Abstract
Bakgrunn
kromosom Aneuploidy er et definerende trekk ved karsinomer. For eksempel, i tykktarmskreft, en ekstra kopi av kromosom 7 er ikke bare observert i tidlige pre-maligne polypper, men er trofast opprettholdes gjennom progresjon til metastase. Disse kopi nummer endringene viser en positiv sammenheng med gjennomsnittlig transkripsjonsnivåer av fastboende gener. En uavhengig linje med forskning har også fastslått at spesifikke kromosomer okkupere et godt bevart 3D posisjon innen inter kjernen.
metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkte om kreftspesifikke aneuploide kromosomer anta en 3D- stilling i likhet med den av sine endogene homologer, noe som foreslår at en mulig korrelasjon med transkripsjonen aktivitet. Ved hjelp av 3D-FISH og konfokal laser scanning mikroskopi, viser vi at Kromosomer 7, 18, eller 19 innført via mikro-mediert kromosom overføring til foreldre diploid tykktarmskreft cellelinje DLD-en opprettholde sin konservert posisjon i interfase kjernen.
Konklusjoner
Våre data er derfor i tråd med den modellen som hvert kromosom har en tilhørende postnummer (muligens genet tetthet) som avgjør dens kjernefysiske lokalisering. Hvorvidt kjernefysiske lokalisering bestemmer eller bestemmes av transkripsjonen aktivitet av fastboende gener har ennå ikke fastslås
Citation. Sengupta K, Upender MB, Barenboim-Stapleton L, Nguyen QT, Wincovitch SM Sr, Garfield SH, et al. (2007) Kunstig Introdusert aneuploid Chromosomes Anta en konservert plassering i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 2 (2): e199. doi: 10,1371 /journal.pone.0000199
Academic Redaktør: Beth Sullivan, Duke University, USA
mottatt: 13 desember 2006; Godkjent: 12 januar 2007; Publisert: 07.02.2007
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, . Denne forskningen ble støttet av egenutført forskning program for NIH, National Cancer Institute
Konkurrerende interesser:
finansiering overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. : forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Chromosomes anta en ikke-tilfeldig og bevart posisjon i interfase kjernen av høyere eukaryoter.. Det antas at denne lokaliseringen er korrelert med deres genet tettheter. For eksempel, er genet rik Kromosom 19 hovedsakelig sentralt, mens genet dårlig Kromosom 18 er omkretsmessig plassert [1]. Et slikt mønster er bevart under evolusjonen, er vevsspesifikke [2], [3], og også opprettholdes når disse kromosomene er involvert i trans [1]. Omfattende studier på mus viser også celletypespesifikke, ikke-tilfeldige kromosom ordninger basert på størrelse [4] både genet tetthet og kromosom. Sammen tyder disse data på en funksjonell betydning av kromosom posisjonering. Imidlertid hverken grunnlag for et slikt arrangement, og heller ikke av arten av sin struktur /funksjonsforhold, har ennå blitt avslørt. Dermed gjenstår det å bli bestemt hvordan atom fordeling av kromosomer korrelerer med deres transkripsjonen aktivitet.
Ikke-arvelige former for tykktarmskreft er definert av et ikke-tilfeldig og strengt bevart mønster av kromosomale ubalanser. For eksempel, kan ekstra kopier av kromosom 7 observeres som eneste genomisk abnormitet i kolon polypper [5]. Andre aneuploidies som resulterer i kopitall gevinster av kromosomer og kromosomarmer 8q, 13q og 20, og tap av 8p, 17p, og 18q er sekvensielt kjøpt på senere stadier av tykktarmskreft progresjon, og er trofast opprettholdt i både metastatiske lesjoner og cellelinjer avledet fra de primære tumorer [5] – [7]. Gjennom bruk av global genekspresjon profilering metoder som mikromatriser, har det blitt mulig å identifisere konsekvensene av disse bemerkelsesverdig konserverte kromosom aneuploidies på kreft transkriptom. Flere nylig publiserte studier gir klare bevis på at genomisk ubalanse i svulster direkte påvirke transkripsjonsnivåer [8] – [11]
Vi har tidligere beskrevet etableringen av et unikt modellsystem for systematisk å studere konsekvensene av Aneuploidy på. cellular transkriptom. Denne modellen er basert på innføring av spesifikke kromosomer i karyotypically stabile udødeliggjorte celler eller kreftceller ved hjelp av mikro-mediert kromosom overføring. Som i primære svulster, en økning i genomisk kopiantall gitt økte gjennomsnittstranskripsjonsnivåer av gener som ligger på de aneuploide kromosomer. I tillegg ble det Aneuploidy-induserte transkripsjonen deregulering funnet å være hverken kromosom eller celletype spesifikk [12]. Dermed gjør Aneuploidy ikke ut til å målrette bare en eller noen få gener på det berørte kromosomet, men resulterer i en massiv deregulering av en stor del av den transkripsjonelt aktive gener.
