Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Nylige fremskritt i lungekreft diagnose og behandling er oppnådd på grunn av en bedre forståelse av de molekylære mekanismer av sykdommen og identifisering av biomarkører som tillater mer spesifikke kreftbehandlinger. En av de mest kjente eksemplene på personlig terapi er bruken av tyrosin-kinase-inhibitorer, for eksempel gefitinib og erlotinib, for en vellykket behandling av ikke-småcellet lungekreft pasienter valgt basert på den spesifikke
EGFR
mutasjoner. Derfor er den pålitelige påvisning av mutasjoner kritisk for anvendelsen av passende behandling. I denne studien har vi testet en to-lags mutasjonsdeteksjon strategi ved hjelp av real-time PCR-analyser som et godt validert høy følsomhet metode og multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA) -baserte EGFRmut + analysen som et andre-tier standard følsomhet metode. En ekstra fordel av den anvendte MLPA metoden er at den tillater samtidig påvisning av EGFR mutasjoner og kopinummer endringer (dvs. presiseringer) i
EGFR, MET Hotell og
erbB2
. Vår analyse viste høy overensstemmelse mellom disse to metodene. Med bruk av denne to-lags strategi, bestemt vi pålitelig hyppigheten av
EGFR
mutasjoner og
EGFR, MET Hotell og
ErbB2
presiseringer i over 200 lungekreft prøver. I tillegg utnytter samtidig kopiantall og liten mutasjon analyser viste vi en veldig sterk sammenheng mellom EGFR mutasjoner og EGFR presiseringer og en gjensidig eksklusivitet av EGFR mutasjoner /presiseringer med MET og ErbB2 presiseringer. Våre resultater viste påliteligheten og nytten av de to-lags EGFR testing strategi
Citation. Lewandowska MA, Czubak K, Klonowska K, Jozwicki W, Kowalewski J, Kozlowski P (2015) Bruk av en To- lagdelt Testing Strategi for samtidig påvisning av Small
EGFR
Mutasjoner og
EGFR
Amplification i lungekreft. PLoS ONE 10 (2): e0117983. doi: 10,1371 /journal.pone.0117983
Academic Redaktør: Rafael Rosell, katalanske Institute of Oncology, SPANIA
mottatt: May 16, 2014; Godkjent: 05.01.2015; Publisert: 26 februar 2015
Copyright: © 2015 Lewandowska et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend 2011/01 /B /NZ5 /02773 fra National Science Centre (https://www.ncn.gov.pl /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Behandlingen av lungekreft er tradisjonelt basert på en histopatologisk evaluering som skiller to hovedtyper av lungekreft: små-celle lungecancer (SCLC) og ikke-små-celle lungekreft (NSCLC), sistnevnte som kan deles opp i plateepitel cell carcinoma, stor celle karsinom, adenokarsinom og kreft med blandet histologi. Betydelig siste fremskritt i behandlingen av lungekreft (spesielt adenokarsinomer) er oppnådd ved fremskritt i vår forståelse av patologi; de nåværende behandling omfatter spesialiserte agenter basert på tilstedeværelse eller fravær av spesifikke genetiske markører ( «personlig terapi»), for eksempel mutasjoner i den epidermale vekstfaktor-reseptor (
EGFR
) [1] eller gain-of- funksjonstrans eller inversjoner involverer anaplastisk lymfom reseptortyrosinkinasehemming (
ALK
) [2].
det ble vist at enkelte somatiske mutasjoner innenfor kinase domene
EGFR
bevisst kreft til behandling med
EGFR
-spesifikke tyrosinkinasehemmere (TKI), for eksempel erlotinib eller gefitinib (anmeldt i [3]). Blant de vanligste allergifremkallende
EGFR
mutasjoner er L858R i ekson 21 og i-frame slettinger i ekson 19, som til sammen utgjør over 80-85% av alle
EGFR
mutasjoner. Imidlertid, forekomsten av den sekundære T790M mutasjon i exon 20 forårsaker ervervet resistens mot TKI og bevirker progresjon av kreft ble behandlet med TKI [4,5]. Derfor er pålitelig deteksjon av
EGFR
mutasjoner er en viktig faktor som gjør at personlig behandling av lungekreftpasienter.
