Abstract
Det har lenge vært antatt, men med overraskende lite bevis, en konkurranse mellom kjerne en Gal-transferase (C1GalT), Core 3 GlcNAc-transferase (C3GnT) og sialyl-transferase (ST6GalNAc-T ) for forlengelse av O-forbundet mucin-type glykaner innledes med GalNAcα-Ser /Thr. Denne undersøkelsen testet denne antagelse ved selektiv undertrykkelse av en av disse glycosyltransferases og deretter analysert uttrykk for enzymatiske produkter av de andre tre glycosyltransferases. Det ble funnet at siRNA undertrykkelse av C1GalT markert redusert uttrykk for Galβ1,3GalNAcα- (Core-1) og i mellomtiden økte uttrykk for sialyl-GalNAcα- (sialyl-TN), GalNAcα- (TN) og GlcNAcβ1,3GalNAcα- ( kjerne 3) -associated glykaner i humane tykktarmskreft HT29 og SW620 celler. Dette støtter en konkurransedyktig modifikasjon av GalNAcα-Ser /Thr mellom C1GalT, C3GnT og ST6GalNAc-T i O-glykan biosyntese. Som Tn, TF og sialyl-Tn er onkoføtal antigener og er over-uttrykt i de fleste menneskelige kreftformer, er denne informasjonen nyttig for utviklingen av glykosyltransferase målrettede terapeutiske strategier for kreftbehandling
Citation. Barrow H, Tam B, er Duckworth CA, Rhodos JM, Yu LG (2013) Suppression of Kjerne en Gal-transferase Assosiert med Reduksjon av TF og gjensidige Økning av TN, sialyl-Tn og Core 3 Glykaner i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 8 (3): e59792. doi: 10,1371 /journal.pone.0059792
Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 19 oktober 2012; Godkjent: 18 februar 2013; Publisert: 25 mars 2013
Copyright: © 2013 Barrow et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av en bevilgning (CR777) fra North West Cancer Research Fund og University of PhD Studentship. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Lu-Gang Yu er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Forfatterne bekrefter at denne redaksjonen medlemskap ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
biosyntesen av
O
-koblet mucin typen glykaner er en multi-trinn, sekvensiell, post-translasjonell prosess katalysert av uttrykkene og aktivitetene til en rekke glycosyltransferases. Biosyntesen Prosessen starter med tilsetning av
N
-acetyl-galaktosamin (GalNAc) til serin (Ser) eller threonin (Thr) rester av de fullstendig foldede /sammensatte proteiner for å danne den opprinnelige O-bundet GalNAcα- Ser /Thr struktur (Tn-antigen) katalyseres av ett eller to av en stor familie av opp til 20 tydelig UDP-N-acetyl-α-D-galaktosamin polypeptid GalNAc-transferaser (ppGalNAc-Ts) [1], [2]. Disse ppGalNAc-T-isoenzymer har forskjellige, men delvis overlappende, peptid spesifisiteter til proteiner på forskjellige Ser og Thr områder og blir forskjellig uttrykt i celler og vev under utvikling, differensiering og sykdomstilstander så som cancer [3], [4], [5 ]. Det første trinn i biosyntesen av O-bundne mucin typen glykaner antas å begynne i en inter ER-Golgi rommet [6], [7], [8] og avsluttes i Golgi-apparatet [9], [10].
ved å følge dannelsen av GalNAcα-Ser /Thr, kan GalNAc residuet modifiseres med en Gal rest katalyseres av Core-1 Gal-transferase (C1GalT) [11] for dannelse av kjerne en struktur, Galβ1,3GalNAcα – [Thomsen-Friedenreich (TF) antigen]. Den GalNAc rest av GalNAcα-Ser /Thr kan også bli modifisert med en GlcNAc rest katalyseres av kjernen 3 GlcNAc-transferase (C3GnT) for dannelsen av kjernen 3 strukturen GlcNAcβ1,3GalNAcα-. Den GalNAc rest av GalNAcα-Ser /Thr kan også bli modifisert med en sialinsyre rest av en sialyl-transferase (ST6GalNAc-T) for dannelse av sialinsyre-β1,6GalNAcα- (sialyl-Tn-antigen) [12], [13] . ST6GalNAc-I er antatt å være den dominerende sialyl-transferase for dannelsen av sialyl-Tn [13]. Dannelsen av sialyl-Tn terminerer sukkerkjede, mens den TF og kjernen 3 strukturer kan ytterligere påvirkes av andre glycosyltransferases på en trinnvis måte til å gi opp til 8 kjerner sammensatt glykosyleringsseter strukturer [14]. Kjernen 1 til 3 sukkerstrukturer kan også endres ved acetylering, fucosylation, sialysering eller sulfatering.
