Abstract
Bakgrunn
Beclin en og Beclin 2 er autofagi relaterte proteiner som viser lignende aminosyresekvenser og domene strukturer. Beclin en etablert den første forbindelse mellom autofagi og kreft. Imidlertid er rollen til Beclin 2 i kreft er uklar. Målet med denne studien var å analysere Beclin en og Beclin 2 uttrykk i muntlig kreft vev og i cellelinjer, og å vurdere deres mulige roller i kreft progresjon.
Metoder
Vi undersøkte Beclin 1 og Beclin 2 uttrykk ved immunhistokjemi i 195 tilfeller av kreft i munnhulen. De prognostiske roller Beclin en og Beclin 2 ble analysert statistisk.
In vitro
, overekspresjon og knockdown av Beclin proteiner ble utført på en muntlig kreft cellelinje, SAS. De immunfluorescens og autofagi flux analyser bekreftet at Beclin proteiner var involvert i autofagi. Virkningene av Beclin en og Beclin 2 på autofagi og tumorvekst ble evaluert ved konvertering av LC3-I til LC3-II og ved klonogene analyser, henholdsvis.
Resultater
Oral kreft vev utstilt avvik uttrykk for Beclin en og Beclin 2. De cytoplasmatiske Beclin 1 og Beclin 2 uttrykk var irrelevant i muntlig kreft vev. I overlevelsesanalyser, ble høy cytoplasma Beclin en uttrykk forbundet med lav sykdomsspesifikk overlevelse, og negative atom Beclin en uttrykk var forbundet med høy tilbakevendende overlevelse. Pasienter med enten høy eller lav cytoplasma Beclin to uttrykk hadde signifikant lavere total overlevelse og sykdomsspesifikke overlevelse enn de med moderat uttrykk. I orale kreftceller, overekspresjon av enten Beclin en eller Beclin to førte til autofagi aktivering og økt klonogene overleve; knockdown av Beclin 2 nedsatt autofagi og økt klonogene overlevelse.
Konklusjoner
Våre resultater indikerer at ulike mønstre av Beclin en og Beclin to var assosiert med aggressiv kliniske resultater. Beclin en overekspresjon, samt Beclin 2 overekspresjon og uttømming, bidro til tumorvekst. Disse funnene tyder Beclin proteiner er forbundet med tumorgenese
relasjon:. Liu J-L, Chen F-F, Chang S-F, Chen C-N, Lung J, Lo C-H, et al. (2015) Uttrykk for Beclin Familie Proteiner er assosiert med tumorprogresjon hos Oral Cancer. PLoS ONE 10 (10): e0141308. doi: 10,1371 /journal.pone.0141308
Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, CANADA
mottatt: 24 juni 2014; Godkjent: 07.10.2015; Publisert: 27 oktober 2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi i Taiwan (MOST 103-2320-B-182A-018-, NMRPG6D0071) (MEST 104-2320-B -182A-012-, NMRPG6E0041), Chang Gung Memorial Hospital Chiayi Branch (CMRPG6E0071), og Chang Gung Medical Research Center (CMRPD6C0013). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral kreft er en av de mest vanlige kreftformer og et økende problem over hele verden. Høye insidensrater oppstå i Sør- og Sørøst-Asia, deler av Europa, deler av Latin-Amerika, og Stillehavsregionen [1]. Nylig, har forekomsten av kreft i munnhulen økt, særlig i økonomisk utviklede land [2]. De aller fleste av munnhulekreft er plateepitelkarsinom, som oppstår fra plateepitel slimhinnene i munnoverflaten. Til tross for den tilsvarende histologisk fenotype, det molekylære grunnlaget for kreft i munnhulen er svært kompleks, som viser flere genetiske og epigenetiske mutasjoner [3, 4]. Identifisere nye biomarkører for kreft i munnhulen kan brukes i utviklingen av nye terapeutiske intervensjoner.
