Abstract
molekylær målrettet terapi har vist lovende som behandling for avansert leverkreft (HCC). Sorafenib, en multikinasehemmer inhibitor, nylig fått FDA-godkjenning for behandling av avansert HCC. Men selv om sorafenib er godt tolerert, bekymring for sin sikkerhet har blitt uttrykt. Celecoxib (Celebrex®) er en selektiv cyklooksygenase-2 (COX-2) inhibitor som oppviser antitumor-effekter i humane HCC celler. Denne studien undersøkte samspillet mellom celecoxib og sorafenib i to humane lever tumorcellelinjer HepG2 og Huh7. Våre data viser at hver inhibitor alene redusert cellevekst og kombinasjonen av celecoxib med sorafenib synergistisk hemmet cellevekst og øke apoptose. For bedre å forstå de molekylære mekanismene bak den synergistiske antitumoraktivitet av kombinasjonen, vi undersøkt ekspresjonsprofilen av kombinasjonsbehandlede leveren cancercellelinjer under anvendelse av mikromatriseanalyse. Kombinasjonsbehandling vesentlig endret uttrykk nivåer av 1.986 og 2,483 transkripsjoner i HepG2 og Huh7 celler, henholdsvis. Gener funksjonelt involvert i celledød, signaltransduksjon og regulering av transkripsjon var overveiende oppregulert, mens gener involvert i metabolisme, cellesykluskontroll og DNA replikasjon og reparasjon ble hovedsakelig nedregulert ved behandling. Men kombinasjonsbehandlet HCC cellelinjer vises spesifisitet i uttrykket og aktiviteten av viktige faktorer involvert i hepatocarcinogenesis. Den endrede ekspresjon av noen av disse genene ble bekreftet ved semi-kvantitative og kvantitative RT-PCR og ved Western blotting. Mange nye genene dukket opp fra våre transcriptomic analyser, og ytterligere funksjonelle analyser kan avgjøre om disse genene kan tjene som potensielle molekylære mål for mer effektive anti-HCC strategier
Citation. Cervello M, Bachvarov D, Lampiasi N, Cusimano A, Azzolina A, McCubrey JA, et al. (2013) Novel Kombinasjon av Sorafenib og Celecoxib Gir Synergistic Anti-proliferativ og Pro-apoptotiske Effekter i human lever kreftceller. PLoS ONE 8 (6): e65569. doi: 10,1371 /journal.pone.0065569
Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, Storbritannia
mottatt: 11 februar 2013; Godkjent: 26 april 2013; Publisert: 12 juni 2013
Copyright: © 2013 Cervello et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra det italienske «Minis dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (Departementet for utdanning, universiteter og forskning) – MIUR FIRB427 MERIT n.RBNE08YYBM til MC og G.M .; D.B. er leder av Core Genomisk Facility på CHUQ-Cancer Research Centre, støttet av FRSQ-RR Cancer. Alle de genomiske eksperimenter og dataanalyser ble utført ved dette anlegget; M.C. har også blitt støttet delvis av et tilskudd til CNR fra det italienske departementet for økonomi og finans for prosjektet FaReBio di Qualità. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) representerer den femte hyppigste kreft og den tredje vanligste dødsårsaken av kreft [1], [2]. Selv om diagnostikk og behandling av tidlig stadium HCC har bedret seg betydelig, er HCC prognose fortsatt svært dårlig. Videre er avansert HCC en meget aggressiv tumor med en lav eller ingen respons på vanlige behandlinger. Derfor er nye effektive og godt tolerert terapi strategier presserende behov.
Sorafenib, en multikinasehemmer inhibitor som mål Raf kinaser samt VEGFR-2 /-3, PDGFR-β, Flt-3 og c-Kit , nylig mottatt FDA og EMEA-godkjenning for behandling av pasienter med avansert HCC. Men den lave responsrater tumor og bivirkninger forbundet med denne monoterapi indikerer behovet for å undersøke andre nye terapeutiske muligheter for HCC.
Målrettet behandling har kommet på banen anti-neoplastisk behandling og brukes enten alene eller i kombinasjon med konvensjonelle cytostatika. Molekylær-rettet behandling holder løftet for HCC [3]. Imidlertid, som i de fleste kreftformer, ved bruk av en enkelt molekyl målrettet middel ville neppe oppnå en langvarig remisjon eller kur i HCC, spesielt for sent stadium sykdom. Kombinasjonsbehandling blir derfor nødvendig, og det synes rimelig å spekulere i at en kombinasjon av to eller flere midler til slutt vil øke den terapeutiske gevinst.
HCC er vanligvis resultatet av kontinuerlig skade og kronisk inflammasjon. En viktig mediator av inflammasjon er den induserbare genet cyklooksygenase-2 (COX-2). Det er nå godt etablert som COX-2 er en viktig molekylære mål for anti-kreft terapi. COX-2 er kronisk overuttrykt i mange kreftformer, inkludert HCC [4] – [8]. I HCC, har vi og andre forskere vist at COX-2-hemmere kan ha potensielle terapeutiske effekter [9] – [13]
Bakgrunnen for å kombinere sorafenib med COX-2-hemmere i HCC kommer fra data publisert av. andre forfattere [14], men også fra våre egne publiserte data [12]. Vi demonstrerte at behandling av humane HCC celler med en COX-2-inhibitor er assosiert med aktiveringen av ERK1 /2, og at inhibering av MEK /ERK-signalveien ved en MEK-inhibitor forsterker antitumoraktivitet av inhibitoren. Total våre resultater tyder på at MEK /ERK banen ikke medierer cytotoksisitet indusert av COX-2-hemmere, men kan beskytte cellene mot død, som indirekte støtter rollen til MEK /ERK-veien i overlevelse signalene med HCC celler [12].