I de siste 10 årene, mange metoder med forskjellige følsomheter og særegenheter har blitt brukt å oppdage
EGFR
mutasjoner i kreftprøver. Disse metodene inkluderer Sanger-sekvensering, enkelt strand konformasjon polymorphism (SSCP) [6], co-forsterkning ved lavere denaturering temperatur-PCR (COLD PCR) [7], immunhistokjemi med
EGFR
-mutation spesifikke antistoffer [8] , peptid nukleinsyre-låst nukleinsyre (PNA-LNA) PCR klem assays, real-time PCR (RT-PCR) metoder [9] og neste generasjon sekvensering [10]. Men ingen av de metodene som har vært brukt så langt er ideelle, og hver av disse metodene har begrensninger som hovedsakelig er knyttet til følgende karakteristikk av kreftprøver: (i) diversifisert typer tumorprøver tilgjengelig for analyse (kirurgisk, vevsprøve), (ii) forurensning med normale celler, (iii) den genetiske heterogenitet av svulster, (v) det ofte lav frekvens av de analyserte mutasjoner, (iv) nedbrytning av DNA, og (v) skade på eller modifisering av DNA [de to sistnevnte faktorer gjelder også for formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) prøver, som er de mest tilgjengelige prøvene]. De mest alvorlige problemer som følge av begrensningene i tumorprøve analyse er falske negative og falske positive feil som kan føre til feilklassifisering og mangelfull behandling av kreft. Derfor, for å redusere brøkdel av feilsorterte prøvene, ble det nylig foreslått i evidensbasert retningslinje av tre profesjonelle samfunn (College of American patologer Internasjonale foreninger for studier av lungekreft, og Association for Molecular Pathology) som, om mulig,
EGFR
mutasjonstesting bør utføres med to metoder (en to-lags testing strategi). Disse retningslinjene representerer state-of-the-art lungekreft testing molekylære og ble i fellesskap utgitt i tre tidsskrifter [11-13]. For enkelthets skyld vil vi senere refererer kun til [11]. Denne to-lags metoden bør være basert på ulike mutasjonsdeteksjonsprinsipper og skal dekke ulike områder av følsomhet, som består av standard-følsomhet og høy følsomhet metoder.
I denne studien har vi testet over 200 NSCLC prøvene med bruk av to komplementære metoder, en rutinemessig brukt kommersielt RT-PCR assay (en høysensitiv metode) [9] og en ny multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MLPA) -baserte EGFRmut + analyse (en standard-følsomhet, andre-lags metode ) [14]. Vår analyse viste et høyt samsvar mellom disse to metodene, og dermed beviste pålitelighet og nytten av EGFRmut + analysen som et andre-tier metode for
EGFR
mutasjonstesting. Med bruk av disse metodene, vi preget og estimerte forekomsten av somatiske
EGFR
mutasjoner i et sett av lungekreft prøver fra sentrale Polen. En ekstra fordel med EGFRmut + analysen er at den tillater en mutasjonsanalyse og relativ kopiantall-bestemmelse (dvs. amplifikasjon deteksjon) i parallell. Vi brukte denne tilnærmingen til å finne en svært sterk sammenheng mellom
EGFR
forsterkning og forekomsten av
EGFR
mutasjoner og for å bestemme den grove hyppigheten av mutante alleler i våre analyserte prøvene.
Materialer og metoder
Utvalg og behandling av NSCLC prøvene for molekylær analyse
Vi ettertid anmeldt en kohort av 239 pasienter med histopathologically bekreftet NSCLC diagnostisert 2011-2012 på Franciszek Lukaszczyk Oncology Center i Bydgoszcz (sentrale Polen). Alderen på pasientene varierte fra 35 til 81. I alt 239 prøver som bestått kvalitetskontroll trinn (mikroskopisk analyse og tumor innhold kvalifisering samt kvalitative og kvantitative DNA-analyse) ble oppnådd etter 143 operasjoner, 91 finnålsaspirasjon ( FNA) prosedyrer, og fem endobronchial ultralyd med guidet transbronchial nål aspirasjon (eBUS-TBNA) prosedyrer eller pleuravæske samplings. Prøvene ble farget med hematoksylin og eosin for kvalitativ og kvantitativ analyse av tumorceller i det analyserte materiale (inklusive macrodissection i merket ut prøver). Kvalifisering av biologisk materiale for molekylær analyse var basert på tidligere beskrevet kvalitative og kvantitative skalaer for cytologisk [9] og histologisk [15] materiale. Informert skriftlig samtykke til genetisk testing, godkjent av F. Lukaszczyk Oncology Center i Bydgoszcz ble innhentet fra alle pasientene og studien ble godkjent av vår lokale etikkutvalg, bioetikkomité av Ludwig Rydygier Collegium Medicum i Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University i Torun . Dataene ble analysert anonymt.