Autophagy er en evolusjonært konservert katabolsk prosess som involverer nedbrytning av unødvendige intracellulære metabolitter og ødelagte organeller av lysosomale enzymer. Prosessen innebærer dannelsen av autophagosomes, som sluker uønskede cytoplasmatiske innholdet og deretter levere dem til lysosomer. Den primære funksjon av autophagy er for å opprettholde cellulær homeostase, særlig i nærings belastede tilstander. Blant de autofagi relaterte gener,
beclin en
etablerte den første forbindelse mellom autofagi og kreft [5], og regnes som en haploinsufficient tumorsuppressorgen [6, 7]. Beclin 1 deltar i autophagosome kjerne på et tidlig trinn i autofagi. I tillegg Beclin en samhandler med mange positive og negative regulatorer som påvirker autophagic aktivitet og tumorigenesis [8-12]. Det fungerer som en viktig mediator i autofagi regulering.
Beclin 2
, en gang kalt
BECN1P1
, ble opprinnelig regnet som en pseudogen. I 2013, He et al eksponert at genet koder for et protein som viser høye likhetstrekk med Beclin en i aminosyresekvens og domenestrukturer, og de navngitte nytt protein Beclin 2 [13]. Denne nye identifisert protein ble funnet å være fungerte i autofagi, endolysosomal degradering, og metabolisme. Den kommuniserer også med flere bindingspartnere av Beclin en, inkludert ATG14, AMBRA1, VPS34, og BCL-2. Disse dataene foreslått sin rolle i regulering av autofagi [13].
Foreningen for Beclin 2 og kreft har ikke blitt behandlet, og forholdet mellom Beclin 2 og Beclin en uttrykk og resultatene av kreftpasienter har aldri blitt studert . I denne studien undersøkte vi de uttrykk for Beclin en og Beclin 2 i muntlig kreft vev, og undersøkte assosiasjoner blant uttrykk for Beclin en og Beclin 2, clinicopathologic funksjoner og overlevelse. Vi inspisert også effekten av endring av Beclin proteiner på autofagi og kreftcelle spredning.
Materialer og metoder
Pasienter og prøver vev
Denne retrospektive studien ble godkjent av Institutional Review Board of St. Martin De Porres Hospital (Chiayi, Taiwan) og Chang Gung Memorial Hospital Chiayi Branch (Chiayi County, Taiwan). Pasientinformasjon ble anonymisert og avidentifisert før analyse. Formalinfikserte, parafininnstøpte vevsprøver fra orale kreftpasienter som fikk kirurgisk reseksjon ble hentet fra arkivene til St. Martin De Porres Hospital mellom januar 2003 og desember 2008. Alle sakene ble først diagnostisert, histologisk bekreftet plateepitelkarsinom. Pasienter som har mottatt preoperativ neoadjuvant terapi eller har hatt en tumorstørrelse på mindre enn 5 mm, ble utelukket fra studien. Klinisk informasjon, inkludert pasienters alder, kjønn, tumorstørrelse, lymfeknutestatus, metastaser, og oppfølgingsdata ble hentet fra pasientjournaler. Svulsten-node-metastaser (TNM) scenen ble definert i henhold til den syvende utgaven av det amerikanske Joint Committee on Cancer staging system [14]. Total overlevelse (OS) ble definert som tiden mellom kirurgi og død av alle årsaker. Sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) ble definert som tiden mellom kirurgi og død forårsaket ved oral cancer. Tilbakefall overlevelse (RFS) ble definert som tiden mellom kirurgi og den første lokal eller systemisk residiv.
I alt 198 tilfeller av kreft i munnhulen ble opprinnelig inkludert. Tre tilfeller viser begrenset eller ingen vev i avsnittene om microarray ble ekskludert. Studien til slutt besto av 195 saker for immunhistokjemiske flekker og statistisk analyse.
Pathologic undersøkelse
hematoksylin og eosin-farget lysbilder av hvert tilfelle ble re-evaluert av en patolog for å bekrefte den histologiske typen , klasse, status av nekrose og lymphovascular invasjon. Den histologisk grad ble klassifisert som klasse 1 (godt differensiert), klasse 2 (moderat differensiert), og klasse 3 (dårlig differensiert). Saker med nekrotiske områder som utgjør mer enn 10% av tumor områdene ble ansett som «omfattende nekrose», og de andre sakene ble registrert som «begrenset eller ingen nekrose.» Lymphovascular invasjon ble definert som tilstedeværelse av kreft celler i lymphovascular kanaler.
