperrot peroksidase-merket polymer-konjugert anti-muse-sekundært antistoff (Beijing Zhong Shan Biotech Ltd Co, Beijing, Kina) ved 37 ° C i 30 minutter. Deretter ble seksjonene farget med 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid i 5 minutter og kjerner ble motfarget med hematoksylin i 3 minutter, og deretter montert med nøytral balsam. PBS ble brukt til å erstatte antistoff som negativ kontroll.
Evaluering og Kvantifisering av Farging
De farging Resultatene ble evaluert av tre patologer som var blindet for de kliniske detaljer om pasienter. TROP2 ekspresjon ble definert som tilstedeværelse av gul-brun membranfarging av tumorceller. Hver prøve skal estimeres, inkludert fargeintensitet og prosentandelen av positive tumorceller med ikke mindre enn 1000 celler og 5 høye strømfelt. Intensiteten av fargingen ble bedømt som 0 (negativ), 1 (svak), 2 (middels) og 3 (sterk), mens prosentandelen av positive celler ble bedømt som 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%) og 3 (51-100%). De samlede immunhistokjemiske fargings resultater ble basert på intensiteten poengsum × prosent flekker poengsum som følger: – (skår 0); + (Skår 1, 2, 3); ++ (Skår 4, 6); +++ (Skår 9) [10]. For Ki-67, ble merkingen index (LI) vurderes som prosentandelen av celler med nukleær farging blant 1.000 invasive kreftceller i tilfeldig valgt, ble sluttresultatet av Ki-67 uttrykk kategoriseres i fire grupper basert på merking indeksen og plassering av nukleær farging som tidligere beskrevet [11]. Klassifiseringen var som følger: -, ( 10%, begrenset til de parabasal cellelagene); +, (10% til 30%, begrenset til den nedre tredjedel av epitel); ++, (30 til 70%, når den øvre tredjedel av epitel); +++ (70% eller mer av epitelceller inkludert full tykkelse uttrykkelig ion av Ki-67).
Cell Culture
Fire menneskelivmorhalskreft cellelinjer CaSki, Siha, HeLa og C33A-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), dyrket i Dulbecco-modifisert Eagle-medium (DMEM; Gibco Inc., Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA. , USA) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen) i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2 atmosfære.
Immunofluorescence Farging
Siha og CaSki-celler ble dyrket på objektglass i en 6-brønns plate og inkubert i 24 timer. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd og blokkert med normalt geiteserum i 30 minutter ved 37 ° C. Etter grundig vasking med Tris-bufret saltvann (TBS), ble cellene inkubert med primære anti-TROP2 monoklonalt antistoff (Santa Cruz, USA, 1:500 fortynning) over natten ved 4 ° C og farget med FITC-konjugert anti-mus IgG (Beijing Zhong Shan Biotech Co Ltd, Beijing, Kina, 1:200 fortynning) i 30 min. Fluorescens-merket TROP2 ble observert under et fluorescens mikroskop og bildet ble tatt.
Cells transfections
For å slå ned endogen TROP2 uttrykk, ble to par siRNA sekvenser rettet mot TROP2 designet og syntetisert av Genepharma Co., Ltd (Shanghai, Kina). Disse sekvensene var: siRNA-1100, 5′-GCACGCUCAUCUAUUACCUTT-3 «, 5′-AGGUAAUAGAUGAGCGUGCTT-3; siRNA-550, 5»-CCAAGUGUCUGCUGCUCAATT-3 «, 5′-UUGAGCAGCAGACACUUGGTT-3». Negative krafse kontrollsekvenser var: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3». For å studere effekter av TROP2 håndhevet uttrykk, ble TROP2 isoform uttrykke plasmid ansatt i HeLa og C33A celler. Det humane TROP2 full lengde cDNA ble amplifisert og innsatt i pcDNA 3.1 vektor (Genepharma Co., Ltd Shanghai, Kina) for å oppnå pcDNA3.1-TROP2. For transfeksjon ble cellene sådd ut i 6-brønns plater og forventes å være 50% konfluens neste dag. Etter celle vedlegg, ble TROP2 siRNA eller rekombinant pcDNA3.1-TROP2 transfektert inn i cellene i Opti-MEM (Invitrogen) ved hjelp av Lipofectamime 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger, ble kulturmediet erstattet etter 6 timers inkubasjon. Etter 48 timers transfeksjon, ble cellene tellet og underkastet celle-levedyktighet analyse og western blot analyse. Utransfekterte celler ble antatt å være blank kontroll, celler transfektert med egge siRNA eller pcDNA3.1 (tom vektor) ble betraktet som negativ kontroll.
celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av en celle telling kit-8 (CCK-8) i henhold til produsentens protokoll (Jingmei biotech, Shanghai, Kina). I korthet, kontroll og transfekterte celler ble sådd ut ved 5000 per brønn i 96-brønners plater, etter behandling med cisplatin (Sigma, St. Louis, MO, USA) eller MEK-inhibitor U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) ved indikerte tidspunkter, 10 ul av CCK-8 ble tilsatt til hver brønn, og deretter inkubert i ytterligere 2 timer ved 37 ° C. Den optiske tetthet (OD) ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Rad Model 680, Richmond, CA, USA) ved 450 nm bølgelengde. De inhiberende konsentrasjoner på 50% proliferasjon (IC50) av cisplatin ble beregnet av GraphPad Prism software. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Apoptose-analysen
I 48 timer etter transfeksjon, ble cellene oppsamlet og vasket to ganger med kald PBS, resuspendert i 400 pl Annexin V-FITC bindingsbuffer ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml. Cellene ble farget med 5 ul Annexin V-FITC og 10 ul propidiumjodid (PI) i henhold til apoptose Detection Kit (Jingmei biotech, Shanghai, Kina) instruksjoner. Deretter underkastes flowcytometri (BD, San Jose, CA, USA) for å detektere celle apoptose. Dette eksperimentet ble gjennomført tre ganger.
Cell Cycle Analysis
Celler transfektert med TROP2 siRNA eller pcDNA3.1-TROP2 ble høstet ved 48 timer etter transfeksjon, samlet ved trypsinering og fiksert i 75% kaldt etanol i 1 time ved -20 ° C. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble cellene inkubert med 100 ul RNase A (100 pg /ml) og 400 ul propidiumjodid henholdsvis i 30 minutter ved 37 ° C. Til slutt ble cellesyklus målt ved strømningscytometri ved anvendelse av en FACScan strømningscytometer (BD, San Jose, CA, USA) ved 488 nm, og de relative forhold av G1, S og G2 fasene ble analysert ved FlowJo 2,8 programvare. Forsøket ble utført i tre eksemplarer.
Wound Healing analysen
Den mono sårbehandling analyse ble brukt for å vurdere celle migrasjon evne. Celler (5 × 10
5) ble sådd i 6-brønners plater, ruges over natten, deretter transfektert med TROP2 siRNA eller pcDNA3.1-TROP2. Etter å ha oppnådd 90% konfluens, ble cellemonolaget skrapet med en steril pipette, flytende celler ble fjernet med PBS, og dyrket på nytt i RPMI 1640-medium inneholdende 1% FBS. Fotografiske bilder ble tatt ved 0, 24 og 48 timer skrape langs linje med mikroskop. Resultatene ble uttrykt som relativ bunnen bredde, basert avstanden migrert i forhold til den opprinnelige avstand oppskrapet. Forsøket ble utført i tre eksemplarer.