DNA
DNA ble utført etter macrodissection av en region indikert av pathomorphologist. Genomisk DNA ble isolert fra FFPE adenokarsinom vev eller cytologiske prøver ved hjelp av en QIAamp FFPE Mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner med følgende modifikasjoner. Vi resuspenderes pelleten i 180 pl av Tissue lysebuffer med 20 pl proteinase K, og deretter vortex-blandet og ristet kontinuerlig cellepelleten med korte intervaller i løpet av en inkubasjon over natten ved 56 ° C. DNA kvantitet og kvalitet ble evaluert av Nanodrop absorbans analyse og agarosegelelektroforese.
Mutasjon analyse av Real-Time PCR
RT-PCR metoden bruker mutasjonsspesifikke prober for å evaluere 29 punktmutasjoner , inkludert T790M-mutasjonen (EGFR-RT52; Entrogen, Inc., Tarzana, CA). En DNA-mengde av 200-650 ng var tilstrekkelig for deteksjon av 29 mutasjoner i prøver av interesse; de interne kontroll VIC fluorescerende prober og
EGFR
fluorescerende prober ble FAM dye-merket. Forsterker kurvene ble evaluert i henhold til produsentens anbefalinger.
Mutasjon og forsterkning analyse av MLPA
MLPA analyse ble utført med bruk av en spesialdesignet EGFRmut + analysen, som tidligere har vært beskrevet i nærmere detalj [14]. Denne analysen gir samtidig påvisning av onkogene
EGFR
mutasjoner og en analyse av kopiantall (forsterkning deteksjon) av
EGFR
,
MET
, og
erbB2
. Alle reagenser unntatt EGFRmut + sonde blanding ble kjøpt skjema MRC-Holland Amsterdam, Nederland (www.mlpa.com). De MLPA reaksjoner ble kjørt i henhold til produsentens generelle anbefalinger (MRC-Holland), som beskrevet tidligere i [16,17]. I korthet ble 5 pl av genomisk DNA (ved en konsentrasjon på omtrent 20 ng /nl) inkubert ved 98 ° C i 5 minutter, avkjølt til romtemperatur og blandet med 1,5 ul av EGFRmut + prober blanding og 1,5 ul av SALSA hybridiseringsbuffer. Reaksjonsblandingen ble så denaturert ved 95 ° C i 2 min og hybridisert ved 60 ° C i 16 timer. De hybridiserte prober ble ligert ved 54 ° C i 15 minutter ved tilsetning av 32 ul av ligeringsblandingen. Etter varmeinaktivering, ble ligeringsreaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur, blandet med 10 ul av PCR-blanding (polymerase, dNTP’er, og universelle primere, hvorav den ene ble merket med fluorescein) og utsatt for PCR-amplifikasjon for 35 sykluser. De MLPA Produktene ble deretter fortynnet 20 ganger i hidi formamid inneholdende GS Liz600, som ble anvendt som en DNA dimensjonering standard, og separert via kapillær elektroforese (POP7 polymer) i en ABI Prism 3130XL apparat (Applied Biosystems). De oppnådde electropherograms ble analysert ved hjelp GeneMarker programvare v1.91 (2.4.0). Signal intensiteter (topphøyder) ble hentet og kjørt til utarbeidet Excel ark (tilgjengelig på forespørsel). For hver individuell prøve, ble det signalintensiteten av hver sonde dividert med den gjennomsnittlige signalintensiteten av kontroll prober for å normalisere de oppnådde verdier, og for å utjevne kjøre-bruk-variasjon, og den normaliserte verdi for hver topp ble deretter dividert med en tilsvar verdi i referanseprøvene og multipliseres med 2. det endelige MLPA resultatet av hver prøve er vist på tverr-plot, der søylene viser den relative kopitallverdi av de etterfølgende prober.