Tissue microarray konstruksjon
Tissue microarray byggingen ble utført som tidligere beskrevet [15]. I korte trekk, en patolog analysert hematoksylin og eosin-farget lysbilder, og deretter merket de representative områder som skal samples på lysbildene og blokkene tilhørende vev. Prøven kjerne utvalg fra vevsblokker omfattet to 1,5 mm diameter kjerner for hvert enkelt tilfelle av kreft vev, og en 1,5 mm diameter kjerne for hvert enkelt tilfelle av de normale orale mucosas. De valgte kjerner ble stanset og overført til parafin-mottaker blokker. Sammenhengende 4-um tykke seksjoner ble fremstilt, og hematoxylin og eosin-farging ble utført på hver mottaker blokk for å bekrefte tilstedeværelsen av de valgte soner.
Immunhistokjemi
Immunohistokjemiske flekker ble utført på fire -μm-tykke seksjoner fra microarray ved Leica Bond-Max Autostainer (Leica Microsystems, Bondbiotech, Taichung, Taiwan) i henhold til produsentens instruksjoner med mindre modifikasjoner. Seksjonene ble deparaffinized av Bond Dewax Solution (Leica Microsystems) og utvannet av gradert alkohol. Heat-indusert antigen henting ble oppnådd ved Bond epitop Retrieval Solution 1 (Leica Microsystems) i 20 minutter ved 100 ° C. Platene ble inkubert i hydrogenperoksyd i 5 minutter for å redusere endogen peroksidaseaktivitet. Platene ble deretter inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med mus-monoklonale antistoffer mot Beclin en (1: 400, kanin polyklonale, Abcam, Cambridge, UK) og Beclin 2 (1: 400, kanin polyklonale, Novus biologisk materiale, Littleton, CO, USA). En post-primære IgG linker-reagens ble påført på 8 minutter, og objektglassene ble inkubert med et polymert pepperrot peroksidase-IgG-reagens i 8 minutter for å lokalisere det primære antistoff. Diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) ble brukt som substrat for å påvise antigen-antistoff-binding. Endelig hematoksylin ble brukt i 5 minutter til counterstain kjerner.
Vurdering av immunhistokjemi
Intensiteten, prosent, og subcellulære lokalisering av immunhistokjemisk farging av hvert tilfelle ble registrert. Normal tonsill- vev ble benyttet som positiv kontroll. Beising å utelate det primære antistoff ble utført som den negative kontroll. Cytoplasmatiske og atom uttrykk ble vurdert separat. Intensiteten og prosentandelen av positivt fargede celler i hver kjerne ble skannet i en lav effekt felt (100 X) og deretter vurdert i høy effekt felt (400 X). Intensiteten av fargingen ble registrert som 0, 1, 2 og 3 henviser til negativ, svak, moderat og sterk farging, respektivt. Prosentandelen av positive celler ble tatt fra 0% til 100%. Resultatene av fargingen ble bedømt ved bruk av hurtig (Q) stillingen, som ble erholdt ved å multiplisere prosentandelen av positive celler (P) av intensiteten (I) (Q = P x I; maks = 300) [16]. To patologer uavhengig evaluert resultatene av immunhistokjemisk farging uten kjennskap til clinicopathologic data. Motstridende resultater ble løst ved en multihode mikroskop.
Cutoff punktvalg for immunhistokjemi
For cytoplasmatiske uttrykk for Beclin en og Beclin to, de optimale cutoff poeng av Q score ble bestemt av X-Tile 3.6.1 programvare, som tidligere beskrevet [17]. Programmet beregnet chi-kvadrat verdier på alle mulige divisjoner basert på log-rank test for Kaplan-Meier estimater. For cytoplasma uttrykk for Beclin en, en optimal punkt med den høyeste verdien ble fastsatt. Cutoff punktet Q score med høyest chi-kvadrat verdier var 55, 110, og 25 for OS, DSS, og RFS, henholdsvis. Vi valgte 63 som cutoff Q score for Beclin en cytoplasma uttrykk. For cytoplasma uttrykk for Beclin 2, chi-kvadrat verdier bestemt av 2 optimale cutoff poeng var større enn de bestemt av en optimal punkt. Dermed har vi valgt 2 cutoff poeng for å klassifisere sitt uttrykk i 3 grupper: lav, middels og høy. Cutoff interessante Q poengsum med de høyeste chi-kvadrat verdier var (35, 125), (35, 145), og (25, 85) for OS, DSS, og RFS, henholdsvis. Vi har valgt (32, 118) som cutoff Q score for Beclin 2 cytoplasma uttrykk.