I de interfase kjerner av normale og tumorceller de to homologe kromosomer anta en konservert stilling, i stor grad korrelert med deres genet tettheter [1], [13]. Deler av kromosomer som er involvert i trans ble også observert å orientere seg på en slik måte som for å lokalisere til deres iboende stillinger [1]. Vi var derfor ferien hvorvidt en kunstig innført aneuploid kromosomet var også i stand til å finne en stilling i kjernen som er lik dets endogene homologer. Dette spørsmålet, mens intrigering av seg selv, var spesielt interessant med tanke på resultatene fra vår forrige undersøkelse beskrevet ovenfor [12], noe som innebar at de innførte kromosomene var transkripsjonelt aktiv. Evnen av den innførte kromosom for å oppta et bestemt 3D plassering ville indikere atom posisjonering som en forutsetning for den Aneuploidy-induserte økning av genekspresjon. Alternativt vil unnlatelse av å lokalisere sin iboende atom plass antyde at kjernefysisk posisjonering av aneuploide kromosomer i kreftceller spiller ingen rolle i å bestemme sin transkripsjonen aktivitet.
For å identifisere posisjonen til aneuploide kromosomer i interfase kjerner, vi brukte 3D-FISH, konfokal laser scanning mikroskopi, og 3D-avstandsmålinger på DLD-1 foreldre og avledede cellelinjer som bærer ekstra kopier av kromosomer 7, 18 eller 19. fra et teleologisk perspektiv, disse eksperimentene ytterligere vår forståelse av samspillet mellom vedlikehold av kjernekraft arkitektur og genom funksjon. Dette kan påvirke måten vi i dag tenker om behandling av sykdom, spesielt i aneuploide kreftceller, der både genomisk innhold og genekspresjon har vært sterkt opprørt.
Resultater
Microcell-mediert kromosom overføring av kromosomer 7, 18 og 19
Som tidligere rapportert, var en enkelt kopi av humant kromosom 7 med hell innført i den diploide cellelinje DLD-1, for derved å generere den deriverte cellelinje DLD-1 + 7 (figur 1A) [12]. Den ytterligere kopi av denne kromosom direkte og betydelig økt gjennomsnittlig transkripsjonsnivåer av gener som befinner seg på kromosom 7 [12]. Denne økningen var lignende ved innføring av kromosomer 3 og 13 inn i DLD-1, og ble også observert når Kromosom 3 ble innført i normale bryst epitelceller [12]. Økningen i transkripsjonsnivåer er derfor uavhengig av den innførte kromosom og uavhengig av celletype. For formålet med denne studien genererte vi to ytterligere cellelinjer ved å innføre kromosom 18 eller 19 inn i DLD-1 for derved å skape de avledede cellelinjer DLD-1 + 18 og DLD-1 + 19, respektivt (figur 1A). Vi valgte disse kromosomene fordi de er av tilsvarende DNA-innhold (figur 1B), og fordi de nukleære posisjoner er distinkte og konservert: genet rik Kromosom 19 er plassert mot det indre av den kjernefysiske plass, mens genet dårlig Kromosom 18 er plassert langs atom periferien [1]
A:. Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle design. DLD-1 (foreldrecellelinje) ble utsatt for MMCT til genererte derivat cellelinjer DLD-1 + 7, DLD-1 + 18 og DLD-1 + 19. 3D-FISH ble utført på hver av de avledede cellelinjer med sonden kombinasjoner angitt. B: Tabellen viser sammenligninger av DNA innhold og genet tetthet mellom kromosom 7, 18 og 19.