EGFR kopiantall analyse etter kvantitativ PCR (qPCR) og dråpe digital PCR (ddPCR)
qPCR analyse ble utført med bruk av MESA GREEN qPCR MasterMix Plus for SYBR analyse (Eurogentec, Seraing, Belgia), i henhold til produsentens generelle anbefalinger. ddPCR ble utført med bruk av QX200 system og EvaGreen Supermix (BIO-RAD, CA, USA) i henhold til produsentens generelle anbefalinger, som beskrevet tidligere [18,19]. Den ddPCR Analysen ble utført i et multiplex-format med den ko-amplifikasjon av kontroll-amplikonet og en av test-amplikoner i en reaksjon. For å oppnå korrekt separasjon av dråpetyper, ble intensiteten av test- og kontrollsignal differensieres av amplikonene «lengde og primere» konsentrasjoner. For begge metodene samme sett av PCR-primere ble brukt: (i) test-fragment for
EGFR
exon 2: forover primer GCAGTTGGGCACTTTTGAAG, revers primer TTCCAAATTCCCAAGGACCA (konsentrasjon i qPCR-300 nM, konsentrasjon i ddPCR-100 nM , amplicon lengde 83 bp); (Ii) test-fragment for EGFR exon 18: forover primer TTGTGGAGCCTCTTACACCC, revers primer CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGC (konsentrasjon i qPCR-300 nM konsentrasjon i ddPCR-100 nM, amplikon lengde 64 bp); (Iii) kontroll-fragment: forover primer GCTGACCTGTTGGCTGAAAA, revers primer GAATCGCTGTGGCCTTGATG (konsentrasjon i qPCR-300 nM, konsentrasjon i ddPCR-200 nM; fragment lengde 113 bp). De amplikonene enten overlappet, eller var tett plassert til følgende MLPA sonder: EGFR_e2, EGFR_e18 og ctrl_1 hhv. Den optimaliserte glødetemperatur ble satt til 59 ° C og 58 ° C, i qPCR og ddPCR henholdsvis
Resultater
Alle 239 prøver ble analysert som blindprøver av to metoder:. (I) en kommersiell RT-PCR assay (EGFR-RT52, Entrogen Inc.) som dekker 29 av de vanligste onkogene mutasjoner i eksoner 18, 19, 20 og 21 av
EGFR plakater (for detaljer, se produsentens hjemmeside; https://www.entrogen.com/web2/egfr-mutation-analysis-kit) og (ii) en spesialdesignet MLPA-analyse (EGFRmut +) som samtidig tillater påvisning av presiseringer og små mutasjoner i
EGFR
(for mer informasjon se [14]) (fig. 1). I korthet, i tillegg til de vanlige doserings-sensitive (DS) sonder, den EGFRmut + analysen er også sammensatt av to typer av mutasjons-sensitive sonder. Mutasjon-sensitive (MS) prober er typer DS sonder som er spesifikke for villtypesekvensen, men overlapper med nettstedene til følgende mutasjoner: G719A /S /C (G719X) i ekson 18 (sonde e18), in- rammeslettinger i ekson 19 (probe E19), S768I og i-frame innsettinger i ekson 20 (probe e20-1), T790M i ekson 20 (probe e20-2) og L858R i ekson 21 (sonde e21). Forekomsten av en av disse mutasjoner i en analysert prøve fører til en reduksjon i signal av den tilsvarende MS-probe. Den EGFRmut + analysen inneholder også tre mutasjon-sensitive (MS +) prober som er spesifikke for mutante sekvenser. Signalene fra disse sondene forekommer bare hvis det tilsvarende mutasjonen er til stede. To av disse probene gjenkjenne sekvenser av de vanligste
EGFR
mutasjoner (den mest vanlige delesjon i-ramme i exon 19, c.2235_2249del15 (probe + E19) og L858R (probe e21 +)), og den tredje gjenkjenner den T790M mutasjon, som er forbundet med TKI motstand (probe e20-2 +). I tillegg EGFRmut + inneholder noen DS sonder som er spesifikke enten for
MET
eller
ErbB2 Hotell som tillater presiseringer av disse genene til å bli oppdaget.