Det har lenge vært spekulert i at C1GalT, C3GnT og ST6GalNAc-T konkurrerer om å endre GalNAc rest av nyan syntetisert GalNAcα-Ser /Thr for dannelse av TF, kjernen 3 eller sialy-tn strukturer i levende celler [15], [16], [17]. Imidlertid er direkte bevis som støtter denne konkurranse modifikasjon av GalNA-modifikasjon raskende mangler. Mutasjon eller inaktivering av Cosmc, en ER-lokalisert molekylære anstand som er nødvendig for at enzymaktiviteten av C1GalT [18], er blitt vist å være assosiert med Tn syndrom, en sjelden autoimmun sykdom hvor subpopulasjoner av blodcellene bære ufullstendig glykosylert Tn antigen [19]. Behandling av humane cancerceller med O-glykosylering inhibitor benzyl-GalNAc, en kompetitiv inhibitor for C1GalT transferase og alfa-2,3-sialyltransferase, reduserer ekspresjon av cellulære sialinsyrer og øker ekspresjon av TF [20].
i denne studien, vurderte vi konsekvensen av selektiv undertrykkelse av C1GalT ved siRNA på uttrykk for TF, Tn, sialyl-Tn kjerne og 3-assosiert glykaner i humane tarmkreftceller.
Materialer og Metoder
Material
siRNA konstruerer mot C1GalT og egge kontroll ikke-måls siRNA ble hentet fra Dharmcon (Perbio Science, Northumberland, UK). Biotinylated-
Griffonia simplicifolia
lectin II (GSL-II) ble kjøpt fra Vector laboratorier (Peterborough, UK). Monoklonale antistoffer mot Tennessee (klon HB-TN1) og sialyl-Tn (klon HB-STn1) ble kjøpt fra Dako (Patologi Products, Ely, UK). FITC-konjugert jordnøttagglutinin (FITC-PNA) ble oppnådd fra Sigma.
Cellelinjer
Mennesketykktarmskreft HT29 og SW620 celler ble hentet fra den europeiske Cellekultur Collection på Public Health Laboratory, Porton Down Wiltshire, UK og dyrket i DMEM supplert med 10% FCS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 4 mM glutamin, som tidligere beskrevet [21].
Undertrykkelse av C1GalT Ekspresjon av siRNA
cellene ble dyrket i tre paralleller i 96-brønns plater (5,0 x 10
3 celler /brønn) i anti-biotiske fritt DMEM inneholdende 5% FCS ved 37 ° C i 24 timer før inkubert med eller uten 100 nM siRNA mot C1GalT eller kontroll egge ikke-målsøkende siRNA ved 37 ° C i 48 timer. Cellene ble vasket og lysert for protein kvantifisering og spille blotter.
Slot Blotting
De cellulære proteinekstrakter ble blottet til nitrocellulose membran med PR600 SlotBlot (Hoeffer vitenskapelige instrumenter, CA). Blottene ble blokkert med 5% BSA, 0,5% Tween-20 i PBS ved 4 ° C over natten før anvendelse av monoklonale antistoffer mot TF (TF5) (0,2 ug /ml) [22], Tn (0,2 ug /ml), sialyl -Tn (0,03 ug /ml) eller biotinylert GSL-II (0,6 pg /ml) i 1 time. Etter vasking og påfølgende anvendelse av peroksidase-konjugert sekundært antistoff (3 ng /ml) eller peroksidase-Extravidin (Sigma, 1:10,000 fortynning) i 1 time, ble blottene vasket og visualisert ved anvendelse av en kjemiluminescens super-signal immunoblotting deteksjon kit (Pierce ; Rockford IL, USA). Densitometry analyse av blotter ble utført ved hjelp av Image Lab programvare (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK).
