Abstract
Bakgrunn
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en heterogen gruppe av lidelser med en rekke genetiske og proteomic forandringer. c-CBL er et E3 ubiquitin-ligase og adaptermolekyl viktig i normal homeostase og kreft. Vi bestemte genetiske varianter av c-
CBL
, forholdet til reseptor tyrosin kinaser (EGFR og MET), og funksjonalitet i NSCLC.
Metoder og funn
Ved hjelp av arkiv formalin -Fast parafin innebygd (FFPE) hentet genomisk DNA, viser vi at c-CBL mutasjoner forekommer i somatisk mote for lungekrefttilfellene. c-CBL mutasjoner var ikke gjensidig utelukkende fra MET eller EGFR mutasjoner; men de var uavhengige av p53 og KRAS-mutasjoner. I normal /svulst parvise analyse, var det betydelig tap av heterozygositet (LOH) for c-
CBL
locus (22%, n = 8/37), og ingen av disse prøvene viste noen mutasjon i den gjenværende kopien av c-CBL. Den c-
CBL
LOH også positivt korrelert med EGFR og møtte mutasjoner observert i de samme prøvene. Bruke velger c-CBL somatiske mutasjoner som S80N /H94Y, Q249E og W802 (hentet fra kaukasisk, taiwanske og afrikansk-amerikanske prøver, henholdsvis) transfektert i NSCLC cellelinjer, ble det økt celle levedyktighet og cellemotilitet.
Konklusjoner
Ta den samlede mutasjonsraten av c-CBL å være en kombinasjon som somatisk missense mutasjon og LOH, er det klart at c-CBL er sterkt mutert i lungekreft og kan spille en viktig rolle i lunge tumorigenesis og metastase
Citation. Tan Y-HC, Krishnaswamy S, Nandi S, Kanteti R, Vora S, Onel K, et al. (2010) CBL ofte Altered i lungekrefttilfellene: forholdet til Mutasjoner i MET og EGFR tyrosin kinaser. PLoS ONE 5 (1): e8972. doi: 10,1371 /journal.pone.0008972
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA
mottatt: 28 oktober 2009; Godkjent: 09.01.2010; Publisert: 29 januar 2010
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. støttet av National Institutes of Health (NIH) /National Cancer Institute (NCI) Stipend: 5RO1CA125541-03, 3RO1CA125541-03S109 , 5RO1CA129501-02, 3RO1CA129501-02S109, 1R21CA140003-01, MARF, V-stiftelsen, Cancer Research Foundation og amerikansk Respiratory Health Association of America (RS) og gi NSC96-2628-B-006-048-My3 fra National Science Council , Taiwan. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research. Innlåns agenices hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
i USA alene, hvert år ca 219,400 mennesker er diagnostisert med lungekreft, hvorav mer enn 145 000 av dem bukke for sykdommen [1]. Dette tallet er omtrent tilsvarer de samlede dødelighet av kreft i bryst, prostata, tykktarm, lever, nyre og føflekkreft [1]. I tillegg prognosen er vanligvis dårlig og fem-års overlevelse er mindre enn 15%. Det er også betydelige etniske forskjeller for lungekreft, og resultatet er verre for svarte i forhold til hvite. Kjønnsforskjellene er også slående med kvinner som har betydelig bedre prognose i forhold til menn. Det finnes en rekke genetiske endringer som kan forekomme i lungekreft. Som et eksempel, i NSCLC, mutasjoner i KRAS, p53, EGFR og MET er identifisert. Mange av disse banene, spesielt reseptortyrosinkinaser (RTK) styres av c-CBL.
CBL plakater (Casitas B-avstamning lymfom) er et pattedyr genet ligger på menneskelig kromosom 11q23.3 [2] og er involvert i celle signalisering og protein ubiquitinering [3]. CBL proteiner tilhører den ringfingeren klasse av ubiquitin ligaser (E3) og det er tre homologer
c-CBL
,
CBL-b
,
CBL-3 product: [4 ].
c-CBL Hotell og
CBL-b
gener er overalt uttrykkes med de høyeste nivåene i blodkreft vev [5].