Bare et mindretall av tilfellene viste atom uttrykk for Beclin en eller Beclin 2. Dermed tilfeller med mer enn 10% områder av nukleær farging ble klassifisert som positive; de andre ble klassifisert som negative.
Cellekulturer og reagenser
Den menneskelige muntlig plateepitelkarsinom cellelinje SAS, etablert fra en dårlig differensiert plateepitelkarsinom tungen, ble dyrket i 10% FBS supplert DMEM. Plasmider uttrykker flagg-merket Beclin en og Beclin to ble hentet fra Addgene og en gave fra Levine laboratorium, henholdsvis. For å generere en lentiviral vektor uttrykker Beclin 2, PCR fragment av flagg-merket
beclin 2
ble klonet inn pLX301 lentiviral vektor (Addgene). Lentiviruses ble generert av kotransfektering HEK293 celler med plasmider pLX301-Beclin 2, pCMVDR8.2 og pMD.G av lipofektamin 2000. lentiviruses frigitt til kulturmediet ble samlet på 48 timer og 72 timer etter transfeksjon. SAS-celler som stabilt overuttrykker Beclin 2 ble etablert ved å infisere lentivirus uttrykke Beclin
2 Hotell og puromycin utvalg. Bafilomycin, en autofagi hemmer hindrer fusjon mellom autophagosomes og lysosomer, var kjøp fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).
siRNA knockdown
Dobbelt strandet liten interfering RNA (siRNA) mot
Atg5 Hotell og
beclin 2
var kjøp fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) og Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA), henholdsvis. SAS-celler ble utsådd i 6-brønners plater, og transfektert med 100 pmol siRNA ved RNAiMax (Invitrogen) ved den følgende dag.
immunoblotanalyse
Cellene ble lysert i PBS som inneholdt 1% Triton X -100 og protease-inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich). Lysatene ble deretter sentrifugert ved 12.000 x g ved 4 ° C i 15 min. Proteiner i lysatet ble separert ved SDS-PAGE, overført til en polyvinylidendifluorid-membran og påvist ved immunblotting. Anti-Flag og Anti-Atg
5
ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Anti-LC3 ble oppnådd fra Nanotool (Teningen, Tyskland). Anti-Beclin en og Anti-Beclin to ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology og Novus Biologicals, henholdsvis. Anti-p62 ble kjøpt fra Abcam.
immunfluorescens farging
Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyde, og behandlet for immunofluorescens farging med primært antistoff mot anti-Flag (M2) og inkubasjon med fluorescence- merket sekundært antistoff (Invitrogen). Til slutt ble cellene observert og bildene ble tatt i henhold til Leica SP5 fluorescens mikroskop.
klonogene analysen
SAS celler transfektert med plasmider eller siRNA ble sådd på ca 200 celler per brønn i 6-brønners plater og dyrket i 10 dager. Cellene ble vasket med PBS og farget med 1% krystallfiolett i metanol i 15 minutter ved romtemperatur. Etter vask ut fargestoff, ble kolonier telles.
Statistisk analyse
De chi-kvadrat tester ble brukt til å vurdere sammenslutning av uttrykk for Beclin proteiner og clinicopathologic funksjoner. Korrelasjonene av Q score ble vurdert av Spearman rang korrelasjon tester, og Spearmans rho koeffisienter ble illustrert som varme kartet. Kurver for OS, DSS, og RFS ble trukket ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene i overlevelse ble sammenlignet med log-rank tester. De univariate og multivariate Cox andel regresjonsmodeller ble brukt til å estimere fareforhold og 95% konfidensintervall for pasientenes utfall. Alle
P
verdiene var to-sidig. En
P
verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Kolonien Tallene i klonogene analysene ble representert som prosenter av kontroll +/- standard feil. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS versjon 19,0 programvare (SPSS, Inc., Armonk, NY, USA) og Excel 2013 (Microsoft Excel, Microsoft, Redmond, WA, USA) for Windows.