fluorescens immunhistokjemi
SW620 celler ble dyrket i 8-brønn kammer lysbilder (BD Biosciences) (1 x 10
4 celler /brønn) i anti-biotiske fritt DMEM inneholdende 5% FCS ved 37 ° C i 24 timer før inkubering med eller uten 100 nM siRNA mot C1GalT eller kontroll egge ikke-målsøkende siRNA ved 37 ° C i 48 timer. Cellene ble fiksert i 2% paraformaldehyd i 10 min. Etter to vaskinger med PBS, ble cellene inkubert med 10% kaninserum i 1 time før anvendelse av antistoffer mot STN, Tn (begge 1/100 fortynning i 10% kaninserum), FITC-PNA (5 ug /ml) eller biotinylert GSL-II (5 ug /ml) i 2 timer. Cellene ble vasket med PBS og påføres med FITC-konjugert sekundært antistoff (1:100 fortynning) eller FITC-streptavidin (1:1,000 fortynning) i 1 time. Cellene ble vasket med PBS, montert med DAPI-inneholdende fluorescens monteringsmedium og avbildes med et Olympus B51 fluorescens mikroskop ved hjelp av et 40x objektiv.
Diskusjon
Undertrykkelse av C1GalT
Resultater og ble oppnådd etter siRNA behandling av humane tykktarmskreft HT29 og SW620-celler. Effektiviteten av C1GalT knock-down ble overvåket ved cellulær ekspresjon av TF med anti-TF-antistoff. C1GalT siRNA behandling av HT29-celler i 48 timer forårsaket effektiv undertrykkelse av C1Gal1T uttrykk som vist ved 86 ± 3% (gjennomsnitt ± SD) reduksjon av cellulær TF ekspresjon (Fig. 1 A og B). En tilsvarende reduksjon av TF-ekspresjon ble også observert i SW620 celler etter C1GalT siRNA behandling (figur 2 A og B).
A:. HT29 glykan ekspresjon i celleresponsen på C1GalT siRNA eller kontrollere siRNA. Etter behandling av cellene med C1GalT siRNA eller kontrollere ikke-målsøkende siRNA (con-siRNA), cellulære uttrykk for TF, Tn, sialyl-Tn og GSL-ll-bindende (GlcNAc-, Core 3-assosiert glykaner) ble vurdert ved slot blot med monoklonale antistoffer mot TF (TF5), Tennessee (HB-TN1), sialy-Tn (HB-STn1) eller med biotin-GSL-II. Parallelle blotter ble analysert med antistoff mot β-actin for likt protein lasting. Duplicate Vurderingene for hver blot. B: Kvantifisering av uttrykk for mobilnettet TF, Tn, sialy-Tn og GSL-II binding (GlcNAc-, Core 3-assosiert glykaner) i HT29 celle respons på C1GalT siRNA. Tettheter av spaltene Blottene ble kvantifisert * og ved sukker uttrykkene er uttrykt som prosentvis endring i det ikke-siRNA kontroll etter normalisering med protein lasting. * De blot tettheter av TF uttrykk fra ubehandlede og C1GalT siRNA behandlet HT29 celler var 5004 og 715; Tn 1314 og 4345; sialyl-Tn 1634 og 4868; GSL-II binding (kjerne 3) 489 og 1156 og tublin 1898 og 1928.
A: SW620 sukker uttrykk i celle respons på C1GalT siRNA eller kontrollere siRNA. Etter behandling av cellene med C1GalT siRNA eller kontrollere ikke-målsøkende siRNA (con-siRNA), cellulære uttrykk for TF, Tn, sialyl-Tn og GSL-ll-bindende (GlcNAc-, Core 3-assosiert glykaner) ble vurdert ved slot blot med monoklonale antistoffer mot TF, Tn, sialy-Tn eller med biotin-GSL-II. Parallelle blotter ble analysert med antistoff mot β-actin for likt protein lasting. Duplicate Vurderingene for hver blot. B: Kvantifisering av uttrykk for mobilnettet TF, Tn, sialy-Tn og GSL-II binding (GlcNAc-, Core 3-assosiert glykaner) i SW620 celle respons på siRNA C1GalT. Tettheter av spaltene Blottene ble kvantifisert * og ved sukker uttrykkene er uttrykt som prosentvis endring i det ikke-siRNA kontroll etter normalisering med protein lasting. * De blot tettheter av TF uttrykk fra ubehandlede og C1GalT siRNA behandlet SW620 celler var 5144 og 834; Tn 1437 og 4313; sialyl-Tn 1748 og 4792; GSL-II binding (kjerne 3) 481 og 1229 og tublin 1984 og 1982.