c
-CBL består av fire regioner som koder for funksjonelt distinkte proteindomener: den N-terminale tyrosin kinase binding (TKB) domene, det linkerområde, det katalytiske ringfingeren domene, det prolin-rik region og c terminale ubiquitin-forbundet (UBA) domene som også overlapper med en leucin-glidelås (LZ) domene [3]. Begge TKB og ringfinger domener er avgjørende for ligand-induserte ubiquitinering av RTK [6], [7], [8], [9]. Ringfingeren domenet er nødvendig for rekruttering av E2 ubiquitin-konjugering enzymer. Den TKB domene omfatter fire heliksbunt (4H), et kalsium-biding EF hånd, og en modifisert SH2 domene, som binder seg til fosfotyrosin-rester [3], [10], [11], [12]. I tillegg kan prolin-rik region av c-CBL forbinder med SH3-domenet av GRB2, som indirekte kan rekruttere c-CBL til RTK’er via GRB2 adapteren proteinet [7], [13], [14].
c-CBL også binder seg til EGFR og fungerer som E3 som er rettet mot EGFR for ubiquitinering og degradering. Videre desensitizes CBL EGF signalering og motsetter cellulær proliferasjon indusert av EGF [15]. EGF-aktivering vises også til å aktivere den tyrosinkinase-SRC, som fosforylerer c-CBL, og i sin tur aktiverer ubiquitinering og nedbrytning av EGFR [16], [17], [18]. En fersk studie viser at defekte endocytose av EGFR er preget av en sletting mutant og punktmutasjon L858R, der tilknytningen til c-CBL og påfølgende ubiquitinering er svekket [19]. Nylig ble de første menneskelige c-CBL mutasjoner rapportert i akutt myelogen leukemi (AML) pasienter [20]. Mutasjonen R420Q hemmer FMS-lignende tyrosinkinase 3 (FLT3) internalisering og ubiquitinering [20].
Ikke bare kan E3 aktivitet være viktig i onkogenese, har c-CBL en dobbel, men egen funksjon som et signal transduksjon molekyl . Vi har tidligere vist at c-CBL er viktig i binding CRKL og BCR /ABL i hematopoetiske celler. Dessuten kan det binde og modulere funksjoner av cytoskjelettet ved å bindes til proteiner som talin og paxillin. Den TKB domene er viktig i binding til en rekke molekyler, og de blir funksjon i signaltransduksjon.
Gitt den kritiske rolle av CBL i normal homeostase og kreft, vi en hypotese at det kan være mutert i lunge cancer. I denne studien rapporterer vi nye c-CBL somatiske mutasjoner S80N /H94Y, Q249E og W802 * i kaukasiske, taiwanske og afrikansk-amerikanske lungekreftpasienter, henholdsvis. Uttrykke disse mutasjoner i NSCLC cellelinjer føre til økt spredning og cellemotilitet. Vi viser at c-CBL mutasjoner oppstå med eller uten MET eller EGFR mutasjoner, men er gjensidig utelukkende av en LOH på c-
CBL
locus. I tillegg c-
CBL
LOH er tilknyttet enten MET eller EGFR mutasjoner. Vi hypoteser dermed at c-CBL mutasjoner kan bidra til onkogene potensialet i MET og EGFR i lungekreft.
Metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig samtykke på all forskning på menneskelig fagene er innhentet fra Institutional Review Board, University of Chicago og dekker all forskning utført i laboratoriet. Følgende er deres kontaktinformasjon: Institutional Review Board, The University of Chicago, McGiffert Hall, 5751 S. Woodlawn Ave., 2. etasje, Chicago, IL 60637. Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle pasienter med vevsprøver ble brukt i denne studien .
vevsprøver
Lungekreft vev og sammenkoblede tilstøtende normale lungevev ble hentet fra 50 kaukasiske, 29 afrikansk-amerikanere og 40 taiwanske NSCLC pasienter som ble rekruttert ved University of Chicago Hospital (Chicago , USA) (kaukasiske og afrikansk-amerikanske pasienter) og Taipei Veterans General Hospital i Taiwan (taiwanske pasienter) etter å ha fått passende Institutional Review Board tillatelse og informert samtykke fra pasientene. Ut av 119 prøver, 77 var menn, 38 kvinner og fire var ukjent med alder ved diagnose som strekker seg fra 47 til 90 år. I form av tumortyper, 53 var adenokarsinom, 32 var plateepitelkarsinom og 34 var store cellekreft. 49 ble stadium I, 14 var stadium II, 34 var stadium III, og 13 var stadium IV (tabell S1).