Resultater
Aberrant Beclin 1 og Beclin 2 uttrykk i muntlig kreft vev
for å evaluere Beclin en og Beclin 2 uttrykk og deres subcellulære lokalisering, utførte vi immunhistokjemi på 195 tilfeller av oral cancer vev og normale muntlige mucosas. Beclin en og Beclin 2 uttrykk ble hovedsakelig lokalisert i cytoplasma, og noen ganger i kjernen. Den normale muntlige mucosas viste svak til moderat cytoplasma uttrykk og samlingsatom uttrykk for Beclin en og Beclin 2 (Fig 1A og 1E). Den muntlige kreftvev utstilt variable cytoplasmatiske uttrykk for Beclin en og Beclin 2, fra total tap for diffuse sterkt uttrykk (fig 1B-1D og 1F-1H). De gjennomsnittlige Q scorene til cytoplasma Beclin en og Beclin 2 var 67,46 ± 55,19 og 75,26 ± 62,16 kroner. Cutoff poeng for Beclin en og Beclin to ble beskrevet i materialer og metoder. For cytoplasma Beclin 1, 111 tilfeller (56.92%) ble klassifisert som lav uttrykk, og 84 tilfeller (43.08%) ble klassifisert som høy uttrykk. For cytoplasma Beclin 2, 65 pasienter (33,33%) ble klassifisert som lav uttrykk; 83 pasienter (42,56%) ble klassifisert som moderat uttrykk; 47 pasienter (24,10%) ble klassifisert som høy uttrykk. Bare en liten del av oral cancer vev uttrykker kjernefysiske farging av Beclin 1 (33/195, 16,92%) og Beclin 2 (29/195, 14,87%) (figur 1C, 1D og 1I).
(A ) Svak til moderat cytoplasmisk og nukleær uttrykk for Beclin en i normal oral plateepitel slimhinnen. (B) Lav cytoplasma uttrykk for Beclin en i en muntlig kreft vev. (C) Høy cytoplasma og positiv atom uttrykk for Beclin en i en muntlig kreft vev. (D) Lav cytoplasma og positiv atom uttrykk for Beclin en i en muntlig kreft vev. (E) Svak til moderat cytoplasma uttrykk for Beclin 2 i normal oral plateepitel slimhinnen. (F) Lav cytoplasma uttrykk for Beclin to i en muntlig kreft vev. (G) Moderat cytoplasma uttrykk for Beclin to i en muntlig kreft vev. (H) Høy cytoplasma uttrykk for Beclin to i en muntlig kreft vev. (I) Moderat cytoplasma og positiv atom uttrykk for Beclin to i en muntlig kreft vev.
Associations of Beclin en og Beclin 2 uttrykk med clinicopathologic egenskaper og autophagosomal markør i oral cancer vev
Vi sammenlignet Beclin en og Beclin 2 uttrykk med alder, kjønn, tumorstørrelse, lymfeknutestatus, metastaser, scene, klasse, lymphovascular invasjon, og nekrose (tabell 1). Beclin en uttrykk var relatert til clinicopathologic funksjoner. Lav cytoplasma uttrykk for Beclin to var assosiert med høyere histologisk grad (en dårlig prognostisk faktor) sammenlignet med moderat og høy uttrykk. Positiv atom uttrykk for Beclin to ble koblet til dårlige prognostiske faktorer, blant annet lymfeknutemetastase og lymphovascular invasjon.
De kjernefysiske og cytoplasmatiske uttrykk for Beclin 1 viste svak korrelasjon (Spearmans rho = 0,287,
P
0,001). De kjernefysiske og cytoplasmatiske uttrykk for Beclin to ble også svakt korrelert (Spearmans rho = 0,212,
P
= 0,003). Den cytoplasmatiske uttrykk for Beclin en og Beclin to var urelatert (Spearmans rho = -0,072,
P
= 0,318). Relasjonene av Beclin proteiner og autophagosomal markør, LC3B, ble også vurdert. De autophagosomes representert ved LC3B punctae ble evaluert i vår tidligere studie [18]. Bare cytoplasmatiske Beclin en korrelert til graden av LC3B punctae (Spearmans rho = 0,305,
P
0,001) (Fig. 2)
Fargeskala for Spearmans rho koeffisienten er gitt i den nedre høyre, med grønne representerer en negativ korrelasjon og røde positive. *
P
0,05.
