Abstract
TP53-genet er funnet å være mutert i 50% av alle krefttilfeller. P53-protein, et produkt av TP53-genet, er et multi-domene protein. Den består av en kjerne DNA-bindingsdomene (DBD) som er ansvarlig for dens binding og transkripsjon av nedstrøms målgener. De mutasjoner i p53-protein er ansvarlig for å skape cancerøse tilstander, og er funnet å ha oppstått ved en høy frekvens i DBD-regionen av p53. Noen av disse mutasjoner er også kjent for å være temperaturfølsomme (
ts
) i naturen. De er kjent for å oppvise delvis eller sterk binding med DNA i temperaturområdet (298-306 K). Mens, på 310 K og ovenfor de viser fullstendig tap i bindende. Vi har analysert endringer i binding og conformational atferd ved 300 K og 310 K for tre av
ts
-mutants
nemlig
., V143A, R249S og R175H. QM-MM simuleringer har blitt utført på villtypen og de ovennevnte
ts
-mutants for 30 ns hver. Den optimale estimat av fri energi av binding for en bestemt antall grensesnitt hydrogenbindinger ble beregnet ved hjelp av den maksimale sannsynlighetsmetode som beskrevet av Chodera et. al (2007). Denne parameteren er observert å være i stand til å etterligne bindingsaffiniteten til p53
ts
-mutants ved 300 K og 310 K. Således korrelasjonen mellom MM-GBSA fri energi til å binde og hydrogenbindinger dannet av grensesnittet rester mellom p53 og DNA har åpenbart den temperaturavhengige beskaffenhet av disse mutanter. Rollen til hovedkjeden dihedrals ble oppnådd ved å utføre dieder hovedkomponentanalyse (PCA). Denne analysen tyder på at de konforme variasjoner i hovedkjeden dihedrals (
φ Hotell og
ψ
) av p53
ts
-mutants kan ha forårsaket reduksjonen i den totale stabiliteten av proteinet. Løsningsmidlet eksponering av sidekjedene av grensesnitt restene ble funnet å hemme bindingen av p53 til DNA. Solvent Accessible Surface Area (SASA) viste seg også å være en viktig egenskap i å skille de konformere oppnådd ved 300 K og 310 K for tre
ts
-mutants fra villtypen ved 300 K.
Citation: Koulgi S, Achalere A, Sonavane U, Joshi R (2015) Gransker DNA innbinding og Konformasjonell Variasjon i temperatursensitive p53 Kreft Mutants Bruke QM-mM Simuleringer. PLoS ONE 10 (11): e0143065. doi: 10,1371 /journal.pone.0143065
Redaktør: Freddie Salsbury Jr, Wake Forest University, USA
mottatt: 24 juli 2015; Godkjent: 30 oktober 2015; Publisert: 18.11.2015
Copyright: © 2015 Koulgi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir og tilhørende informasjon filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
p53 pathway spiller en avgjørende rolle for effektiv svulst undertrykkelse som aktiverer gener som respons på cellulært stress [1, 2]. Mutasjoner i p53 men hindrer denne veien ved å gå på akkord med p53 funksjonelle aktivitet [3]. I nesten 50% av humane kreftformer, er mutasjoner observert i p53-protein [4, 5], [6]. Flertallet av disse mutasjoner er funnet i sekvensspesifikk DNA-bindende domene kjerne (DBD) av p53 [7-10]. Disse mutasjoner er kjent for å påvirke den termodynamiske stabilitet av DBD og hele proteinet i tillegg. Krystallstrukturen av p53 viser at et stort
β
-sandwich gir et stillas for en konservert region DBD. Dette DBD-regionen består av en sløyfe-ark-helix-motivet og to store sløyfer tjoret ved en sink-ion (figur 1A) [11]. Den DNA-bindende aktivitet av p53 omfatter foreningen av sinkioner, som er kjent for å danne et tetraedrisk koordinering kompleks med CYS 176, CYS 238, 242 og CYS HIS 179 rester av proteinet. Sink ion har en viktig rolle i å stabilisere sløyfer forbundet med sin tetraedrisk kompleks og korrekt binding av p53 til mindre spor av den spesifikke DNA i intakte celler [12, 13]. Selv om de fleste av de rester i DNA-bindingsdomenet av p53 er svært utsatt for mutasjoner, er det syv hot spots hvor mutasjoner forekommer ved en meget høy frekvens [14-19]. Forstå den strukturelle og funksjonelle konsekvens av disse mutasjonene har vært av stor interesse for studier av kreft [14], [20].