Cell Culture
Menneskelig ikke-småcellet lungekreft celler A549 og H358 ble opprettholdt i DMEM og RPMI-1640, respektivt. Humane embryoniske nyre 293T-celler ble dyrket i DMEM. Media ble supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
c-
CBL
Gene mutasjonsanalyse
Eksoner 2-16 av c –
CBL
genet ble individuelt amplifisert ved polymerasekjedereaksjon (PCR). Grunning er oppført i tabell S2. PCR-betingelsene var en syklus på 95 ° C i 5 minutter; 35 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 minutter; og en syklus på 72 ° C i 10 minutter. PCR produktene ble behandlet med ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, OH) og sekvensert av Big-Dye Terminator Chemistry (Applied Biosystems, Foster City, California). Sekvensering ble utført på fremover kodende tråden med bekreftelse av
c-CBL
endringer utført ved å sekvensere motsatt tråd også. Kromatogrammene ble analysert for mutasjoner ved hjelp Mutation Surveyor v2.61 (Softgenetics, State College, PA).
Plasmid konstruerer og seterettet mutagenese
Den villtype c-
CBL
cDNA innskudd ble subklonet inn i pAlterMax ekspresjonsvektoren ved hjelp av
Xho
jeg og
Sal
jeg restriksjonsenzymseter (Promega, Madison, WI). Ved hjelp av denne foreldre plasmid pAlterMax-c-
CBL
, den TKB domenedobbeltmutasjon (S80N /H94Y), den punktmutasjon (Q249E), og C-terminal punktmutasjon W802 * av c-
CBL
ble opprettet ved hjelp av følgende primere: 5′-GCTGGCGCTAAAGAATAACCCACCTTATATCTTAGAC-3 «og 5′-CTACCAGATACCTACCAGTATCTCCGTACTATCTTGTC-3′ for den doble mutasjon S80N /H94Y; 5»-CTTTACCCGACTCTTTGAGCCCTGGTCCTCTTTGC-3 «for Q249E, og 5′-CAGCTCCTCCTTTGGCTGATTGTCTCTGGATGGTGATC-3» for W802 * sammen med sine utfyllende primere med Quickchange seterettet mutagenese XL kit (Stratagene, La Jolla, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Konstruksjonene ble bekreftet for punktmutasjoner av standard DNA-sekvensering av begge trådene.
Tap av heterozygositet (LOH) Analyse
Fem mikro på kromosom 11 (3 på 11q på eller innen 200 kb opp eller nedstrøms for c-
CBL
-genet og 2 kontrollpunkt markører på 11 p) ble valgt for analyse (tabell S3). Etablerte mikro markører og respektive primer sekvenser ble valgt fra GeneLoc database (https://genecards.weizmann.ac.il/geneloc/index.shtml, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Primere ble utformet og tilpasset hver forover primer ble fluorescensmerkede i 5′-enden med FAM, PET, NED, eller VIC (Applied Biosystems). Primersammensmeltning temperaturer og duplex score ble evaluert med NIST Primer Tools (https://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD). Primere ble bekreftet ved å utføre PCR med kontroll-DNA (isolert fra TK6 celler) og løse produkter på agarosegeler. Bånd ble visualisert med en UV transilluminator. Genomisk DNA ble ekstrahert fra tumorprøver og sammenkoblet normalt lungevev. Primere ble gruppert i multiplex kombinasjoner vist i tabell S4. Marker D11S929 fungerte som en intern kontroll for å sjekke konsistens i PCR og topper fra kapillær elektroforese. Multiplex PCR ble utført i et volum på 10 ul som inneholdt 1 pl genomisk DNA (20-50 ng), 0,5 uM av hver primer (1,0 uM total for hvert primer-par), 400 uM dNTP, 1 x PCR-buffer inneholdende MgCl
2, og 0,2 U
Taq
DNA polymerase. PCR ble utført på ABI GeneAmp 9700 PCR System under følgende betingelser: 5 minutter ved 94 ° C; 30 sykluser på 30 sek ved 94 ° C, 1 minutt ved 60 ° C, 1 minutt ved 72 ° C; og 5 min ved 72 ° C. PCR-produktene ble separert ved kapillær elektroforese på en ABI 3130XL DNA Analyzer. Kromatogrammene ble analysert med Peak Scanner 1.0 og GeneMapper 3.7 programvare (Applied Biosystems) for allele endringer. Arealet av toppene som frembringes av DNA PCR-produkter ble kvantifisert for hvert allel. Forholdet mellom de alleliske områder ble beregnet for hver tumor og normal sammenkoblet DNA-prøve. Når qLOH (alleliske forhold for tumor-topper dividert med alleliske forholdet mellom paret normal prøve) ble ≤0.5 eller ≥2.0 for c-
CBL
og minst en annen 11q markør i det minste i to separate forsøk prøven ble ansett som å ha en allelisk ubalanse og tolket som LOH. Prøvene ble evaluert i minst to separate eksperimenter og eksempler som viser potensielle LOH på c-
CBL
gjentas en tredje gang som inkluderte en ny kontroll markør på
BAX
locus (data ikke vist) på kromosom 19 for å verifisere integriteten til prøve-DNA.