Å ha effektivt fortrengt C1GalT uttrykk, vi deretter sammenlignet de cellulære uttrykk for sialyl-Tn (STN), Tn og Core 3 glykaner. Uttrykk for cellulær sialyl-Tn og Tn glykaner ble vurdert av spille blot med antistoffer mot sialy-Tn og Tn. Ingen antistoff mot Kjerne 3 sukker er for tiden tilgjengelig og vi brukte derfor den
Griffonia simplicifolia
lectin II (GSL-II) bindende som en indikator på uttrykket av kjerne 3-forbundet glykaner. GSL-II er et lektin isolert fra
griffonia (Bandeiraea) simplicifolia
og gjenkjenner a- og p-bundne GlcNAc-rester i den ikke-reduserende terminal av alle oligosakkarider [23]. Det ble funnet at undertrykkelse av C1GalT resulterte i 198 ± 8% økning av sialyl-Tn og 136 ± 24% økning av GSL-ll-bindende (GlcNA-, Core 3) henholdsvis, i HT29 og 174 ± 11% og 155 ± 37 % økning i SW620 celler (fig. 1 og fig. 2). Undertrykkelse av C1GalT ble også sett å bli ledsaget av en markant økning av TN uttrykk i HT29 (231 ± 6%) og SW620 (200 ± 5%) celler.
For å bekrefte disse glykolyseringsmetoder observerte endringene av sporet blot, vi videre analysert uttrykk for disse glykaner i SW620 celler i sitt svar til C1GalT siRNA av immunohistochemstry. Behandling av cellene med C1GalT siRNA viste igjen klar reduksjon av cellulær TF uttrykket (PNA binding) og markert økning av Tn, sialyl-Tn og kjerne 3 (GSL-II-bindings) uttrykk mens behandling av cellene med kontroll siRNA viste liten effekt på uttrykkene for disse glykaner (Fig. 3).
sub-konfluente SW620 celler dyrket i 8-brønns glass kammers objektglass ble behandlet uten eller med C1GalT siRNA eller kontrollere ikke-målsøkende siRNA i 48 timer før uttrykkene celle TF, Tn, sialyl-Tn og GSL-II binding (Core-3-forbundet) glykaner ble vurdert av fluorescens immunhistokjemi hjelp biotin-PNA, biotin-GSL-II eller antistoffer mot Tn (HB-TN1) eller sialyl-Tn (HB -STn1). Representative bilder vises.
Disse resultatene viser at undertrykkelse av C1GalT som styrer biosyntesen av Core en struktur av mucin type O-forbundet glykaner er ledsaget av økt uttrykk for sialyl-Tn og GSL- II binding (kjerne 3) i humane tarmkreftceller. Dette støtter den lang mistenkt konkurransedyktig modifikasjon av GalNAc rest av GalNAcα-Ser /Thr mellom C1GalT, C3GnT og ST6GalNAc-T i biosyntesen av komplekse O-bundne glykaner mucin typen. Et skjematisk diagram av initiering og forlengelse av mucin typen O-bundne glykaner, som støttes av denne undersøkelsen, er vist i figur 4.