Siden halvparten av kreft hos mennesker er assosiert med mutasjoner i p53, fremtidig kreft terapeutisk strategier blir målrettet for medikamenter som stabiliserer mutant p53 kjernedomenet [10]. Imidlertid har mange eksperimentelle undersøkelser på hot spot mutanter avslørt deres temperaturavhengighet for DNA bindende affinitet [21-23]. I de siste to tiårene omfattende eksperimentelle arbeidet har vært fokusert for å forstå temperaturfølsomme (
ts
) natur av ulike p53 mutanter og deres conformational mekanisme [21-24] [25, 26]. Den første detaljerte eksperimentelle undersøkelser på
ts
-p53 mutanter rapportert av Zhang et. al. og Friedlander et. al. har forklart sin DNA-binding ved 310 K [21, 22]. De observerte at ved 298 K
ts
-mutants viser bindende evne som blir ødelagt irreversibelt ved oppvarming til 310 K [22]. Med disse eksperimentene var det tydelig at de hot spot p53 mutanter V143A, R248Q, R249S, R273H bortsett R175H var i stand til å binde seg til DNA på sub-fysiologiske temperaturområde (298-306 K) og mister sin binding helt 310 K. Bindingen stabilitet og konformasjonsforandringer statene disse
ts
-p53 mutanter har også blitt studert ved binding av monoklonale antistoffer som PAB 1620 og PAB 1801 [21, 22]. Likeledes, en av de verker av Bullock et. al. viste at bruk av differensiell scanning-kalorimetri eller spektroskopi fører til irreversibel denaturering av p53 mutert kjernedomene med endring i temperaturen [23]. Eksperimenter på p53 mutanter på ulike temperaturområder har funnet å gjenopprette en viss grad av trans når uttrykt ved reduserte temperaturer [21, 24]. På grunnlag av temperaturavhengig kvantitativ brettingen av p53-rester og DNA-bindingsstudier, er p53-mutanter blitt klassifisert i forskjellige klasser [25]. Omfattende arbeid gjort av Shiraishi et. al. viste temperaturavhengig intra-molekylære mekanismen for rundt 2000 missense mutanter. Det følger også med den trans studie ved 303 K og 310 K [26]. Delvis inaktive temperaturavhengig p53-mutanter har blitt rapportert å være utfører reaktive mekanisme ved amifostin i gjær [27]. Nyere forskning på lobul brystkreftceller har avdekket temperaturfølsom funksjonell aktivitet av p53 mutanter og det rolle i klonal evolusjonære veien [28].