Prosentandelen av celler i en gitt klon opprett trisomi for introduserte kromosom, til tross for fortsatt valg, varierte avhengig kromosomet overført og antall passeringer. Således kromosom posisjonerings målinger ble strengt begrenset til DLD-1 avledede celler som ble trisomic for den kunstig innførte kromosomet. Mens tidlig passasje kloner av DLD-1 + 3, DLD-1 + 7 og DLD-1 + 13 hadde en høy prosentandel av trisomic-celler og var i stand til å opprettholde denne frekvens i opp til 12 passasjer, ca 20% av cellene i innledende kloner av DLD-1 + 18 og DLD-1 + 19 var trisomic og dette ble ytterligere redusert på veldig tidlig passasjer.
3D Avstand Måling av Kromosom Territories
Vi urfremført dual-farge 3D-FISH på morfologisk bevart foreldre DLD-1 kjerner som skissert i figur 1A. Representative maksimal intensitet projeksjoner av konfokale bildestakker fra hver av de tre sonde kombinasjoner (18 sample- og 19, 7 18 og 7 19) er vist i figur 2, panelene A-C, respektivt. For å objektivt vurdere kromosom territorium (CT) posisjonering og for å muliggjøre en statistisk sammenligning mellom foreldrenes cellelinje og dets derivater, ble 3D-bilde rekonstruksjoner generert ved hjelp av programvare Bilde-Pro Plus (figur 3). Siden vi ønsket å ta hensyn til at ikke alle kjernene er helt sfærisk, vedtok vi en 3D-måling ordning lik som Tanabe et al. ([3] se Methods). Evnen til å oppnå disse målingene kreves tilsetning av et punkt på periferien av kjernen kolineære med det geometriske sentrum av kjernen, og det geometriske sentrum av kromosomet område (figur 3C).
Representative maksimal intensitet projeksjon av confocal bilde stabler fra DLD-1 foreldre og avledet kjerner. A-C: Foreldre DLD-1 kjerner. D: DLD-1 + 7 kjerner. E: DLD-1 + 18 kjerner. F: DLD-1 + 19 kjerner. DAPI: DNA counterstain; CT-7: kromosom 7; CT-18: kromosom 18; CT-19: kromosom 19; Flett: fusjonerte bildet av DAPI og kromosom territorier
A:. Maksimal intensitet projeksjon av en representant confocal bilde stabel med Kromosom territorier 7 (Red, Spectrum oransje) og 19 (Green, Rhodamine grønn) fra DLD -1 + 19 B: En 3D rekonstruksjon av kjernen og kromosom territorier fra bildet vist i A (XY retning). C: En ordning vedtatt for 3D-avstandsmålinger av kromosom territorier i Red (R
1 og R
2) og Grønn (G
1, G
2 og G
3) fra det geometriske sentrum av kjernen (N
c), til den atom periferien (N
P). Punkter på det kjernefysiske periferien (f.eks. N
pR
1) er utvidelser fra atom sentrum gjennom geometriske sentrum av kromosom territorium. D:. 3D rekonstruksjon i B vist i X-Z orientering
De resulterende radielle avstandsmålinger ble plottet for hvert kromosom territorium. Som sådan, opprinnelsen ved 0% representerer det geometriske sentrum av kjernen, mens den nukleære grensen er ansett 100%. Målinger av CT-18 og CT-19 i DLD-1 kjerner viser at de er plassert hovedsakelig i en radiell avstand på 70-80% (perifert) og 40-50% (sentral), henholdsvis (figur 4A). Dette bekreftet tidligere observasjoner om plassering av kromosom 18 og 19 i DLD-1 [13], og dermed godkjent våre eksperimentelle system og analytiske prosedyrer. Vi deretter utført 3D avstandsmålinger av de mellomliggende størrelse, gen dårlig kromosom 7 territorier. Våre resultater viser at CT-7 er radielt plassert i en perifer stilling omtrent 70-80% fra midten av kjernen (figur 4A). Lignende resultater ble uavhengig oppnådd ved hjelp av enten MIPAV eller Imaris programvare (data ikke vist)
Radial avstandsmåling profiler av kromosom territorier i A:. DLD-1 B: DLD-1 + 7, C: DLD-1 + 18 og D: DLD-1 + 19. X-akse: radielle avstand (%); Y-akse: Frekvens (%); 0 eller opprinnelse: midt i kjernen; 100%: atom periferien; Red: kromosom 7; Grønn: kromosom 19; Blå: kromosom 18.