A) Kart over den
EGFR
gen med posisjonene til RT-PCR amplikonene (EGFR-RT52) og MLPA sonder (EGFRmut + assay) indikeres (vertikale linjer under kartet). De mutasjon-sensitive EGFRmut + sonder er angitt i rødt. Posisjonene til onkogene
EGFR
mutasjoner er angitt over kartet. B) De RT-PCR-resultater som representerer (fra toppen) (i) referanseprøven (en prøve med ingen mutasjoner eller forsterkning), (ii) en prøve med den mest vanlige delesjon i-ramme i exon 19 (c.2235_2249del15) , (iii) en prøve med både L858R i exon 21 og T790M i ekson 20, og (iv) en prøve med en i-ramme delesjon i exon 19 (c.2235_2249del15) og
EGFR
forsterkning. I hver graf, de overlappende resultatene av de 8 RT-PCR reaksjoner som dekker 29
EGFR
mutasjoner vises. De røde linjer angir de positive forsterkningskurver av spesifikk
EGFR
mutasjoner (pekt på grafen) og den grønne basis linje representerer det ikke-forsterkede signal på grunn av mangel av de evaluerte mutasjon i den analyserte prøven. C) MLPA electropherograms av prøvene analysert ved RT-PCR (panel B). Sonde IDer er angitt under electropherograms. Stjernene angir kontroll sonder; den rosa pilspisser antydet redusert signal fra MS-prober og økt signal av MS + sonder, henholdsvis; og de svarte pilspisser indikerer forsterkede signaler om
EGFR
-spesifikke prober. D) Bar plott som svarer til de electropherograms som er vist i panel C og som representerer den normaliserte kopitallverdi (y-aksen) av hver sonde (x-aksen). De rosa pilene indikerer en redusert kopi tallverdi av MS-sondene og økt kopi tallverdi av MS + sonder, henholdsvis.
Kjennetegn ved påvist mutasjoner
Totalt vi har oppdaget 30 mutasjoner i 29 av 239 prøver (12,1%). Både L858R og T790M ble funnet i en prøve. Blant de identifiserte mutasjoner var 16 i-ramme delesjoner i ekson 19 (53%), 9 substitusjoner L858R (30%), 2-substitusjoner L861Q (7%), en substitusjon G719X, en i-ramme å benytte i exon 20 og en substitusjons T790M (S1: Tabell; oppsummert i tabell 1). Mutasjonene var mye hyppigere hos kvinner 22/68 enn hos menn 7/142 (24,4% versus 4,7%, henholdsvis; p 0,0001). En lagdeling av mutasjonsfrekvens etter alder [ 55 (13%), 55 (11,9%)] og prøvetype [FFPE (11,9%), cytologiske prøver (12,5%)] viste ingen signifikant påvirkning av disse faktorene på mutasjonsfrekvens (tabell 1). Vi også observere en nedgang i mutasjonsfrekvensen i prøver med en lavere prosentandel av tumorceller (PTC). Merk imidlertid at bare en liten del (omtrent 5%) av de analyserte prøvene hadde PTC≤30%.