Til tross for dyp eksperimentell observasjon på DNA-bindende aktivitet av
ts
-mutants av p53 svært få teoretisk og beregningsorientert studier har vært fokusert for å forstå dette fenomenet. Molekylær dynamikk simulering er en nåværende tilstand av kunst metode for å undersøke detaljene i strukturfunksjonsforhold biomolekyler. Den utfyller også de eksperimentelle observasjonene ved å gi innsikt i atomnivå interaksjoner. I senere tid, har blitt rapportert noen analyse av molekylære dynamikk simuleringer for å undersøke temperaturfølsom oppførselen til p53 kreft mutanter. Tan og medarbeidere analysert missense mutasjon av DBD ved 310 K basert på DBD stabilitet korrelasjon med sekvens struktur og molekyl kontakter i dem [29]. En omfattende stabilitet korrelasjon ble også foreslått basert på kliniske og funksjonelle data [29]. Nylig den fenotypiske effekten av ikke-synonyme enkeltnukleotidpolymorfi i TP53-genet har blitt studert ved hjelp MD simuleringer på mutant og WT p53 proteiner [30]. På den annen side MD simuleringer på R248Q mutant har avslørt temperaturen sensitive natur denne mutant på DNA-bindende samspill og sin dynamiske oppførsel [31]. Men det er et behov for å undersøke dypere for å pin peker strukturen funksjonelle relasjoner for
ts
-mutants. Som et forsøk på dette notatet presenterer QM-MM simulering studie på temperaturavhengige p53 mutanter. Sinkkoordineringskomplekset er meget viktig for DNA-binding av p53 som beskrevet tidligere [12, 13]. Det er vanskelig å opprettholde denne samordningen kompleks i klassisk MD simuleringer. Derfor, i mange av de tidligere simulerings studier på p53, forskjellige strategier som dummy-atom, bundet og modifisert kraftfelt tilnærming har blitt anvendt for å opprettholde den sinkkoordineringskompleks [32-34]. På samme måte i denne studien ble gjort et forsøk på å bevare dette komplekset ved å behandle det med kvantemekanikken (QM) i stedet for å bruke noen tvang begrensninger. Utføre QM på en så viktig funksjonell del av proteinet ville hjelpe i å etterligne de faktiske biologiske oppførsel [35]. Bruken av QM-MM tilnærming for å opprettholde den sinkkoordineringskompleks ble innlemmet i en av våre tidligere studier på p53-mutanter [36]. Derfor opprettholde sink koordinering komplekset var den eneste hensikt å innføre quantum behandling.
Formålet med denne artikkelen er å gi et innblikk i de konforme variasjoner og DNA bindingsegenskapene til
ts
-p53 varianter. Tre kjente
ts
-mutants
nemlig
., V143A, R249S og R175H er studert ved hjelp av QM-MM simuleringer. Temperaturen følsomme natur har blitt studert ved to temperaturer
nemlig
., 300 K (romtemperatur) og 310 K (fysiologisk temperatur).
V143A, R249S og R175H er strukturelle mutanter og er kjent for å forvrenge den konformasjonelle stabiliteten til p53-DBD. V143A ligger i
β
-sandwich region av loopen-ark-helix motiv av p53-DBD som er ansvarlig for hovedsporet DNA binding (figur 1B). Dette
ts
-mutant er kjent for å lage hull i den hydrofobe kjerne, dannet på grunn av
β
-sandwich. Den drastisk destabiliserer også p53-kjernedomenet ved en differanse på 4 kcal /mol [14]. V143A være en
ts
-mutant binder bedre enn den villtype p53 ved 300 K. Dette er imidlertid bindingsevnen helt fraværende ved 310 K [21].
R249S ligger på DNA-bindende overflate, er sidekjeden av arginin 249 med på å stabilisere sløyfen L3 som er en del av det mindre-spor DNA-bindende domene (figur 1B). Dette Arginin på å bli erstattet av Serine fører til en ikke-enhetlig konformasjon av sløyfe L3 som ytterligere påvirker DNA-binding. R249S
ts
-mutant er kjent for å stille ut delvis binding til DNA på 300 K, mens det samme er fullstendig avskaffet ved 310 K [22].
R175H ligger nær sink ion tetrahedral kompleks , som er ansvarlig for mindre groove binding i forbindelse med to store sløyfer L2 og L3 (fig 1B). Det antas at dette
ts
-mutant perturbs sink bindende regionen. Minimal mengde strukturelle studier er tilgjengelig for denne
ts
-mutant. Dens temperaturavhengige natur viser at ved 300 K er det redusert binding til DNA som senere går tapt ved 310 K. Den grundig forståelse av den temperaturavhengige beskaffenhet av disse mutanter krever omfattende konformasjonelle analyse. Derfor, dette papiret avtaler med de strukturelle og DNA-bindende variasjoner forekommer i disse tre
TS
-mutants
nemlig
., V143A, R249S og R175H.