Transfeksjon av c-
CBL
konstruerer
A549-cellelinjen ble transfektert med Fugene HD (Roche, Nutley, NJ) reagensrom i henhold til produsentens instruksjoner. Åtte pg av plasmid DNA, som inneholder enten ingen innsats (tom vektor), villtype c-
CBL
, S80N /H94Y c-
CBL, etter Q249E c-
CBL
eller W802 *
CBL
ble anvendt for transfeksjon i en 6-brønners kulturplate. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon og analysert for uttrykket.
c-
CBL
knockdown
c-
CBL
knockdown ble utført ved hjelp lentiviral transduksjon hjelp MISSION lentiviral transduksjon partikler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i henhold til produsentens anvisninger. Kort, 1 × 10
5 H358 celler /brønn ble sådd i 6-brønners plater og infiserte neste dag med c-
CBL
lentiviral shRNA konstruerer. For å generere stabile c-CBL-knockdown cellelinjer ble celler valgt i 2 dager med 1 ug /ml puromycin. c-CBL nivåer ble bestemt ved hjelp av helcellelysater ved immunoblotting med anti-CBL antistoff (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, California).
celleviabilitet analysen
Celler ble transfektert som beskrevet ovenfor i transfeksjon analysen. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble levedyktighet av celler vurdert ved hjelp av trypanblått eksklusjon.
sårtilheling analysen
A549 celler ble sådd i 6-brønners plater og dyrket i 48 timer inntil 100% konfluent . Mediet ble deretter forandret, og cellene ble transfektert som beskrevet i transfeksjon analysen. Tolv timer etter transfeksjon, ble en rett ripe gjort på tvers av cellelaget ved anvendelse av en 1 ml pipette. Cellene ble deretter forsiktig vasket med 1 x PBS for å fjerne cellulært avfall og mediet ble byttet ut. Bildene ble tatt av Sårområdet hver 12. time inntil 48 timer.
Western Blot analyse
førtiåtte timer etter transfeksjon ble cellene samlet og vasket to ganger i 1 x PBS, deretter lysert i is- kald lyseringsbuffer (0,5 M Tris-HCl med pH 7,4, 1,5 M NaCl, 2,5% deoksykolsyre, 10 mM EDTA, 10% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 5 ug /ml leupeptin og 10 pg /ml aprotinin) i 5 minutter. Lysatet ble sentrifugert ved 13000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C, og proteininnholdet i supernatanten ble målt. Totale cellelysater (50 ug /brønn) ble separert ved SDS-PAGE elektroforese og gelene overført på nitrocellulosemembraner (Whatman, Piscataway, NJ). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fett tørrmelk i fosfatbufret saltvann inneholdende Tween-20 (PBST) (1 x PBS, 0,1% Tween-20) i 1 time ved romtemperatur og inkubert med det passende primære antistoff ved 4 ° C over natten. Membraner ble deretter vasket tre ganger med PBST og probet med passende pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble igjen vasket tre ganger i PBST og båndene ble visualisert ved hjelp av Western blot-kjemiluminescens-reagens (BioRad, Valencia, CA) på en Chemidoc Gel dokumentasjonssystem (BioRad, Valencia, CA). Antistoffer ble innhentet fra Santa Cruz Bioteknologi og brukes på følgende fortynninger (c-CBL, 1:5000, c-MET, 1:5000; EGFR, 1:5000; ubiquitin, 1:1000, HA, 1:5000 og p- aktin, 1:10,000).