Cell Invasion analysen
invasiv evne til livmorhalskreftceller ble vurdert ved hjelp av en 24-brønns transwell kammer (celle invasjon assay kit), ved å beregne cellene passert gjennom en polykarbonatmembran (8-um porestørrelse) (Corning Costar, New York, USA). Polykarbonatet overflate av hvert kammer var dekket med 20 pl matrigel (BD Biosciences, USA; 1:04 fortynning) for å skape en kunstig basalmembran. -Celler (1 x 10
5-celler) transfektert med TROP2 siRNA eller pcDNA3.1-TROP2 ble suspendert i 200 ul serumfritt medium 1640 og dyrket i den øvre transwell kammer i 24 timer ved 37 ° C, det nedre kammeret var fylt med 600 pl av 1640-medium supplert med 10% FBS. Den ikke-invaderende celler festet til den øvre overflate av membranen ble fjernet med en steril bomullsdott og invasjons cellene som gjennomtrenges gjennom membranen ble farget med 0,1% krystallfiolett i 20 min ved romtemperatur. Antallet av celler ble beregnet under et mikroskop Leica i åtte tilfeldige områder. Forsøket ble gjentatt tre ganger for hver gruppe.
Hoechst 33258 Farging
Ved 24 timer etter transfeksjon, de transfekterte celler og kontrollceller ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av cisplatin i 48 timer. Deretter ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter etterfulgt av farging med 100 ug /ml Hoechst 33258 (Beyotime, Shanghai) ved romtemperatur i mørke i 30 minutter ble de apoptotiske egenskaper vurderes ved å observere kromatin kondensering eller fragmenter i henhold til et fluorescens-mikroskop med en eksitasjonsbølgelengde på 340 til 360 nm.
Western blot analyse
ekvivalent mengde av den celle proteinprøvene ble lastet på 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS siders) og overført til PVDF-membraner ved hjelp av Bio-Rad Elektro-system. Etter blokkert med 5% vekt /volum fettfri tørrmelk i 1 time, ble membranene inkubert med primære antistoffer som er spesifikke for TROP2 (Santa Cruz Biotechnolog, CA, USA; 1:1000 fortynning), E-cadherin, cyclin D1, cyklin E, CDK2, CDK4, ERK1 /2, p-ERK1 /2, P27, bCL-2 og Bax (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA; 1:1000 fortynning) over natten ved 4 ° C. Deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert kanin-anti-muse-sekundært antistoff (Beijing Zhong Shan Biotech Ltd Co, Beijing, Kina; 1:4000 fortynning) i 1 time, ble proteinbåndene visualisert ved forsterket kjemiluminescens (Millipore) og analysert ved hjelp av densitometrically Antall Et bilde programvare (Bio-Rad, USA). β-aktin (Beijing Zhong Shan Biotech Co Ltd, Beijing, Kina, 1:1000 fortynning) ble brukt som intern kontroll for protein lasting og analyse
Statistiske analyser
SPSS (SPSS Inc. , Chicago, IL, USA) 18,0 programmet ble brukt til å utføre statistisk analyse.
Kvantitative data ble uttrykt som middelverdier ± standardavvik (SD). Forskjeller mellom grupper ble evaluert av uparet Student t test eller enveis ANOVA. Pearson chi-kvadrat test eller Fishers eksakte test ble brukt for analyse mellom graden av flekker og kliniske parametre ble korrelasjonsanalyse utført med Spearman rang korrelasjonskoeffisient. Kaplan-Meier-kurver ble plottet for å beskrive overlevelse informasjon ved log-rank test. Multivariat analyse ble utført ved hjelp av en Cox proporsjonal farer regresjonsmodell. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
TROP2 er over-uttrykt i Highly Proliferative livmorhalskreft
I alt ble 160 prøver bestemt ved immunhistokjemi, inkludert 20 normalt. cervical vev, 34 CIN vev og 106 livmorhalskreft vev. Demografiske data og tumor egenskaper er beskrevet i tabell 1. Ingen av pasientene hadde mottatt radioterapi eller kjemoterapi før operasjonen. I henhold til kriterier som er definert tidligere, 55% av de normale cervikale prøver viste detekterbar TROP2 uttrykk, viste 40% og 5% av prøvene svak og moderate flekker, hovedsakelig påvist i ectocervical skjellepitel (figur 1A og B). Forbløffende nok uttrykk for TROP2 ble gradvis økt fra CINI (50%) til CINII (66,7%) og CINIII (76,9%, figur 1C) (p = 0,037), noe som indikerer TROP2 uttrykk var signifikant korrelert med utviklingen og progresjon av livmorhalskreft . Videre ble intens membran farging av TROP2 oppdaget i flertall (88,7%) av tilfellene av livmorhalskreft, mens stromale celler ble regelmessig negative (figur 1D, E og F). Statistisk analyse viste at TROP2 ekspresjonsnivået i livmorhalskreft var signifikant høyere enn i normale vev i livmorhalsen og CIN vev (p 0,001).