Metoder
System Utarbeidelse
koordinatene for startstrukturen ble valgt fra kjeden B og hele dobbelttrådet DNA av PDB ID 1TSR [11]. Hver kreft mutant ble utarbeidet ved å vurdere denne strukturen som referanse ved hjelp av
xleap
modul av AmberTools 1.5 [37]. Den sinkioner var tilstede i en tetraedrisk koordinasjon kompleks med CYS 176, CYS 238, 242 og CYS HIS 179. bindingsavstanden og vinkelinformasjon for tetraeder komplekset ble oppnådd fra arbeidet rapportert av Lu et al. i år 2007 [32]. Hele p53-DNA-sink-komplekset ble først nøytralisert ved tilsetning av Na + -ioner, etterfulgt av uttrykkelig oppløsnings hjelp av TIP3P vannmodellen [37]. Samle ble utført inne i en oktaeder, minste avstand mellom det oppløste (p53-DNA kompleks) og kanten av simulering boksen var 12
Å
. Topologien og koordinater for alle p53 varianter ble generert ved hjelp av Amber FF03 kraftfelt [37]. Systemet størrelse for hver av de p53-variantene var ca 63300 atomer.
QM-MM simuleringer
I hver av de solvatiserte p53-DNA-system, ble sinkkoordineringskompleks holdt tilbake i ikke-bundet form ved hjelp av kvantemekaniske (QM) metoden. Resten av simuleringssystemet var blitt behandlet ved hjelp av molekylmekanikk (MM) tilnærming. Derfor hver minimalisering, temperatur ramping, likevekt og produksjons kjøre protokoller var QM-MM simuleringer. Den PM3 metoden [38] ble valgt for QM regionen mens, Amber FF03 kraftfelt ble brukt til MM region [37]. Det overordnede ansvaret for QM regionen ble ansett for å være to tillegge ladningen på sink ion. Obligasjonene som inneholder hydrogenatomer i QM og MM-regionen ble begrenset ved hjelp av SHAKE algoritme [39]. Den kanoniske ensemble, NVT ble påført, hvor antallet atomer, boksvolum, og temperaturen av hver av systemet ble opprettholdt gjennom hele simuleringen [40]. QM-MM-grensesnittet ble behandlet i henhold til koblingen atom tilnærming med forhåndsdefinerte standardparametere [41-43]. Simuleringene ble utført ved et tidstrinn av 2 fs ved hjelp av Langevin dynamikk og en kollisjonsfrekvens på 0,1 ps
-1 [40]. Den Periodisk Boundary tilstand (PBC) ble brukt til å utføre de konstant volum dynamikk. Partikkel Mesh Ewald (PME) metoden ble benyttet med et ikke-limt cut-off av 12
Å
. Minimaliseringen ble utført i to trinn. Til å begynne med ble løsningsmidlet minimalisert ved bruk av bratteste kingsmetode for 20000 trinn. Etterfulgt av, p53-DNA-Zn-komplekset blir utgitt for minimering i de neste 50000 skritt. Simuleringen protokollen var identisk for alle p53-variantene till dette trinnet. Men som simuleringene ble utført ved to forskjellige temperaturer
nemlig
., 300 K og 310 K, temperaturen gradvis ble utført for 40 ps hver for å få tak i disse temperaturene, henholdsvis. En likevekt for 2 ns og en produksjons kjøre i 30 ns hver, ble utført for alle p53 variantene ved 300 K og 310 simuleringspakke K. Amber 10 ble brukt for alle simuleringene. Totalt seks QM-MM simuleringer ble utført bestående av villtype p53 ved 310 K, V143A 300 K og 310 K, R249S ved 310 K og R175H 300 K og 310 K. Dataene for WT og R249S 300 K ble oppnådd fra vårt tidligere arbeid [36].
Disse simuleringene ble videre analysert ved hjelp av ulike moduler av AmberTools 1.5 [44]. Den cpptraj og MMGBSA modul av AmberTools 1.5 ble brukt til å beregne hydrogenbinding og gratis energi parametere for simuleringene. Et verktøy heter GeoPCA, ble brukt til å utføre dieder PCA [45]. PCA er en multivariat statistisk teknikk som representerer et sett av variabler korrelerte som ortogonale hovedkomponenter. Disse hovedkomponentene hjelpe i å analysere variasjonen til stede i noen gitte data. PCA viser seg å være et meget nyttig verktøy for å undersøke de forskjellige typer lokale bevegelser som er ansvarlig for konformasjonsendringer i de simulerte proteiner. Videre ble løsningsmidlet tilgjengelige overflateareal (SASA) beregnet ved hjelp av programmet NACCESS [46].