flowcytometrisystemer
Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP analyse ble utført av flowcytometri. Omtrent 2 x 10
6-celler ble dyrket i medium inneholdende 10% FBS. Cellene ble høstet ved trypsin /EDTA-behandling, vasket med 1 x PBS tre ganger, og fiksert med iskald 70% etanol i 2 timer. Cellene ble vasket en gang med kald PBS og farget med en oppløsning inneholdende 25 ug /ml propidiumjodid, 200 ug /ml RNase A, og 0,1% Triton X-100 i 30 minutter i mørket. Cellesyklus analyse ble utført ved hjelp av en Guava PCA-96 flowcytometer (Guava Technologies, Millipore, Bille, MA).
Ubiquitin ligaseaktivitet
293T celler ble holdt i kultur i DMEM supplert med 10 % FBS og 1% penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml) ble transfektert med 0,2 ug EGFR-pcDNA3 og 2 ug HA-merket c-
CBL
-konstruksjoner som antydet ved hjelp av kalsiumfosfat i henhold til produsentens protokoll (Profection, Promega, Madison, WI). Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene sultet over natten i DMEM supplert med 0,5% FBS, og deretter behandlet med eller uten EGF (100 ng /ml) i 15 min. Cellene ble samlet opp og vasket to ganger i iskald PBS inneholdende 0,2 mM natriumortovanadat deretter lysert i iskald lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X100, 10% glyserol, 2 mM natriumortovanadat og proteaseinhibitorer). Lysater ble tømt for avfall ved sentrifugering ved 16 000 g i 10 min ved 4 ° C. EGFR immunoutfellinger ble utført på 200 ug av klarede lysat ved anvendelse av 250 ng av kanin-anti-EGFR og protein A /G Plus Sepharose over natten ved 4 ° C. Utfellinger ble vasket 5 ganger i lyseringsbuffer før koking i Laemmli-buffer. Elueringer ble immunoblottet med anti-ubiquitin og EGFR. Tjue mikrogram ryddet lysat ble immunblottet for hver av c-
CBL
konstruerer ved hjelp av anti-HA.
Statistical Analysis
mutasjon priser mellom ulike grupper ble sammenliknet med Fishers eksakte test. For kontinuerlige variabler, ble gruppesammenligninger utført ved anvendelse av variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Sidak s justering for multiple sammenligninger. Forsøk med gjentatte målinger over tid ble analysert ved hjelp av gjentatte målinger ANOVA med Greenhouse-Geisser justering av frihetsgrader. Analysene ble utført ved bruk av STATA (v10.1) programvare (Stata Corporation, College Station, TX).
Resultater
c-
CBL
genmutasjoner i Lung Cancer
for å undersøke hvilken rolle c-
CBL
i lungekreft, analyserte vi den genomiske DNA i svulsten og sammenkoblede normale prøver hentet fra flere etnisiteter. Lunge tumorprøver representert kaukasiere (n = 50), afrikansk-amerikanere (n = 29), og taiwanske (n = 40) lungekreftpasienter. Vi laget 12 par primere for å sekvensere den kodende regionen av c-
CBL
gen som strekker seg over eksoner 2 til 16 (tabell S2). Vi identifiserte 8 unike somatiske mutasjoner i c-
CBL eksoner
blant 8 forskjellige pasienter. En variant L620F, en kjent SNP (rs2227988) i ekson 11 ble også påvist. Viktigere, ble de åtte nye ikke-synonyme mutasjoner bekreftet ved sekvensering av begge trådene c-
CBL
genomisk DNA oppnådd fra lungetumorprøver (tabell 1). Videre er ingen av de 8 mutasjoner ble detektert i den tilsvarende normale vev, noe som indikerer at disse var somatiske mutasjoner. Fire synonymt single nucleotide variasjoner (SNVs) ble også identifisert, men ble ikke brukt videre i denne studien.