Tydelige uttrykk mønstre av Beclin proteiner er assosiert med dårlig prognose
Kaplan-Meier-kurver av kumulativ OS, DSS, og RFS sannsynligheter for Beclin en og Beclin 2 vises i figur 3. Pasienter med høyt cytoplasma Beclin en uttrykk viste lav DSS (
P
= 0,008), og de med negativ atom Beclin en uttrykk viste høye RFS (
P
= 0,036). Pasienter med enten høy eller lav cytoplasma Beclin to uttrykk hadde signifikant lavere OS og DSS priser sammenlignet med pasienter med moderat cytoplasma Beclin to uttrykk. Overlevelsessannsynligheter mellom pasienter med lave og høye cytoplasmiske uttrykk var ikke statistisk signifikante. Atom Beclin to uttrykk var unassociated med overlevelse status.
Resultatene av univariate og multivariate overlevelsesanalyser ved hjelp av Cox proporsjonal fare regresjon metoder er vist i tabell 2, 3 og 4. Høy cytoplasma Beclin 1 og negativ atom Beclin 1 var assosiert med dårlig DSS og RFS henhold univariate og multivariate analyser, henholdsvis. I tillegg cytoplasma Beclin to uttrykk var en uavhengig prognostisk faktor for OS og DSS. cytoplasmatiske lave og høye Beclin 2 uttrykk var assosiert med aggressiv kliniske utfall.
Enten Beclin en eller Beclin 2 overekspresjon induserer autofagi og fremmer oral kreft celle vekst
for å undersøke effekten av Beclin en og Beclin 2 overekspresjon i kreft i munnhulen, brukte vi SAS celler transfektert med plasmid som uttrykker flagg-merket Beclin en og Beclin to, henholdsvis. Overekspresjon av Beclin en eller Beclin 2 førte til økning av omdannelsen av LC3-I til LC3-II i henhold til normal tilstand. Men dette fenomenet ble inevident henhold sult tilstand (figur 4A). Forholdet mellom LC3-II /LC3-I og p62 nivå ble både økt i celler som overuttrykker Beclin en eller Beclin 2 sammenlignet med kontroll etter bafilomycin behandling i sult (S1 fig). Disse funnene bekrefter rollen Beclin 2 i autofagi pathway.
(A) SAS celler ble transfektert med kontroll plasmid, plasmider uttrykker flagg-merket Beclin 1 (B1) eller Beclin 2 (B2). Ved 24 timer posttransfection, ble cellene behandlet med Earles balanserte saltløsning (EBSS) i 1 time sult. Lysat ble fremstilt og analysert ved immunblot hjelp av de angitte antistoffer. Intensiteten av LC3-I og LC3-II ble målt ved å bruke ImageJ, og forholdet mellom LC3-II /LC3-I er vist nedenfor. (B) HEK293-celler som stabilt uttrykker GFP-LC3 ble transfektert med plasmid som uttrykker flag-tagget Beclin en eller Beclin 2 og dyrket i enten normal kulturmedium (DMEM) eller utsultingstilstand (EBSS) som angitt. Celler ble fiksert i 48 timer etter transfeksjon. Indirekte immunfluorescens farging ble utført ved anvendelse av anti-Flag M2. 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging viste kjernen. Boksen region forstørres (a). (C) SAS-celler ble transfektert med kontroll eller flag-tagget Beclin 1 og 2 Beclin i 24 timer. Transfekterte celler ble utsådd på 200 celler per brønn i 6-brønns plate. Etter 14 dager ble kolonier visualisert ved anvendelse av 1% krystallfiolett i metanol. Forsøkene ble gjennomført tre ganger uavhengig av hverandre.