A-B. Negative og svak TROP2 uttrykk i normale cervical vev. C. CIN III med sterk TROP2 membranfarging (skår +++). D-E. Sterk og svak TROP2 uttrykk i livmorhals sqamous cellekreft (skår +++, +). F. Sterk TROP2 uttrykk i cervical adenokarsinom (skår +++). G-H. Ki-67 uttrykk i CINIII og livmorhalskreft (poengsum ++, +++). Forstørrelser: × 200 (A, B, C, D, E) og × 400 (F, G, H)
For ordens skyld bekrefte sammenhengen mellom TROP2 uttrykk og kreft progresjon, vi. også analysert ekspresjonen av Ki-67 i de samme sett av cervix prøvene ved immunhistokjemi analysen (figur 1G og H). Ki-67 har vist seg å være et felles proliferativ markør og brukt til å evaluere mange maligne lesjoner av kreft. Statistisk analyse viste at det var en signifikant sammenheng mellom økt TROP2 farging og Ki67-positive prolifererende celler i livmorhalskreft prøver (p 0,001; tabell 2)., Som indikerte at TROP2 ble over uttrykt i svært proliferative menneskelige livmorhalskreftceller
Sammenheng mellom TROP2 Expression og kliniske patologiske funnene
De kliniske betydninger av TROP2 overekspresjon hos pasienter med livmorhalskreft ble oppsummert i tabell 1. resultatene viste at TROP2 uttrykk nivåer var signifikant forskjellig mellom gruppene i forhold til histologisk grad (p 0,001), lymfatisk metastase (p = 0,001), invasiv interstitiell dybde (p 0,001), FIGO stadium (p 0,001) og histologisk-subtype (p = 0,023). Men det var ingen signifikant sammenheng mellom TROP2 uttrykk og alder (p = 0,100), tumorstørrelse (p = 0,255).
Høy Expression of TROP2 korrelerer med dårlig prognose i Livmorhalskreft
Å evaluere effekten av TROP2 uttrykk og clinicopathological funksjoner på kliniske utfall av pasientene brukte vi Kaplan -Meier analyse og log-rank test for sensurerte overlevelsesdata. Som vist i figur 2, Kaplan-Meier overlevelseskurver viste at pasienter med positiv TROP2 uttrykk hadde dårligere total overlevelse (OS) sammenlignet med de uten TROP2 uttrykk (p 0,01), progresjonsfri overlevelse (PFS) også gradvis redusert med økende TROP2 uttrykk score (p 0,01). Ved univariat analyse fant vi at clinicopathologic egenskaper inkludert avanserte Figo stadier, dårlig histologisk grad, positiv lymphatic metastaser og dypere invasiv interstitiell dybde hadde signifikant dårligere klinisk resultat (tabell 3). Deretter ble uttrykket av TROP2 samt alle de statistisk signifikante variabler vurderes i de univariate analysene undersøkes av multivariat Cox regresjonsmodell analyse. TROP2 protein overekspresjon, sammen med histologisk grad og lymfatiske metastaser ble identifisert til å være uavhengige prediktive faktorer for dårlig OS (p = 0,022, p = 0023 og p = 0,002, henholdsvis) og PFS (p = 0,016, p = 0,04 og p = 0,005 henholdsvis).