Tre av de 8 nye ikke-synonyme mutasjoner ble plassert i TKB (tyrosin kinase bindende) domene ( S80N, H94Y, og Q249E), en i ringen finger domenet (V391I), en i det prolin-rik region (72515_72517 del ATG), og tre i den C-terminale region (W802 *, R830K, og A848T) av c-CBL protein (figur 1A og Figur S1). I figur 1B, viser vi modell kromatogrammer av representative prøver.
(A) Skjematisk illustrasjon av de forskjellige c-CBL-mutanter med hensyn til de forskjellige funksjonelle domener. Tre mutasjoner: S80N, H94Y, Q249E ble plassert på TKB domene; V391I ble plassert på ringfingeren domene; 72515_72517 del ATG (en ikke-rammeskifte delesjon) og L620F (en kjent SNP, rs2227988) ble plassert på Pro-rik region og W802 *, R830K, og A848T ble funnet i den C-terminale område av c-CBL. Tallene viste representere aminosyre stillinger. Association of c-CBL mutasjoner mellom ulike etniske befolkningsgrupper er vist i tabellen (∧ kjent SNP). (B) Representative eksempler på sekvenserings kromatogrammer av mutasjonen regionen i normal (N) og tumor (T) prøver. Piler indikerer heterozygot mutasjon i tumorprøve. (C) Tap av heterozygositet (LOH) analyse av 37 svulsten og sammenkoblede normale prøver fra taiwanske pasienter. En verdi på 0,5 indikerer en LOH på c-
CBL
locus. (D) Skjematisk av kromosom 11 markører valgt for LOH analyse og representative eksempler på LOH kromatogram analyse. Etter forsterkning ved hjelp av kromosom 11 spesifikke mikro primere, ble PCR-produktet atskilt med kapillær elektroforese og band ble kvantifisert i henhold til intensitet.
11q LOH av c-
CBL
Gene
Paret lunge svulst og prøver fra taiwanske pasienter normale lungevevet (n = 37) ble undersøkt for LOH. Åtte (21,6%) viste LOH på c-
CBL
locus på kromosom 11, mens 29 prøver (78,4%) viste normal allel bidrag på mikro markører (Tall 1C og D).
c-CBL Mutasjoner i ulike etniske grupper
c-CBL dobbel mutant S80N /H94Y ble funnet i samme pasient, og den samlede mutasjonsraten for c-CBL i lungesvulster var 6,7% (8/119). Frekvensen av c-CBL-mutasjonen var høyest i stor celle karsinom (14,7%, 5 av 34 pasienter), etterfulgt av plateepitel carcinom (6,3%, to av 32 pasienter) og den minst ble observert i adenokarsinom (AD) (1,8%, 1 av 53 pasienter), selv om disse prisene var ikke statistisk signifikant (p = 0,292). Mutasjon priser var 6,0% blant kaukasiere (0 av 20 i AD, 0 av 10 i SQ, og 3 av 20 i LC), 13,8% i afrikansk-amerikanere (1 av 10 i AD, en av 10 i SQ, og to av 9 i LC) og 2,5% (0 av 23 i AD, en av 12 i SQ, og 0 av 5 i LC) i den taiwanske befolkningen. I tillegg to taiwanske pasienter med lungekreft (en plateepitel og en adenokarsinom) hadde kjent SNP L620F. Etniske forskjeller var ikke statistisk signifikant, men muligheten til å oppdage forskjeller var lav.