For å evaluere subcellulære lokalisering av Beclin proteiner, ble HEK293 celler transfektert med plasmid som uttrykker flagg-merket Beclin en og Beclin to, henholdsvis. Under normal tilstand, antallet av GFP-LC3 puncta var lav, og Beclin 1 og Beclin 2 ble for det meste lokalisert i cytoplasma (fig 4B, venstre panel). Etter autofagi induksjon av næringsstoff sult og bafilomycin behandling, viste celler økt LC3 punctae; Beclin en og Beclin 2 viste delvis colocalization med LC3 punctae (fig 4B, panel til høyre). I tillegg observerte vi at LC3 punctae ble utvidet i Beclin 2 overekspresjon celler i forhold til styre og Beclin en overekspresjon celler. Videre celler med enten Beclin en eller Beclin 2 overekspresjon ført til økt klonogene overlevelse evne sammenligne å styre transfekterte celler (fig 4C). Disse funnene tyder på at overekspresjon av Beclin en eller Beclin to aktiverer autofagi og fremmer kreft celle vekst og effekten av overekspresjon av Beclin en og Beclin to var uavhengige av hverandre.
Beclin 2 uttømming svekker autofagi og fremmer muntlig kreft celle vekst
for å undersøke effekten av Beclin 2 utarming og dens forhold til autofagi i munnhulekreft, transfektert vi sirnas rettet mot enten
beclin 2
eller
Atg5
i SAS celler . Fordi den endogene Beclin 2 nivået var lavt i SAS celler, ble effektiviteten av
beclin 2
knockdown av siRNA først bestemt i celler som stabilt uttrykte flagg-merket Beclin 2. Celler stabilt uttrykker Beclin 2 viste høyere andel av LC3- II /LC3-I (figur 5A, venstre panel). Etter trans siRNA målretting
beclin 2
eller
Atg5
, uttrykk for Beclin to eller Atg5 ble betydelig redusert, og forholdene mellom LC3-II /LC3-I ble redusert samtidig (figur 5A, rett panel). Selv om den endogene Beclin to var ikke i stand til å oppdage etter transfeksjon siRNA målretting
beclin 2
, den Beclin en og Atg5 nivåene var upåvirket, og forholdet mellom LC3-II /LC3-I ble redusert (figur 5B). Disse dataene antyder at Beclin 2 uttømming fører autofagi verdifall. Celler med enten Beclin to eller Atg5 uttømming viste klonogene overlevelse evne i forhold til de celler behandlet med kontroll siRNA (Fig 5C). Disse funnene tyder Beclin 2 uttømming svekker del av autofagi aktivitet, og fremmer veksten av kreft celler.
(a) SAS celler eller celler som stabilt uttrykker flagg-merket Beclin 2 eller (B) SAS celler transfektert med kontroll siRNA ( SCR), Atg5 siRNA (siAtg5) eller Berlin 2 siRNA (siB2). Cellelysat ble fremstilt etter 48 timers transfeksjon og analysert ved immunblot hjelp av de angitte antistoffer. (C) SAS-celler ble transfektert med kontroll siRNA (SCR), Atg5 siRNA (siAtg5) eller Berlin 2 siRNA (siB2) i 24 timer. Transfekterte celler ble utsådd på 200 celler per brønn i 6-brønns plate. Etter 14 dager ble kolonier visualisert ved anvendelse av 1% krystallfiolett i metanol. Forsøkene ble gjennomført tre ganger uavhengig av hverandre.
Diskusjoner
Beclin familien har 2 identifiserte medlemmer, Beclin en og Beclin 2. prognostisk rolle Beclin en har vært mye studert i ulike typer kreft hos mennesker, og pasientenes utfall bestemt av cytoplasma Beclin en uttrykk kan være spesifikke for krefttypen. For eksempel, lav ekspresjon av Beclin 1 assosiert med dårlig prognose i brystkreft [19, 20], eggstokk-kreft [21], lungecancer [22], hepatocellulært karsinom [23], kolangiokarsinom [24], bukspyttkjertelkreft [25], hypopharyngeal kreft [26], strupekreft [27], spiserørskreft [28], duodenal kreft [29], magekreft [30], lymfomer [31-33], etc. Høy uttrykk for Beclin en tilkoblet tumor aggressivitet i nasofaryngeal kreft [34], livmorkreft [35], og tykktarmskreft [36]. Undersøkelsene av Beclin en i oral cancer vev viste at høyt uttrykk var relatert til dårlig prognostiske faktorer og /eller aggressive kliniske utfall [37, 38]. Vår studie var i samsvar med tidligere undersøkelser, og vi avslørte videre at overekspresjon av Beclin en i SAS indusert tumorvekst i klonogene analysen, demonstrere sin rolle for tumorprogresjon hos munnhulekreft.