Sammenligning av RT-PCR og MLPA mutasjon deteksjonsmetoder
Det er noe gull standardmetode for mutasjon påvisning i cancerprøver, hvor en bestemt mutasjon kan stå for en meget lav andel av den analyserte DNA. Derfor, for å vurdere kvaliteten av det MLPA baserte EGFRmut + analysen, har vi sammenlignet med den som rutinemessig brukes og godt validert RT-PCR-metoden. En direkte sammenligning av resultatene av RT-PCR og MLPA viste en meget høy overensstemmelse mellom disse to metodene (98,7% samstemmige resultater) såvel som 100% spesifisitet (ingen falske positiver) og 90% følsomhet (27 av 30 mutasjoner som detekteres) av EGFRmut + test. Blant de 3 mutasjoner som ikke ble oppdaget av den EGFRmut + analysen var to tilfeller med L861Q substitusjon, som ikke dekkes av EGFRmut + prober (figur 1A.), Og en G719X mutasjon i en prøve med en lav PTC (15%). I tillegg blant de analyserte prøvene av MLPA var 4 blinde duplikater med 3 forskjellige mutasjoner. I alle tilfeller er resultatene av duplikate prøver var konkordant. Videre må det bemerkes at MS + sonder (signal forekomst) påvise mutasjoner lettere og med en høyere tillit enn MS- sonder (signal reduksjon). MS + probene tillot sikker påvisning av mutasjoner, selv når disse mutasjoner utgjør en meget liten brøkdel av den analyserte DNA (~ 10%) i prøver med PTC≤30%. For eksempel kan den L858R mutasjon, som er dekket av både MS + og MS-prober, i tre prøver, ikke bli detektert av en reduksjon i signalet fra MS- proben, men ble lett påvises ved opptreden av en lav, men tydelig signal av MS + probe. Den lavere følsomhet av MS-prober resulterer hovedsakelig fra den forholdsvis høyt signal variant av DS-prober i kreftprøvene. Jo større MLPA signal variasjon i kreftprøver har blitt observert tidligere, og resulterer hovedsakelig fra genetisk heterogenitet av kreftprøver [20] og lavere kvalitet og hyppige degradering av DNA-prøver isolert fra FFPE- vev [21-25].
Forsterkning av EGFR, MET og ErbB2 og dens forhold til mutasjonsfrekvens
den ekstra fordelen av MLPA analysen er at i tillegg til å påvise mutasjoner, det gir også informasjon om en slektning kopiantall av alle analyserte sekvenser /sonder . Det gjør at en grov estimering av brøkdel av påviste mutasjoner i analyserte prøvene og tillater påvisning av kopinummerendringer (presiseringer) i de analyserte genene:
EGFR
,
MET Hotell og
erbB2
. Å definere relative kopitall 3-4 som en «økning» og ≥4 som en «forsterkning», identifiserte vi 12 (5%), 17 (7%) og 2 (1%) prøver med gevinster og 7 (3%) , 11 (5%) og 3 (1%) prøver med presiseringer av
EGFR
,
MET
, og
ErbB2
henholdsvis (S1 tabell og fig. 2 ). Fordelingen av kopiantall amplitude var lik for alle 3 genene, med de største presiseringer som overstiger 10 eksemplarer. Som i tilfellet av mutasjonene, observerte vi en mye høyere frekvens av
EGFR
gevinst /presiseringer i kvinner enn hos menn (18% mot 2%, henholdsvis; p 0,0001). En lignende tendens ble ikke observert for
MET plakater (13% versus 11%, henholdsvis), og en reversert, men ikke signifikant tendens ble observert for
ErbB2 plakater (1% versus 3%).
A) Eksempler på
EGFR
(prøver v-vi),
MET
(prøver vii-viii) og
ErbB2 plakater (samples ix-x) amplifikasjon detektert av EGFRmut + analysen. B) Kjennetegn på prøver med
EGFR
,
MET Hotell og
ErbB2
gevinst /presiseringer. Prøvene vist i fig. 1D (ii-iii) og fig. 2A (vi-x) er angitt i den første kolonne. Den sex og
EGFR
mutasjonsstatus for hver prøve er angitt i andre og tredje kolonne, henholdsvis. Kolonner 4-6 viser kopitallverdier av
EGFR
,
MET Hotell og
ErbB2
hhv. De mørke blå celler indikerer presiseringer (kopi nummer ≥4), og de lyseblå celler indikerer gevinster (kopi nummer 3-4). C) Frekvens av
EGFR
mutasjoner i prøver med
EGFR
forsterkning,
EGFR
gevinst og normal
EGFR
kopiere nummer.
Som vist i fig. 2, gevinster og presiseringer av
EGFR
,
MET
og
ErbB2
var gjensidig utelukkende. Men observerte vi meget sterk sammenheng mellom forekomst av
EGFR
mutasjoner og
EGFR
forsterkning (Chi kvadrat test for trend; p 0,0001). Alle unntatt en kreftprøve (90%) med
EGFR
forsterkning og 7 av 12 prøver (58%) med
EGFR
gevinst hadde en
EGFR
mutasjon.