Resultater og diskusjon
Effekt på DNA-binding til p53
ts
-mutants
DNA-bindingsevnen av alle p53 varianter ble estimert ved å beregne forandringen i fri energi ved binding og antallet hydrogenbindinger (hbonds) som dannes av grensesnitt rester mellom p53 og DNA. De frie energi verdiene ble beregnet ved hjelp av MMPBSA modulen AmberTools 1.5 [44]. Endringen i fri energi ble beregnet som følger, (1) (2) AE
gass
, (
com
,
rec
,
lig
) er molekylmekanikk energi og ΔG
sol product: (
com
,
rec
,
ly
) er samle energi beregnes Generalisert av Born (GB) oppløsnings modell for komplekset, henholdsvis reseptor og ligand. Disse to betingelser bidrar til entalpi del av den frie energiberegning. Den TΔ S
(
com
,
rec
,
ly
) sikt viser entropic bidraget for den beregnede fri energi. Entropy beregning være tungt beregne intensive, ble hoppet for å få gratisenergiberegninger. Derfor ble den følgende ligning som brukes i foreliggende arbeide, (3) Imidlertid MM-GBSA fri energi med og uten entropisk bidraget ble beregnet for de siste 10 ns av simuleringene (S1 og S2 Fig). De frie energiverdier observert en lignende trend i begge tilfellene. Derfor TΔ S
(
com
,
rec
,
ly
) hvilke attributter som skal entropi del av fri energi er ikke tatt med i de frie energi vilkår beregnet. Disse frie energiverdier ble ytterligere optimalisert for å få et optimalt estimat av fri energi for bestemt antall hbonds mellom p53 og DNA ved hjelp av maximum likelihood metoden [47]. Ligningen brukes for å utlede den optimale estimat av fri energi var som følger, (4) (5) er den optimale estimat av ΔΔ
G
bind product: (
opt
ΔΔ
G
bind
) for k antall grensesnitt hbonds mellom p53 og DNA [47]. Mens,
x
n
er Δ Δ G
bind
for snapshot nummer n og
δ
2
x
k
er et mål på usikkerheten observert i de frie energiverdier
x
n
med k antall grensesnitt hbonds (EQ 5).
antall hbonds ble beregnet ved hjelp av cpptraj modulen AmberTools 1.5 [44]. Cut-off for donor-akseptor obligasjon avstanden og vinkelen ble ansett for å være 3
Å Hotell og 135 ° hhv. De hbonds dannet av de åtte grensesnitt rester
nemlig
., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 og ARG 283 med DNA ble ansett som grensesnitt hbonds for alle p53 varianter. Også, i en av de tidligere arbeider, ble en lignende type fremgangsmåte som kan benyttes, basert på MM-GBSA fri energi til å binde og hbonds dannet mellom p53 og DNA. Denne sammenligningen hadde åpenbart forskjellen i DNA-bindende egenskap av villtype, cancer og rednings mutanter av p53 [36]. Tilsvarende analyser utført i denne oppgaven representerer optimal estimat av MM-GBSA fri energi av binding (
opt
ΔΔ
G
bind
) spesifikk for hydrogenbindinger dannet av grensesnitt rester.
opt
ΔΔ
G
bind
ble beregnet for villtype (WT) og alle tre
ts
-mutants av p53 300 K og 310 K. hele 30 ns banen ble ansett for denne analysen. Sammenligningen av
ts
-mutants med WT 300 K og 310 K har blitt avbildet i figur 2. Figur 2A og 2D viser resultatene for V143A og WT 300 K og 310 K hhv. Det ble observert at ved 300 K, den frie energi-verdiene var lavere for V143A sammenlignet med WT, noe som antyder bedre binding i V143A (figur 2A). På den annen side ble det observert å svekke ved 310 K (figur 2D). Fig 2B og 2E viser fri energi av binding av R249S og WT på henholdsvis 300 K og 310 K. Det ble klart observert at ved begge de temperaturer som de frie energiverdiene for R249S var høyere enn den til WT. Fig 2C og 2F viser sammenligningen mellom R175H og WT på henholdsvis 300 K og 310 K. Her igjen R175H hadde høyere frie energi verdier enn WT ved begge temperaturer.