I denne studien først vurderte vi uttrykk og prognostisk rolle Beclin 2 i kreft hos mennesker. Vi avslørte at orale kreftpasienter med enten høy eller lav uttrykk for Beclin 2 viste dårligere prognose enn de med moderat uttrykk. Ekspresjonen av Beclin 2 var uavhengig av kreft trinn (tabell 1). Enten høy eller lav Beclin to uttrykk i kreftvev foreslo dysfunksjon i autofagi og metabolisme. Beclin 2 funksjonelle analyser viste videre enten det er uttømming eller overekspresjon fremmet tumorvekst i SAS oral kreftceller. Disse funnene antyder Beclin 2 er assosiert med tumorigenesis i oral cancer. Manipulering av genuttrykk av
beclin en
påvirket ikke Beclin 2 protein, og vice versa. De cytoplasmatiske uttrykk for de 2 proteiner ble også urelaterte i oral cancer vev (figur 2). Resultatene tyder på det molekylære mekanismen involvert i oral tumorgenesis av disse 2 proteinene er uavhengig.
Autophagy har vært innblandet i både tumor undertrykkelse og tumorprogresjon. Autophagy hemmer ondartet transformasjon av normale celler ved å opprettholde cellulær homeostase, normal metabolisme, og genomisk stabilitet [39]. På etablerte svulster, autofagi fremmer ofte tumorcellevekst ved å opprettholde forbrenningen i stressende tilstand [40, 41]. Imidlertid kan den faktiske påvirkning av autofagi på tumorigenesis være kontekstavhengig. Autofagi kan regulere cellevekst forskjellig avhengig av vevstyper og spesifikke genetiske innstillinger [42, 43]. Assosiasjonene mellom autofagi og Beclin proteiner har blitt godt dokumentert. Beclin proteiner samvirke med komponenter i klasse III fosfoinositid 3-kinase kompleks, noe som er nødvendig for initiering av autophagy [13, 44]. Beclin 1 er involvert i dannelsen av phagophore (forløper for den autophagosome) i de tidlige trinn av autophagy, og er colocalized med LC3 punctae [45, 46]. Våre data først demonstrerte colocalization av Beclin 2 og LC3, bekrefter at Beclin to er involvert i autofagi. Selv om vi fant at manipulasjoner av Beclin en eller Beclin to nivå førte til endring i autofagi, deres virkninger på tumorvekst kan ikke helt direkte følge av autofagi. Beclin en var i utgangspunktet å bli funnet å ha tumor suppressor funksjon [5]. Paradoksalt nok var høy uttrykk for Beclin en assosiert med tumorprogresjon hos noen kreftformer, som tidligere beskrevet [34-38]. Allel tap av
beclin en
hemmet tumordannelse i visse genotyper av mus [47, 48]. Beclin en ikke bare samhandler med positive og negative regulatorer av autofagi, men deltar også i flere ikke-autophagic prosesser [49]. Virkningene av Beclin en på tumorprogresjon kan være minst delvis uavhengig fra autofagi. Videre vår studie først etablert tilkobling av Beclin 2 og tumorprogresjon. Forholda Beclin 2 og tumorigenesis kan være mer komplisert. Den tumorprogresjon forårsaket av Beclin 2 overekspresjon og uttømming kan skyldes forskjellige mekanismer. Våre data og tidligere litteratur fant at knockdown av Beclin 2 svekket, men ikke helt avskaffet autofagi [13]. Veksten svulst forårsaket av Beclin 2 utarming kan fremkalt av autofagi og /eller autofagi uavhengige mekanismer. Beclin 2 aksjer flere samspill partnere av Beclin en, og i tillegg nødvendig for nedbrytning av GASP1 regulerte G protein-koblede reseptorer (GPCR) [13]. Mange GPCR er overuttrykt i kreft og bidra til kreftcellevekst [50]. Tap av Beclin 2 kan føre til akkumulering av noen GPCR og føre til tumorprogresjon.