Undertrykkelse av C1GalT ble også observert i denne studien er å føre markert økning av mobilnettet Tn uttrykk. Dette indikerer at den endelige dannelsen av celle TF, Tn, sialyl-Tn kjerne og 3 glykaner styres ikke bare av aktiviteten til disse konkurrerende glycosyltransferases. Konsentrasjonene av nukleotid-sukkerdonor og hastigheten for substrat transport gjennom Golgi har blitt vist tidligere for å bidra til de uttrykk for spesifikke glykaner [17]. Den relative posisjonering av glycosyltransferases i Golgi er også rapportert å være en viktig bestemmende faktor. Arbeid ved Kellokompu og medarbeidere [24], [25] og ved selv [26] har vist at Golgi forstyrrelse forekommer i epiteliale kreftformer og kan etterlignes ved midler som blokkerer normal Golgi surgjøring, i begge tilfeller fører til økt dannelse av onkoføtal-karbohydratantigener . Videre kan ekspresjon og virkningen av ER-lokaliserte molekylære anstand også spille en rolle i ekspresjonen av onkoføtal-glykaner ved å styre foldingen og følgelig aktiviteten av de relevante glycosyltransferases [18]. Således, de samlede cellulære uttrykk for Tn, sialy-Tn, TF og kjernen 3 strukturer er konsekvensen av en rekke komplekse faktorer som inkluderer konkurranse mellom de aktuelle glycosyltransferases, den romlige anordning av glycosyltransferases i Golgi, tilgjengeligheten av nukleotid-sukker -donors i Golgi-apparatet og handlinger av relevante molekylære anstand.
TN, TF og sialyl-Tn antigener er alle kjent som onkoføtal karbohydratstrukturer. De er uttrykt i foster epithelia da bli skjult av andre sukkerrester i frisk voksen vev, men oppstår på nytt i kreft og forstadier til kreft dysplastiske celler. Det er anslått at inntil 90% av alle humane cancere bære disse onkoføtal karbohydratantigener [27], [28], [29], [30]. Økt forekomst av disse onkoføtal karbohydratstrukturer er forbundet med utvikling og progresjon av forskjellige humane kreftformer, inkludert bryst [31], tykktarm [27], [32] og bukspyttkjertel [33] kreft. Økende bevis tyder på at endring av disse onkoføtal glykaner kan spille en aktiv rolle i metastasering. Sletting av tarmKjerne 1-avledet O-glykaner har nylig blitt vist å forårsake spontan kolitt hos mus [34]. Nedregulering av C3GnT6 ekspresjon er assosiert med økt dysplasi /neoplasi i human kolorektal kreft [35]. Over uttrykk for sialyl-Tn antigen av kreftceller har vist seg å føre til mer aggressive celle atferd som økt adhesjon til ekstracellulære matriks og økt migrasjon og invasjon
in vitro product: [36], [37] og
in vivo
alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus [37]. Overekspresjon av ST6GalNAc-I har vist seg å være co-lokalisert med sialyl-Tn i human intestinal metaplasi, så vel som i gastrisk karsinom, og har blitt foreslått å spille en viktig rolle i sialyl-Tn overekspresjon i kreft betingelser [12], [13] . En øket interaksjon mellom TF uttrykt på kreftassosiert mucin protein MUC1 og sirkulerer galectins, som et resultat av den økte ekspresjon av TF-uttrykkende MUC1 av kreftceller, og også av den økte frigjøring av galectins av kreft /stromal /immun vev /celler i sirkulasjonen, som begge er vanlige funksjoner i kreft, har vist seg å fremme kreftcelle metastatisk spredning til fjerntliggende organer [21], [38], [39]. Denne effekten av TF /MUC1-galectin interaksjon forekommer som et resultat av økt kreftcelle heterotypic adhesjon til vaskulært endotel [38], og også som et resultat av kreftcelle homotypisk aggregering under dannelse av mikro-tumor emboli som forlenge tumorcelleoverlevelse i sirkulasjon og la losji i kapillærer ved metastatisk stedet [40], [41]. Det har også blitt rapportert at brystkreftpasienter med høyere nivåer av anti-TF-antistoff viser bedre prognose enn pasienter med lavere anti-TF nivåer [42]. Rettet mot disse onkoføtal glykaner av immunterapi med TF-ligne peptider for potensiell kreftbehandling har vist lovende resultater i mus [43].
Dermed blir konkurransen mellom glycosyltransferases for modifisering av GalNAc rest av GalNAcα-Ser /Thr og dets konsekvenser for uttrykk for onkoføtal karbohydratantigener innebærer en potensielt nyttig strategi for utvikling av glykosyltransferase-målrettet terapi for kreft.