Disse observasjonene er hentet fra beregning av
opt
ΔΔ
G
bind
på basis av hydrogenbinding, viser at alle de tre
ts
-mutants mister sin bindende affinitet ved 310 K i forhold til WT. Men V143A viser forbedret binding enn WT 300 K som også har blitt rapportert av eksperimenter på
ts
-p53 mutanter
nemlig
., Friedlander et. al (1996), Bullock et. al (1997, 2000) og Zhang et. al. (1994) [22], [23], [25], [21]. Disse eksperimentelle studier tyder også på at R249S og R175H binde svakt på 300 K, men aktiviteten er helt borte ved 310 K. Dermed resultatene som oppnås for R249S og R175H fra simuleringer studie omtalt i denne artikkelen, er enig i observasjonene rapportert i disse eksperimentelle studier [22], [23], [25], [21].
for å legge til støtte for disse observasjonene en tomt på MM-GBSA avledet ΔΔ
G
bind
mot tiden har blitt gitt i de utfyllende data som S3 fig. En temperatur sammenligning av disse
ts
-mutants har også blitt gitt i de utfyllende data som S4 Fig. Disse resultatene også utfylle de ovenfor nevnte eksperimentelle funn rapportert på
ts
-mutants av p53.
opt
ΔΔ
G
bind
være en statistisk utledet parameter skulle vise seg å være mer betydelig med stort antall observasjoner. Derfor ble en identisk simulering for WT 300 K utført i 30 ns og øyeblikksbilder ble tatt hver 10 ps som øker datapunktene til 6000 snapshots. S5 Fig viser sammenligningen for
opt
ΔΔ
G
bind
for WT 300 K med 3000 (Run1) og 6000 (Run1 + Run2) snapshots hhv.
Temperatur sensitive mutanter stabilitet og hovedkjede dihedrals
ts
-mutants av p53 er kjent for å indusere tap i DNA-bindende samt strukturelle forvrengning av p53 DBD. For å gi et innblikk i de strukturelle endringene som skjer på grunn av mutasjoner hovedkjede dihedrals
φ Hotell og
ψ
ble utsatt for Principal Component Analysis (PCA). PCA viser seg å være et meget nyttig verktøy for å undersøke de forskjellige typer lokale bevegelser som er ansvarlig for konformasjonsendringer i de simulerte proteiner. De viktigste kjede dihedrals (
φ Hotell og
ψ
) ble brukt som reaksjons koordinerer og PCA ble utført ved hjelp GeoPCA [45]. Oppdragsgiver Komponent 1 (PC1) og 2 (PC2) ble beregnet for mutanter og villtypen. Tomtene for PC2 mot PC1 har blitt gitt i de utfyllende data fra S6-S9 fig. S6 og S7 figurene viser fordelingen av konformere basert på PC1 og PC2 av
φ
dihedrals 300 K og henholdsvis 310 K. Tilsvarende S8 og S9 Figurene viser fordelingen av konformere basert på PC1 og PC2 av
ψ
dihedrals 300 K og henholdsvis 310 K. Variansen observert i PC1 og PC2 for både
φ Hotell og
ψ
vinkler i alle tilfeller har blitt gitt i S10 fig. Det kan ses som både
φ Hotell og
ψ
vinkler viste mer variasjon i PC2 verdier ved begge temperaturer.