Etter å ha bestemt posisjonene Kromosomer 7, 18 og 19 territorier i DLD-en, analyserte vi plasseringen av disse kromosom territorier i kjernen av de tre avledede cellelinjer (figur 2D -F). I alle tilfeller dual-color 3D-FISH ble utført i ulike merking kombinasjoner. Vår analyse av 3D avstandsmålinger for de tre kromosom 7 territorier i DLD-1 + 7 viste at de antok en perifer posisjon i kjernen på en radial avstand på 70-80%, mye som i foreldre celler (figur 4B). En sammenligning av medianverdiene for de radiale avstandsprofiler mellom DLD-1 og DLD-1 + 7 (73,9 og 73,35, respektivt) viser at de er nesten identisk med et avvik (Δ
M = -0,55) som ikke var statistisk signifikant som vist ved Mann-Whitney-Wilcoxon test (P = 0,6811) (tabell 1, figur 5)
Rå distribusjoner av 3D-avstandsmålinger.. CT-7 i DLD-1 DLD-1 + 7, CT-18 i DLD-1 DLD-1 + 18, CT-19 i DLD-1 DLD-1 + 19. X-aksen: cellelinje, Y-aksen. Normalisert radial avstand (%) av kromosom territorier fra det geometriske sentrum av kjernen
3D avstandsmålinger ble også utført for kromosom 18 i DLD-1 + 18, avslører at de tre kromosom 18 territorier er plassert på en radial avstand på 80-90% (Tall 2E og 4C). Medianradialavstandsverdiene var sammenlignbare i foreldre og avledet kjerner (henholdsvis 72,69 og 74,07,, Δ
M = 1,38) og var fast bestemt på ikke å være vesentlig annerledes ved Mann-Whitney-Wilcoxon test (P = 0,7820) (tabell 1, figur 5)
til slutt bestemte vi den kjernefysiske posisjon av kromosom 19, som lå sentralt i foreldre DLD-1 celler.. 3D rekonstruksjoner og avstandsmålinger viser at de tre kromosom 19 territorier i DLD-1 + 19 var sentralt plassert i kjernen på en radial avstand på 50-60%, tilsvarende deres posisjon i foreldrenes cellelinje (51.73 og 55.02, henholdsvis) (Tall 2F og 4D). Igjen, forskjellen i medianverdiene var ikke statistisk signifikant (Δ
M = 3,29, P = 0,2677) (tabell 1; figur 5). Våre studier viser derfor at aneuploide kromosomer innført via mikrocelle-medierte kromosom overføring anta en konservert 3D-posisjon i kjernen kan skjelnes fra deres endogene homologer.