Mutasjoner i
MET
og
EGFR
kan brukes sammen Associated med c-CBL Endringer
Siden Østasiater med lungekreft har en høyere frekvens av
EGFR Hotell og
MET
mutasjoner i lungesvulster [21], [22], vi også bestemt mutasjoner i
EGFR Hotell og
MET
i samme taiwanske kohort prøver og sammenlignet resultatene med den observerte c-
CBL
endringer (LOH og /eller mutasjoner). I de 37 prøvene som ble testet, hadde vi ikke finne noen overlapping mellom c-
CBL
mutasjoner og c-
CBL
LOH (figur 2). Av de tre c-CBL-mutanter (inkludert den kjente L620F SNP, rs2227988), en av prøvene hadde en MET-mutasjon (N375S) og den andre hadde en EGFR-mutasjon (L858R). Blant de 8 prøvene som hadde en LOH på c-
CBL
locus 5 hadde en ekstra mutasjon i MET (N375S) og 2 hadde en
EGFR
exon 19 sletting. Tjueseks prøver hadde verken c-
CBL
mutasjon eller c-
CBL
LOH (3 pasienter hadde en c-
CBL
mutasjon, men ingen c-
CBL
LOH). Blant disse 26 prøvene 9 hadde en MET mutasjon (8 N375S, en L211W), 13 hadde en
EGFR
mutasjon (7 ekson 9 sletting, 6 L858R) og 4 hadde ingen andre MET eller EGFR mutasjon. Dermed frekvensen av MET eller EGFR mutasjoner hos pasienter med LOH på c-
CBL
locus (7 av 8) var lik den som er sett hos pasienter uten c-
CBL
mutasjon eller LOH ( 22 av 26 pasienter) (p = 0,99). Disse 4 pasienter uten identifiserbare mutasjon i c-
CBL
,
MET
eller
EGFR
representerte 10,8% av de 37 pasientene som ble analysert i den taiwanske pasient kohort. Omvendt, 89,2% taiwanske lungekreftpasienter har en identifiserbar mutasjon i enten c-
CBL
,
MET
eller
EGFR
eller en kombinasjon av de tre gener (figur 2) . I tillegg har vi bestemt
p53 Hotell og
KRAS
mutasjoner i disse taiwanske kohorter. To
p53 Hotell og en
KRAS
mutasjon ble oppdaget. Singelen
KRAS
mutasjon overlappet med en
p53
mutasjon. Denne pasienten hadde også
EGFR
ekson 19 sletting, men hadde ingen c-
CBL
mutasjon. Den andre
p53
mutasjon prøven hadde en c-
CBL
LOH med samtidig MET N375S mutasjon. Derfor, i det taiwanske prøvene analysert,
p53 /KRAS
mutasjoner og c-
CBL
mutasjoner var gjensidig utelukkende (data ikke vist).
37 taiwanske prøver ble analysert for mutasjoner i c-
CBL
,
MET Hotell og
EGFR Hotell og for LOH analyse i c-
CBL
locus. Dataene viser 21,6% (8/37) hadde LOH, mens 8% (3/37) hadde en c-CBL-mutasjon (inkludert kjent SNP L620F), disse prøvene var gjensidig utelukkende. I tillegg 5 av 8 LOH prøver også hadde møtt N375S mutasjon og 2 hadde
EGFR
exon 19 sletting. I prøvene med c-
CBL
mutasjon, en også hadde møtt N375S mutasjon mens en annen hadde EGFR L858R mutasjon. I prøvene som ikke havna noen c-
CBL
mutasjon (70%, 26/37), 22 hadde enten en
MET
eller en
EGFR
mutasjon og bare 4 ikke har en mutasjon i noen av disse 3 gener.
Cellular funksjoner c-
CBL
Endringer i sammenheng med Lung tumorigenesis
A. E3 aktivitet er intakt i de muterte c-CBL proteiner.
For å undersøke om de ulike c-CBL mutasjoner påvirker E3 aktivitet, ble EGFR valgt som modell substrat for c-CBL E3 funksjon. Alle de c-CBL-mutanter testet forbedret ubiquitinering av det aktiverte EGFR ligner villtype c-CBL-protein. Dette resultat viser at den katalytiske aktiviteten til c-CBL-mutanter ikke forringes når EGFR ble substratet. (Figur 3A).
(A) c-CBL mutanter ikke endrer ubiquitinering av EGFR. Celler ble ko-transfektert med EGFR og forskjellige c-CBL-mutanter ble stimulert med EGF, immunopresipitert med anti-EGFR-antistoff og blottet med anti-ubiquitin-antistoff. Immunoblot med anti-EGFR-antistoff tjente som IP-kontroll, mens de anti-HA-blot ble anvendt som inngangsstyre. (B) Cellelevedyktigheten ble målt ved trypan blå eksklusjon, og sammenlignet med tom vektorkontroll. c-CBL villtype (WT) og mutanter S80N /H94Y viste Q249E, og W802 * 66,7%, 132,3% 120,8% og 147,9% celleviabilitet henholdsvis i A549-celler 48 timer etter transfeksjon. Forsøkene ble gjort i tre paralleller og gjennomsnitts data vises. Feilfelt angir standardavvik. (C) Protein ekspresjonsnivåene for de forskjellige mutanter ble analysert ved Western blot ved å bruke c-CBL-antistoff. (D) Cell syklus analyse av ulike c-CBL mutanter 48 timer etter transfeksjon i A549 celler.