φ
dihedrals viste endring i PC2 med økning i temperatur for WT og alle tre p53-mutanter. Men for
ψ
dihedrals bortsett WT alle tre
ts
mutanter viste ingen betydelig variasjon med hensyn til temperatur. For å observere konsekvensene av denne endringen i
φ Hotell og
ψ
dihedrals på stabiliteten til proteinet, den Δ
G
protein
ble plottet mot PC2 verdiene for WT og hver av p53
ts
-mutants (figurene 3 og 4). Figurene 3 og 4 forklare befolkningen fordelingen av konformerer basert på PC2 av
φ
og
ψ
vinkler wrt den frie energi av den samlede protein (Δ G
protein
) hhv. Analysen ble utført på øyeblikksbilder tatt med alle 10 ps for de siste 10 ns av simuleringen. Fig 3A og 3D viser fordelingen for WT og V143A på henholdsvis 300 K og 310 K. Fordelingen av befolkningen i V143A viser overlapper med WT ved begge temperaturer. WT og V143A oppnå cis konformasjon ved 300 K som ytterligere gradvis driver mot den trans-regionen på 310 K. Men Δ G
protein
verdiene økt ved 310 K for dem begge i forhold til 300 K. fig 3B og 3E beskriver fordelingen for R249S og WT på henholdsvis 300 K og 310 K. På 300 K, oppnår WT cis og R249S er spredt i trans-regionen med høyere frie energiverdier. Ved 310 K, en tendens R249S å fylle cis-formen med fri energi høyere enn WT ved 310 K og selv 300 K. Fig 3C og 3F reflekterer oppførselen til R175H i forhold til WT 300 K og 310 K hhv. Befolkningen ser ut til å bli tungt spredt langs hele bredden av
φ
med fri energi verdier høyere enn WT ved begge temperaturer.
Disse observasjonene tyder på at for V143A den conformations en tendens til å fylle den samme regionen med tilsvarende fri energiverdier som sett i WT 300 K og 310 K. Dermed dedusere lignende conformations vunnet av
φ
vinkler i V143A og WT på begge temperaturer. Men for R249S
cp
vinkler kunne med hell indikerer geometrisk motsatte conformations oppnådd ved 300 K og 310 K i sammenligning med WT og selvtillit. Karakterisert, ved 310 K fri energi verdiene var høyere enn den til WT med en forskjell på 1000 kcal /mol. Stivheten vunnet av
cp
vinkler i R249S ved 310 K kan ha ført til økningen i fri energi som konkluderer tap av stabilitet. R175H viste ingen spesiell dominerende konformasjon vunnet av
cp
vinkler som befolkningen syntes å være helt spre seg. Imidlertid, ved begge temperaturer R175H syntes å være mindre stabil enn WT i form av fri energi av p53-molekylet. Derfor figur 3 utleder som øker i temperatur induserer endringer i
φ
vinkler for WT, V143A, R249S og R175H som igjen reduserer deres stabilitet.
Fig 4A og 4D viser
ψ
vinkler distribusjon for WT og V143A 300 K og 310 K mot Δ G
protein
. De conformations i både WT og V143A ser ut til å bli spredt og spenner lignende gratis energinivå. Men på 310 K WT har en tendens til å fylle cis regionen mens V143A fortsetter å bli spredt. De frie energinivå på 310 K var lik for begge V143A og WT og høyere enn det som ble observert ved 300 K. Fig 4B og 4E snakker om conformational fordeling av WT og R249S 300 K og 310 K hhv. 300 K, er befolkningen spredt over hele spekteret av
ψ
men de frie energi verdiene er høyere i forhold til WT. Ved 310 K ble spredt oppførselen R249S beholdes ved enda høyere frie energinivå i forhold til seg selv og WT. Fig 4C og 4F beskriver befolkningens fordeling for R175H 300 K og 310 K hhv. På 300 K ble konformere for R175H spredt over hele området fra -180 ° til 180 ° og høyere fri energi nivå i forhold til WT. Ved 310 K, at konformasjoner har en tendens til å klynge inn i cis- og trans-regioner for R175H selv om de frie energinivået er høyere enn den til WT. Samlet for alle tre mutanter
ψ
vinkler førte til conformations som øker den frie energien i p53-molekylet ved 310 K i forhold til WT og seg selv ved 300 K.