Som nevnt ovenfor, utførte vi dual-farge hybridiseringer med to forskjellige kromosom male prober i kombinasjonene som er beskrevet i figur 1A. Vi var derfor ikke bare i stand til å vurdere den stilling av de innførte, aneuploide kromosomer, men også til å spørre hvorvidt denne Aneuploidy hadde noen innvirkning på den kjernefysiske stilling av andre kromosompar. Ved innføring av en ekstra kopi av kromosom 7, ble det observert en tendens for CT-18 og CT-19 til å bli forskjøvet til en mer indre stilling (Δ
M = -5,59 og Δ
M = -3,02, respektivt ). Disse skift, imidlertid, til tross for at mye større enn de som ble sett i de andre avledede cellelinjer, ikke nådde statistisk signifikant nivå (P = 0,0523 og P = 0,0688, henholdsvis) (tabell 1). En mulig forklaring kan være at de prosent avstandsmålinger for CT-18 og CT-19 i DLD-1 + 7 hadde en bimodal fordeling og en avslapning av kromosom posisjonering. Graden av spredning som beregnes ved bruk av vektet gjennomsnitt-Inter kvartil Range (IQR) var 23,84 og 21,08 (for CT-18 og CT-19, henholdsvis) sammenlignet med 11,90 for kromosom 7 (figur 4B). Innføringen av Kromosom 18 hadde ingen effekt på posisjonen av de to kromosom 7 områder som de holdt seg på en perifer posisjon på 70-80% og som sådan median radiale avstandsverdier ikke viser en betydelig endring i posisjon (P = 0,4216) . Men de to Kromosom 19 områder ble nok en gang forskjøvet mer sentralt med en radiell avstand på ~40% i forhold til ~55% i DLD-1 kjerner (figur 4C). Mann-Whitney-Wilcoxon test viste at Δ
M = -8,19 var statistisk signifikant (p = 0,0307). Sammenligningen av middel radial avstandsverdier av CT-7 i DLD-1 + 19, antydet at plasseringen av dette kromosomet var signifikant forskjøvet (P = 0,0299) mot periferien (73,90 og 77,52; Δ
M = + 3,62). I tillegg ble kromosom 18 territorier betydelig skiftet til en mer intern stilling (72,69 og 66,65; Δ
M = -6,04, p = 0,0257)
Diskusjoner
Den systematiske utforskning av. konsekvensene av kromosomale aneuploidies på genekspresjonsprofiler har vist at en direkte sammenheng mellom genomiske kopi tall og transkripsjonsnivåer [8], [10], [14], [15]. For å generere et modellsystem av kromosomal Aneuploidy, anvendte vi mikrocelle-mediert overføring kromosom for å innføre spesifikke kromosomer til karyotypically stabile celler [12]. Resultatene bekreftet tidligere observasjoner i primære svulster og kreft cellelinjer, viser en direkte innvirkning på kromosom Aneuploidy på bosatt genuttrykk nivåer. Dette tillot oss å studere sammenhengen mellom Aneuploidy og genuttrykk uavhengig av andre cytogenetiske abnormiteter vanligvis observert i kreft genomer. Etter å ha fastslått at den generasjonen av kunstige trisomier resulterte i en betydelig økning i gjennomsnittstranskripsjonsnivåer av gener på disse aneuploide kromosomer, var vi nå nysgjerrig på om de antar en konservert posisjon i interfase kjernen. Dette er et viktig spørsmål fordi det er fast bevis for at innfødte, endogene pattedyr kromosomer okkupere spesifikke, konservert 3D posisjoner [3]. For eksempel blir genet rik Kromosom 19 lokalisert mer sentralt, mens genet dårlig Kromosom 18 områder er plassert mer mot periferien av kjernen [1]. Det er derfor rimelig å anta en funksjonell relevans av denne strukturelle bevaring og, som en forlengelse av dette, et forhold mellom 3D-arkitektur og transkripsjonelle aktivitet. Med sikte på å bestemme om den økte genekspresjon korrelerer med plasseringen av det innførte kromosomet til sin konservert kjerneområder (som innvendig for kromosom 19, og omkrets for kromosom 18), utførte vi 3D-FISH på tre stammer cellelinjer trisomic for kromosomer til 7, 18 eller 19. DNA-reparasjons mismatch mangelfull tykktarmskreft cellelinje DLD-1 ble anvendt som mottaker cellelinje. Denne cellelinje, som er andre med mikro ustabilitet, er karyotypically stabil og diploid. Dette er en fordel fordi plasseringen av introduserte kromosomer kan vurderes uten potensielle konfunderende effekter fra andre kromosomavvik. Her kan vi rapportere at en kunstig innført aneuploid kromosom forutsetter en ikke-tilfeldig og konservert 3D posisjon i interfase kjernen som tilsvarer lokalisering av de andre to endogene homologer.