En omhyggelig undersøkelse av de MLPA resultater med
EGFR
amplifikasjoner (se eksempler i fig. 1 og fig. 2) indikerer at signalet nedgang fra MS-prober og signalet økning av MS + sondene (brøkdel av mutert kopier) er omtrent den samme eller enda større enn økningen i
EGFR
kopiere nummer. Dette resultatet tyder på at alle de amplifiserte kopier av
EGFR
i de mutante prøvene inneholder mutasjonen (dvs. at bare det mutante allelet gjennomgår forsterkning), og at mutasjoner forekommer som et tidlig utløsende hendelse, slik at
EGFR
forsterkning gunstig for kreft. Merk at alle prøvene inneholder en viss mengde normal DNA, som kan flate de observerte kopinummerendringer og maskere effekten i prøvene med et lavere nivå av forsterkning.
Denne observasjonen bedt oss om å sekvensere eksoner 18-21 (koding av tyrosin kinase domene) i prøver med
EGFR
gevinst /presiseringer der ingen kjente
EGFR
mutasjon ble funnet. Den sekvensanalyse avdekket ingen nye sekvensvarianter som kan være onkogene mutasjoner eller trigger
EGFR
forsterkning.
Replikering av EGFR kopi nummer analyse (forsterkning deteksjon) med bruk av qPCR og ddPCR
for å bekrefte resultatene av
EGFR
kopiere nummer analyse vi reanalysert et panel av kreftprøver, inkludert alle prøver med
EGFR
forsterkning, med bruk av qPCR og ddPCR. Begge metodene er basert på helt andre prinsipper enn MLPA. QPCR er en metode å benytte sanntids kvantifiseringen av PCR-produktet, mest brukt for verifisering av kopitall varianter, som er identifisert i både normal (ikke-kreft) og kreft prøver (f.eks [26,27]). Den ddPCR er en ny metode for kvantifisering, basert på absolutt telling av testede og referanse DNA-molekyler, klonalt forsterket i tusener av vann-i-olje-dråpe-reaksjonene (emulsjon PCR). Nytten av ddPCR med EvaGreen dsDNA-bindende fargestoff for nøyaktig kopi-nummer estimering ble nylig vist i flere studier [18,19,28]. Med bruk av både qPCR og ddPCR, signalene fra to test-amplikoner, lokalisert i exon 2 og exon 18 av
EGFR
, ble analysert mot signal fra styre-fragment (svarende til MLPA sonde ctrl_1). Analysen utført viste at resultatene av både qPCR og ddPCR korrelerer meget godt med de relative kopitallverdier, bestemt ved bruk av MLPA (korrelasjonskoeffisient r = 0,941 og R = 0,927, respektivt), og at signalene fra prøvene med
EGFR
amplifikasjon ble godt separert fra signaler av prøver uten forsterkning (S1 fig.). Det må imidlertid bemerkes at det ikke kan utelukkes at noen prøver med borderkopitallverdier kan være feilklassifisert. Noen avvik i de absolutte signalverdier, bestemt ved MLPA, og referansemetodene kan resultere fra forskjellige sett av kontrollregioner som benyttes for normalisering og fra det faktum at MLPA er en multipleksing og den måler kopiantall i flere punkter i et aktuelt gen renter. Lignende resultater ble oppnådd for
MET Hotell og
ErbB2 plakater (data ikke vist).