Ved WT både
φ Hotell og
ψ
vinkler viste endring med økende temperatur. V143A, R249S og R175H viste endringer i
φ
vinkel fordeling med økning i frie energiverdiene med 200 kcal /mol ved 310 K, sammenlignet med 300 K. Men i tilfelle av alle tre
ts
-mutants
ψ
vinkel fordelingen var lik ved begge temperaturer, men de frie energiverdier så ut til å være høyere ved 200 kcal /mol ved 310 K. Disse fordelinger av konformerer basert på fri energi av p53-molekylet og PC2 av hovedkjede dihedrals antyder at enten
φ
eller
ψ
eller begge kan være ansvarlig for endring i sin stabilitet. Derfor kan den konformasjonelle fordeling basert på hovedkjede dihedrals og fri energi av p53-molekylet bidrar til å utlede den temperatur indusere forandring i den totale struktur av p53. Denne tilpasning av ulike konformasjoner ved høyere temperatur induserer tap av stabilitet i V143A, R249S og R175H i form av fri energi.
Temperatur effekt på grensesnitt rester av
ts
-mutants
DBD av p53 er kjent for å ha to forskjellige regioner som bidrar i binding til DNA
nemlig
., loop-ark-helix motiv og Loops to, tre med sink koordinering kompleks. Disse to regionene består av åtte viktige rester
nemlig
., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 og ARG 283 som spiller en avgjørende rolle i å forme p53-DNA interaksjoner. For å kontrollere temperaturen effekt på deres deltagelse i DNA-bindende aktivitet, ble sidekjeden løsningsmidlet tilgjengelige overflateareal (SASA) og fri energi bidrag i binding beregnes for disse åtte rester. ble utført denne analysen for de siste 10 ns av simuleringene.
Solvent Eksponering av grensesnitt rester.
Det har vært ulike studier rapportert på modeller av forskjellige proteinsystemer som diskuterer løsemiddeleksponering som en av de avgjørende faktorer for å opprettholde stabiliteten av proteinet [25, 48, 49]. Spesielt i tilfelle av p53 noen endring i dens løsningsmiddel påvirkning er kjent for å spille en viktig rolle i å definere stabiliteten av dens mutanter [25]. Imidlertid eksponering av skjulte rester har en tendens til å destabilisere proteinet mer i forhold til de som ligger på overflaten av proteinet. For å undersøke disse eksperimentelle resultatene, ble sidekjeden SASA for de åtte grensesnitt rester beregnet.
Figur 5 beskriver den gjennomsnittlige sidekjeden SASA for alle de åtte grensesnitt rester ved 300 K (figur 5A) og 310 K (fig 5B). De feilfelt i disse to tallene indikerer standardavvik verdier. Oppførselen til sidekjeden SASA for hver av de åtte grensesnitt rester w.r.t tid for alle de p53-variantene ved 300 og 310 K er gitt i tilleggsdata (S11-S18 Fig). Vurderer WT 300 K så nær hjem konformasjon av p53, har sammenligning av andre p53 varianter er diskutert her. Forskjellen i SASA verdiene er rapportert i parentes. Når denne forskjellen i SASA var større enn standardavviket for p53 variant ble det ansett for å være statistisk signifikant. V143A hadde fire av åtte rester
nemlig
., LYS 120, ARG 273, CYS 277 og ARG 280 med mer utsatt (10-30
Å
2) sidekjeder 300 K og 310 K enn WT 300 K. ut av disse fire unntak for ARG 273 resten tre viste statistisk signifikant SASA forskjell. Løsningsmidlet eksponering for ARG 248 ved 300 K var mindre enn den for WT ved 300K (20
Å
2), som ble funnet å øke ved 310 K. Men denne økningen i SASA for ARG 248 på 310 K ble ledsaget av store standardavvik (ca. 20
Å
2). De resterende tre rester
nemlig
., SER 241, ALA 276 og CYS 277 varierte litt (mindre enn 15
Å
2) sammenlignet med WT 300 K. R249S hadde seks al. al. al.