Lokalisering av kromosom 7, 18 og 19 territorier
Vår analyse av kromosom territorier i DLD-en viste at CT-18 og CT-19 var overveiende perifer og sentral, henholdsvis, og dermed bekreftende tidligere observasjoner i denne cellelinjen [13]. Av notatet, Cremer et al. rapporterte en mindre forskjell i den gjennomsnittlige radielle avstanden mellom CT-18 og CT-19 i DLD-1 kjerner (~7.9%) og andre tumorcellekjerner, mens vår analyse viste ~18.4% forskjell mellom gjennomsnittene av de radiale avstandsmålinger av CT -18 og CT-19. Men begge studiene klart fastslått at kromosom 19 er plassert mer mot det indre av kjernen i forhold til kromosom 18. Vi viser også at genet dårlig kromosom 7 er hovedsakelig perifert i DLD-1, ytterligere støtte for et gen densitet basert kromosom posisjonering mønster i både normale og svulst kjerner (figur 4A) [13], [16].
det primære målet med denne studien var å vurdere den relative posisjonering av kunstig innført trisomic kromosom i forhold til sine endogene homologer i alle tre derivater cellelinjer. Vi var imidlertid ute av stand til å produsere et robust signal med et neomycin FISH sonde som vil utvetydig betegne den innførte kromosom, som er merket med dette selekterbar markør (data ikke vist). Dette var imidlertid ikke et stort hinder siden vår statistisk analyse ikke avsløre noen signifikante forskjeller mellom lokalisering av noen av de tre kromosom eksemplarer. For eksempel, alle av kromosom 7 territorier i DLD-1 + 7 anta en forholdsvis perifer posisjon i kjernen (figur 4B). Et lignende resultat ble oppnådd for 18 (perifere) og 19 (sentral) kromosom områder i kjernen til sine respektive trisomic cellelinjer (figur 4, paneler C og D). Således synes det å være en mekanisme hvorved den kunstig innførte trisomic kromosomer lokalisere til deres iboende konservert 3D atomposisjon.
A fremdeles uforklarlig funn var statistisk signifikant, men subtil forskyvning i midtstilling av kromosom 19 i DLD-1 + 18-celler (tabell 1). I tillegg er den midlere radiale avstand mellom CT-18 og CT-19 økte fra 18,4% til 22,69% i disse kjerner. Man kan tenke seg at ekstra kromosomer opptar perifere stillinger som Kromosomer 7 eller 18 kan føre til kromosom 19 for å innta en enda mer sentral posisjon. Argumenterer mot dette resonnement er det faktum at CT-19 forskyvning i DLD-1 + 7 celler var ikke signifikant (Tabell 1). I tillegg, i DLD-1 + 19, CT-7 forskyves til en mer perifer stilling mens CT-18 er forskjøvet til en betydelig mer indre stilling, noe som resulterer i en mindre forskjell i de midlere avstander mellom CT-18 og CT-19 ( ~11.37%). Således, mens det er relativt enkelt å forstå at tillegg av ekstra kromosom områder inn i en fysisk begrenset plass, slik som kjernen ville ha potensial til å indusere endringer i plasseringen av de andre kromosomer, hvilken bestemmer retningen på at skift er ikke selv -evident. Det vil være interessant å finne ut hvordan disse effektene blir forsterket i aneuploide kreftceller som ofte inneholder langt mer enn bare en numerisk avvik som i vår modell system. Dette kan muligens være en ekstra faktor i å forklare den enorme kompleksiteten av genet deregulering i kreft transkriptomet.