TROP2 Fremmer Cell Proliferation i livmorhalskreft Cells
Gitt bevis for at TROP2 forhøyet uttrykk var nært forbundet med tumor aggressivitet og dårlig klinisk prognose, vi videre undersøkte de funksjonelle konsekvensene av TROP2 uttrykk i livmorhalskreft cellelinjer. Først av alt, undersøkte vi TROP2 uttrykk i fire livmorhalskreft cellelinjer Siha, HeLa og CaSki og C33A av Western blot (figur 3A). I samsvar med den immunhistokjemi analysen ble TROP2 protein tydeligvis oppdaget i alle cellelinjer på ca 36 kDa, Siha og CaSki celler viste relativt høyere TROP2 uttrykk, mens dens uttrykk var svak i HeLa og C33A celler. Ved immunofluorescens-analyse vi funnet at det var et lag med grønt fluorescerende farging av cytomembrane av Siha og CaSki-celler (Figur 3B). For ytterligere å utforske de biologiske funksjonene TROP2, vi identifisert og validert to uavhengige og ikke-overlappende siRNA sekvenser å utarme endogene TROP2 uttrykk i Siha og CaSki celler, ble HeLa og C33A celler transfektert med pcDNA3.1-TROP2 å forbedre TROP2 uttrykk. Celler transfektert med egge siRNA eller pcDNA3.1 ble betraktet som negativ kontroll, ikke-transfekterte celler ble anvendt som blindprøve. I henhold til resultatene av Western blot ved 48 timer etter transfeksjon (figur 3C), viste proteinnivået av TROP2 en betydelig variasjon, de to siRNA sekvensene fører alle til redusert TROP2 ekspresjon med 50% -80% av Siha og CaSki-celler, og pcDNA3.1-TROP2 var i stand til å produsere minst 30% oppregulering av TROP2 uttrykk for HeLa og C33A celler.
A. Uttrykket av TROP2 ble funnet i fire livmorhalskreft cellelinjer av western blot, Siha og CaSki celler viste høyere uttrykk sammenlignet med HeLa og C33A celler, β-aktin ble brukt som intern kontroll. B. Immunfluorescens analyse viste det var et lag med grønt fluorescerende farging av cytomembrane i Siha og CaSki-celler. C. Western blot analyse for å bekrefte siRNA mediert knockdown og pcDNA3.1-TROP2 mediert overekspresjon av TROP2 i forskjellige livmorhalskreft cellelinjer. D. Cellene ble transfektert med TROP2 siRNA eller pcDNA3.1-TROP2, ble levedyktighet vurdert ved hjelp av en CCK-8-analysen ved fem tidspunkter (0, 1, 2, 3, 4 dager, henholdsvis). På 2 dager etter transfeksjon, knockdown av TROP2 fremkalte en signifikant hemmer effekt på celleproliferasjon i Siha og CaSki celler, mens tvungen uttrykk for TROP2 økt cellelevedyktigheten til HeLa og C33A celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter, * p 0,05, ** p. 0,01
CCK-8-analysen ble anvendt for å bestemme virkningen av TROP2 uttrykk på celleformering. Våre resultater viste at knockdown av TROP2 fremkalt en markert inhibering effekt på proliferasjonen etter transfeksjon i Siha og CaSki-celler (p 0,05), mens cellenes levedyktighet i pcDNA3.1-TROP2 transfeksjon gruppen ble betydelig forbedret (p 0,05; figur 3D). Kombinert med våre immunhistokjemi Resultatene viste at TROP2 ble sterkt uttrykt i Ki67 positive prolifererende celler, disse dataene indikerte at uttrykket av TROP2 økt celleviabilitet av livmorhalskreftceller.