B. Effekt på lungekreft cellelevedyktighet.
Virkningen av et representativt c-CBL-mutant fra hver av de tre etniske bakgrunner på lungekreft cellelevedyktighet i cellelinjer ble bestemt. S80N /H94Y dobbelt mutasjon, Q249E, og W802 * ble identifisert i lungetumorprøver hentet fra en kaukasisk, en taiwansk og en henholdsvis afrikansk-amerikansk,. Som beskrevet i metodene, ble c-CBL villtype (WT) og de ovennevnte tre mutanter uttrykt etter kloning inn i dem pAlterMax vektor i A549-celler. Disse cellene uttrykker relativt lave basalnivåer av endogene c-CBL (data ikke vist). Transfeksjonseffektivitet var sammenlignbare mellom ulike grupper og antall celler transfektert med c-
CBL
villtype-konstruksjonen var omtrent 70% sammenlignet med kontrollceller som ble transfektert med den tomme vektoren. Celler transfektert med S80N /H94Y, Q249E og W802 * c-CBL mutant konstruksjoner resulterte i økt antall levedyktige celler som var 132,3%, 120,8% og 147,9% høyere henholdsvis i forhold til tom vektor kontroll transfekterte celler og signifikant forskjellig fra naturen -type konstruere (p = 0,022, p = 0,049 og p = 0,008, henholdsvis) (figur 3B). Relative nivåer av c-CBL-protein i helcellelysater preparert fra prøver tatt fra et parallelt eksperiment ble bestemt. C-CBL protein nivåer i prøver som representerer utransfekterte og tomme vektor transfektert celler var sammenlignbare, og de som representerer den c-CBL WT og de tre c-CBL mutanter var sammenlignbare (figur 3C).
C. Effekt på cellesyklus.
For å undersøke om økningen i celle levedyktighet i ulike c-CBL mutanter skyldes økt celleproliferasjon, cellesyklus analyse ble utført. A549 celler ble transfektert med c-CBL WT eller tre forskjellige mutanter: S80N /H94Y, Q249E og W802 *. Den tomme vektoren transfektant ble anvendt som en kontroll. Førti-åtte timer etter transfeksjon cellesyklusanalyse ble utført som beskrevet i materialer og metoder. Det var ingen vesentlig endring i subG1, G1 eller S-fasen av cellesyklusen mellom de ulike mutanter sammenlignet med WT-konstruksjonen (p = 0,64, p = 0,40 og p = 0,28, henholdsvis). G2 /M-fasen av cellesyklusen viste en økning i celleantallet for de tre mutanter, S80N /H94Y, Q249E og W802 *, sammenlignet med WT, men igjen forskjellen ikke var statistisk signifikant (p = 0,25) (Figur 3D ).
D. Effekt på cellemotilitet.
For å undersøke effekten av uttrykket av de ovennevnte tre c-CBL mutanter på cellemigrasjon, gjennomførte vi sårheling analyse som beskrevet i materialer og metoder. Nedleggelsen av scratch eller såret ble overvåket på 0, 12, 24, 36, og 48 timer. (Figur 4A). I alle prøvene, som representerte celler transfektert med mutanter, såret gapet var mye mindre enn det man ser i utvalget som representerte celler transfektert med c-CBL WT (p 0,001). Vi bestemte også frekvensen for sårheling for alle de fem gruppene. På 48 timer, vill-type c-CBL transfektanter viste 61,1% åpent sår mens S80N /H94Y, Q249E og W802 * mutanter viste 18,7%, 23,9% og 34,3% åpent sår henholdsvis (p 0,001). (Figur 4B)
(A) sårtilheling analysen ble utført i A549 celler transfektert med WT c-CBL eller ulike mutanter. Tom vektor (EV) ble anvendt som en kontroll. Representative bilder (Lysfelt og fase kontrast) fra hver endepunktet vises.