Diskusjoner
Det er velkjent at frekvensen av
EGFR
mutasjoner skiller seg vesentlig mellom befolkningsgrupper. Mutasjonen frekvens er høyest i asiater (45-52%); lavere i europeere (24%), afro-amerikanere (20%) og latinamerikanere (17%); og lavest i hvite australiere (7%) ([11,29] og referanser innen). Også blant europeerne, ulike frekvenser av
EGFR
mutasjoner ble rapportert: f.eks 17% i Spania [30] og 10% i Sør-Tyskland [31]. I denne studien, basert på en omfattende analyse av et betydelig antall lunge adenokarsinom prøver, vi preget og bestemt frekvens
EGFR
mutasjoner i polske pasienter (12,1%). Vår analyse viste en mye høyere (4,8x) frekvens av
EGFR
mutasjoner hos kvinner enn hos menn (24% vs. 5%, henholdsvis). Vi observerte en lignende trend for
EGFR
gevinst /presiseringer, som viste enda større overrepresentasjon (9x) hos kvinner enn hos menn (18% vs. 2%, henholdsvis). Selv om høyere frekvens av
EGFR
mutasjoner hos kvinner enn hos menn har blitt observert mange ganger før, det overrepresentasjon av
EGFR
mutasjoner hos kvinner observert i vår studie er, i henhold til vår kunnskap, en av den høyeste rapporterte så langt (med unntak av studiene med et meget lite antall prøver /mutasjoner) ([11,29], og de referanser innen). Informasjonen om befolkningen spesifikke kjennetegn og hyppigheten av mutasjoner er viktige epidemiologiske faktorer som kan påvirke gjennomføringen av adekvate diagnostiske og behandlingsprosedyrer optimale for bestemt befolkning.
Molekylær kreft diagnosticians ta diversifisert heterogen tumor materiale på en daglig basis. DNA isolert fra kirurgisk resected svulster (ferske eller FFPE-) og fra tynn nål og endobronchial ultralyd transbronchial nål pustende celler. Hver av disse histologiske eller cytologiske prøver kan ha forskjellig og noen ganger svært lav PTC, og de ofte viser en vesentlig grad av nedbrytning DNA (spesielt FFPE-prøver). I tillegg kan formalinfiksering skade DNA og fører til sekvensmodifiseringer. Alle disse faktorene føre til ulike typer gjenstander som kan føre til både falske positive og falske negative resultater.
I denne studien har vi testet en EGFRmut + MLPA-analyse (en standard-følsomhet metode) som en andre- tier metode og sammenlignet våre resultater med de av en godt validert kommersiell RT-PCR-analyse (en høysensitiv metode). Disse to metodene er basert på helt andre prinsipper. I RT-PCR, er mutasjonen deteksjon basert på hybridisering av TaqMan mutasjonsspesifikke sonder, men i MLPA, er mutasjonen deteksjon basert på ligering og påfølgende amplifikasjon av villtype eller mutasjonsspesifikke sonder. Våre resultater tyder på at EGFRmut + er et robust analyse som oppviser høy reproduserbarhet, spesifisitet og sensitivitet. Et lite antall uoppdagede mutasjoner ble enten ikke dekkes av MLPA sonder (n = 2) eller skjedde i en prøve med en lav PTC (n = 1). Den EGFRmut + analysen tillatt oss å påvise mutasjoner i alle typer prøver (cytologisk og histologisk, Dypfryst og FFPA) og tillater oss å oppdage mutasjoner i prøver med ulike PTCs (20-90%). Det må imidlertid bemerkes at MS + prober tillate mer robust mutasjon deteksjon enn MS-sonder gjør, og at kvaliteten på MLPA resultater er generelt lavere for kreftprøvene enn for bakterie-linje DNA-prøver. Den lavere kvalitet av kreft MLPA resultater er på grunn av de forannevnte egenskapene til kreftprøvene og det er ikke rapportert og diskutert tidligere [23-25,32]. Andre faktorer som gjør MLPA analysen attraktivt som andre-tier
EGFR
mutasjonsdeteksjon metoden er den lave mengden av DNA (50-100 ng) som kreves for analyse (uten tilleggsutvalget ekstraksjon eller behandling er nødvendig, og samme DNA-prøven kan brukes for både RT-PCR og MLPA-analyse), en kort omløpstiden ( 2 dager), og lav pris (omtrent $ 5 pluss den initiale kostnaden av probe syntese, ca $ 3000). I tilfelle av rutinemessig anvendes analyser, kan kostnaden av sonden syntese kan ignoreres fordi mengden av de syntetiserte prober er tilstrekkelig for hundretusener av analyser.
I tillegg til
EGFR
mutasjon deteksjon den EGFRmut + analysen gir også påvisning av
EGFR
,
MET Hotell og
ErbB2
forsterkning. Selv om dataene er ikke avgjørende, har det vært antydet at
EGFR
forsterkning kan være en indikator eller ombygging av følsomhet for TKI behandling (anmeldt i [11]).