Impact of TROP2 Expression på Cell apoptose og Cell Cycle
det er blitt demonstrert at celle apoptose spiller en betydelig rolle i progresjon og utvikling av svulster, vi videre undersøkt om den celleproliferasjon inhibering på grunn av apoptose-induserte funksjon. Strømningscytometri ble benyttet for å bestemme celle apoptose etter 48 timer etter transfeksjon. Resultatene viste at de totale celle apoptose hastighetene for TROP2 siRNA transfeksjon gruppe (siRNA-1100 og siRNA-550) var signifikant høyere sammenlignet med negativ kontroll gruppe i både Siha og CaSki-celler (p 0,05, figur 4A). I mellomtiden har tendens til tidlig celle apoptose og sene celleapoptose prisene var i overensstemmelse med den av de totale celle apoptose priser. Tvert imot, håndheves ekspresjon av TROP2 signifikant inhiberte celle apoptose, var andelen av positive celler for annexin V og propidiumjodid ble tydeligvis redusert i HeLa og C33A celler, sammenlignet med ubehandlede celler og pcDNA3.1 transfekterte celler (P 0,01, henholdsvis; Figur 4B). For ytterligere å utforske de underliggende molekylære mekanismer som TROP2 knockdown induserer apoptose, undersøkte vi uttrykk for BCL-2 og Bax av Western blot (Figur 4C). Resultatene viste at ekspresjon av bcl-2-protein ble åpenbart minsket mens bax ble markert forbedret i begge Siha og CaSki transfekterte celler sammenlignet med kontrollceller (scrambled siRNA). I motsetning til dette, HeLa og C33A-celler transfektert med pcDNA3. 1-TROP2 utstilt motsatt effekt (figur 4D). Disse funn viste at anti-apoptotiske virkning av TROP2 oppnås ved direkte oppregulering bcl-2-ekspresjon og inhibering av bax-aktivering.
A. Nedregulering av TROP2 indusert celle apoptose i Siha og CaSki-celler. Cellene ble høstet ved 48 timer etter transfeksjon, etterfulgt av apoptose-analyse ved bruk av annexin V-FITC apoptose deteksjon kit. Celler i høyre nedre og øvre kvadranter er vurdere så tidlig og sent apoptose henholdsvis i venstre øvre kvadranter regnes som døde celler. Resultatene ble analysert ved FlowJo programvare. B. Tvangs ekspresjon av TROP2 signifikant inhiberte celle apoptose C. Western blot-analyse viste at nedregulering av TROP2 redusert ekspresjon av bcl-2 og økt ekspresjon av Bax i Siha og CaSki-celler. D. Tvungen uttrykk for TROP2 i HeLa og C33A celler økt uttrykk av BCL-2 og redusert uttrykket Bax. Disse dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter, * p 0,05, ** P. 0,01
For å få en mer helhetlig forståelse av TROP2 gen-funksjon, vi videre undersøkt effekten av TROP2 ekspresjon på cellesyklusen ved strømningscytometri-analyse. Som vist i figur 5A, er resultatene indikerte at uttømming av TROP2 ekspresjon resulterer i akkumuleringen av celler i G1 fase og reduksjon av celler i S-fasen etter 48 timer etter transfeksjon (p 0,05). I motsetning til dette håndheves ekspresjon av TROP2 i HeLa-celler og C33A viste en signifikant reduksjon av celler i G1 fase, men en økning av celler i S-fasen og G2-M-fase (p 0,05, figur 5B). Resultatene indikerte at TROP2 var i stand til å øke livmorhalskreftceller spredning ved å fremme G1-S og G2-M overganger.
A. Knockdown av TROP2 indusert G1 arrest i Siha og CaSki celler. Siha og CaSki celler ble transfektert med TROP2 siRNA eller egge siRNA. 48-regulering av TROP2 indusert cellesyklus arrest i G1 fasen. B. Overuttrykte TROP2 fremmet G1-S og G2-M overganger i HeLa og C33A celler. C, D. TROP2 regulert cellesyklus faktorer via ERK1 /2 signalveien i livmorhalskreftceller. Siha og CaSki celler (C) ble transfektert med TROP2 siRNA eller egge siRNA.