Vi har også observert en bimodal fordeling av kromosom territorier, særlig i de avledede cellelinjer (fig. 4A). For eksempel, i en populasjon av DLD-1 kjerner (~6-8%), CT-18 inntatt en mer innvendig stilling som gjenspeiles i en topp ved en radial avstand på -50% fra sentrum av kjernen. Grundig analyse av rådata ikke tyder på at dette bimodalitet var en refleksjon av en kromosom territorium i hver kjerne oppfører annerledes (f.eks innført kromosom), men heller at det i enkelte celler alle tre områder var mer sentral eller perifer i forhold til gjennomsnittet . Mens den relative posisjonen til kromosom 18 og 19 områder er konservert i et bredt spekter av celletyper, kan graden av denne bevaring variere. For eksempel, noen kreft kjerner viste også en reduksjon i den normale radiale fordelingsmønsteret for CT-18 og CT-19 sammenlignet med normale celler. Dette er spesielt tydelig for kjerner av aneuploid tykktarmskreft cellelinje SW480, hvor CT-18 og 19 er ganske tett plassert [13], noe som tyder på at fremkalle aneuploidi eller ekstra kromosom gevinster kan påvirke genet tetthet basert radial fordeling av kromosomer.
En spekulativ mekanisme av kromosom posisjonering
det er nå klart fastslått at posisjoneringen av kromosom områder innen 3D-plassen på inter kjernen er ikke tilfeldig. Denne fordelingen er konservert på tvers av forskjellige vev, både normale og ondartede, så vel som evolusjonært tvers av avvikende art [2], [3]. Forsøkene utført i denne studien nå viser at denne ikke-tilfeldig og konservert nukleære lokaliserings strekker seg også til kunstig innført, aneuploide kromosomer. Dermed en så høy grad av bevaring gir seg til ideen om at det må være noen biologisk implikasjon for plassering av kromosom territorier. Men hvordan er funksjonell reorganisering av kjernen etablert på reformasjon av kjernen etter mitose? Kan et slikt fenomen forklares mekanistisk
For å gjenta fakta:? Kromosomer med en relativt høy gen tetthet okkupere en mer sentral posisjon mens genet fattige kromosomer tendens til å være lokalisert nærmere atom periferien [1]. Det er også sant at genet rik kromosomer har en høyere G-C-innhold. Dette kan delvis reflektere tilstedeværelse av CpG øyer i gen-promotorer, så vel som det meste av G-C-rike repeterende elementer som Alu-sekvenser som er sammenfallende med kodende regioner av genomet. I fibroblaster, ble for eksempel en forbedret farging av Alu-sekvenser som finnes i den kjernefysiske indre [17]. Motsatt, er den kjernefysiske periferien anriket for heterochromatin, som har en tendens til å være mer A-T-rikt. Det er velkjent at atom lamins er kritiske for reformasjon av kjernen etter mitose. Lamins har også blitt vist å interagere gjennom spesifikke sekvenser i deres haledomene med kromatin og spesielt med to av kjerne histoner H2A og H2B [18], [19]. Økt nærvær av denaturert histoner, slik som tri-H3K27, er blitt observert i nærheten av atom periferien [20]. Således kan lamins og variasjoner i nucleosome sammensetning og /eller modifikasjoner spille en rolle i den ikke-tilfeldig plassering av visse kromosom områder i nærheten av den nukleære membranen.
Hva mulig faktorer kan være ansvarlig for å etablere de ovenfor angitte funksjoner i atom arkitektur, spesielt med hensyn til posisjoneringen av de enkelte kromosom områder? Kanskje den mest intuitive modellen er en hvor hvert kromosom er identifisert av en unik «zip-koden» som bestemmer hvor den vil ligge i kjernen. Et slikt kjennetegn kan være de unike sekvensene som finnes i centromeric eller pericentromeric region av hver homolog. Denne hypotese kan bli testet eksperimentelt ved å flytte disse sekvenser fra en kromosomet til en annen. Heldigvis oppstår slike hendelser naturlig via translokasjon. For eksempel inneholder kreftcellelinjen SW620 en der (18) t (17; 18) i hvilken materiale fra genet rike Kromosom 17 er translokert til centinneholdende gen-fattig kromosom 18. Til tross for inneholdende det Kromosom 18 centromeren, dette derivat kromosomet opptar en radial lokalisering i likhet med det normale kromosom 17 [13]. Denne studien tyder derfor på at kromosom spesifikke sentromerer er ikke den viktigste determinant av kromosom posisjonering og peker mer mot materialet som finnes i kromosom armene.
Et alternativ til en centspesifikke «zip-code» sekvens ville være en der en ganske generell funksjon av hvert kromosom er ansvarlig for å plassere den i, eller ekskludere dem fra visse kjernefysiske regioner. I en slik modell blir det viktig for å forklare hvordan funksjoner som genet tettheten, nukleotid- sammensetning (G-C versus A-T-innhold), DNA og histonmodifikasjonene eller transkripsjonen aktivitet blir avfølt av den gjendannende kjerne og blir brukt til å etablere posisjonering. Siden hver av disse funksjonene er til stede i ulik grad på hver kromosom, blir plasseringen av territorier mer probabilistic enn definitive. Dette er i tråd med våre eksperimentelle observasjonene (figur 4).
Som et eksempel, foreslår vi følgende scenario som en mulig mekanisme for å etablere interatom arkitektur. Ikke-transkriberte, gen-fattige områder av genomet tendens til å være mer heterochromatic, som hovedsakelig er A-T-rikt. Heterochromatin er etablert gjennom en kombinasjon av DNA og histonmodifikasjonene som er kjent for å korrelere med transkripsjonen inaktivitet. Dermed vil en høyere absolutte antall eller konsentrasjonen av modifiserte nukleosomer, for eksempel tri-H3K27, kan gjøre det mer sannsynlig for et gen-fattig kromosom for å bli fanget av lamins festet til innsiden av reformeringskjernemembranen. Man kunne da postulere at som standard, unsnared G-C rik, genet rik, transcriptionally aktive kromosomene ville ha en tendens til å bli ekskludert fra atom periferien og dermed er løst for å okkupere en mer sentral kjernefysisk posisjon. I denne selvorganiserende system, lokalisering av genet rike sekvenser i sentrum av kjernen er ikke så mye drivkraften, men snarere sluttresultatet av atom reformasjon etter mitose. Andre har satt frem en selvorganiserende modell, karakterisert ved at den kollektive transkripsjonen aktivitet av genomet har blitt foreslått for å diktere atomarkitektur basert på de fysiske egenskapene til kromatin og samvirkende polymeraser [21]. Siden det er sannsynlig at det er svært lite pågående transkripsjon i mitotisk kondensert kromosomer, ville vi posit at den ikke er aktiv transkripsjon per se som bestemmer arkitekturen på atom reformasjon, men heller merkingen av tidligere transcriptionally aktive eller inaktive regioner som DNA og histonmodifikasjonene.
Gene rike kromosomene også transkribert mer aktivt. Genome-wide analyse av mRNA uttrykk profiler av det menneskelige genom viser at genet tette regioner sterkt korrelert med områder med øket Gene Expression (rygger) [22], [23]. Dette ville kreve oppformering eller en gradient av økende konsentrasjon av transkripsjonsfaktorer eller fabrikker mot atom sentrum hvor det er flere transkripsjonelle aktivitet. Det ville være interessant å finne ut om slike gradienter faktisk eksisterer i kjernen. Hvis det er en gradient, er det grunn for den ikke-tilfeldig fordeling av kromosomene eller er det fastslått som respons på et slikt atom arkitektur? Hvis en gradient ikke finnes, er ensartet konsentrasjon av transkripsjonsfaktorer som begrenser i genet rike områder av kjernen med høy transkripsjonen aktivitet? Er faktorene i den kjernefysiske interiøret mer transcriptionally engasjert enn de mot periferien? Har høyere konsentrasjon av heterochromatin i den kjernefysiske periferien begrense ikke bare tilgjengeligheten av transkripsjonsfaktorer til kromatin, men også hemme deres evne til å krysse det indre av kromosom territorier?