Derfor, basert på disse funnene ble det undersøkt virkningen av en kombinasjon av det selektive COX-2-inhibitor celecoxib med sorafenib. Synergistisk anti-proliferativ og pro-apoptotiske effekter ble oppnådd ved bruk av en kombinasjon av sorafenib med celekoksib. For bedre å forstå de detaljerte mekanismer av cytotoksiske effektene av celecoxib og sorafenib, vi også undersøkt og sammenlignet den globale genuttrykk av HCC celler behandlet med enten celecoxib eller sorafenib, eller de to stoffene som benyttes i kombinasjon.
materialer og metoder
reagenser, cellekultur, celleviabilitet, klonogene og proliferasjonsanalyser
Celecoxib (CLX) var en gave fra Pfizer Corporation Inc. (New York, USA), sorafenib (SOR) ble kjøpt fra Alexis Biochemical (Lausen, CH), og begge stoffene ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO). Den menneskelige leverkreft cellelinjer HepG2 (en human hepatokarsinom cellelinje, ATCC HB-8065) og Huh7 [15] (en gave fra professor Massimo Levrero, Sapienza University of Rome, Roma, Italia) som brukes i denne studien var av en lav smal passasje nummer og ble opprettholdt som tidligere beskrevet [16]. Alle cellene ble holdt ved 5% CO
2 og 37 ° C og rutinemessig avskjermet mot mycoplasma forurensning. Celleviabilitet analyser ble utført som tidligere rapportert [17]. Koeffisienten av interaksjon (CDI) ble brukt til å analysere effektene av medikamentkombinasjoner [18]. CDI er beregnet som følger: CDI = AB /(A x B). I henhold til absorbansen av hver gruppe, er AB forholdet av kombinasjonsgrupper for å kontrollere gruppe; A eller B er forholdet mellom de monoterapi gruppen til kontrollgruppen. Således verdier CDI mindre enn, lik eller større enn en indikerer at narkotika er synergistisk, additiv eller antagonistisk, respektivt. CDI mindre enn 0,7 indikerer at medikamentene er betydelig synergistisk. I tillegg ble statistisk analyse utført ved anvendelse av Students t-test (to-halet). Kriteriene for statistisk signifikans var
p
. 0,05
Effekten av forskjellige inhibitor konsentrasjoner på celle levedyktighet ble også vurdert å bruke en klonogene analysen. For denne analysen, 1,0-1,5 x 10
3-celler ble sådd ut i seks-brønners plater i vekstmedium, og etter over natten feste celler ble eksponert til enten å CLX, og SOR alene eller deres kombinasjoner eller bærer i 48 timer. Cellene ble deretter vasket med narkotika-free medium og fikk vokse i 14 dager i narkotika-frie betingelser. Kolonier som inneholdt mer enn 50 celler ble tellet. Relativ kolonidannelse ble bestemt ved forholdet mellom det gjennomsnittlige antall kolonier i behandlede celler til det gjennomsnittlige antall kolonier i celler behandlet med oppløsningsmiddel (DMSO). Alle forsøkene ble utført i duplikat og gjentatt to ganger.
Celleproliferering ble bestemt ved å estimere størrelsen på bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering i DNA av en kolo immunoassay (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland). I korte trekk, 5 x 10
3-celler ble dyrket i 96-brønners plater i de forskjellige konsentrasjoner av CLX og SOR alene eller deres kombinasjoner eller kjøretøy i 24 timer. BrdU ble deretter tilsatt ved 10 uM endelig konsentrasjon. Cellene ble videre inkubert i ytterligere 24 timer og deretter fiksert og behandlet med anti-BrdU-peroksidase i henhold til produsentens instruksjoner. Farge ble utviklet ved tilsetning av tetrametylbenzidin substrat og måles ved 490 nm. Fargeintensitet og absorbansverdiene direkte korrelert til mengden av BrdU inkorporert i DNA. Resultatene ble uttrykt som prosentvis hemning av BrdU-inkorporering over kontrollen. Verdier ble uttrykt som middel ± SD for tre separate eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer.
TUNEL Analyser
Cellene ble dyrket i 8-brønners kammerobjektglass over natten. Etter behandling i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av CLX, og SOR, enten alene eller i kombinasjon, ble cellene vasket to ganger med PBS og fiksert i 4% paraformaldehyd-løsning i 25 minutter ved romtemperatur. Apoptotiske celler ble oppdaget av terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick end-merking (TUNEL) assay bruker deadend ™ Colorimetric TUNEL System Kit fra Promega (Madison, WI), etter produsentens anvisninger. Antallet av apoptotiske celler ble bestemt ved å telle hvor mange prosent av brun-farge-positive celler. Minst 500 celler fra to forskjellige cellepreparater ble tellet for hver tilstand. Celler ble visualisert med en Axioskop mikroskop (Zeiss, Tyskland).
Western blotting Analyser
For Western blot analyse, ble helcellelysater oppnådd ved bruk av RIPA buffer (Cell Signa Technologies Inc., Danvers, MA) og Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [19], med primære antistoffer dannet mot survivin og TRIB3 /TRB3 (Abcam Limited, Cambridge, UK), DDIT3 /CHOP (Cell Signa Technologies Inc., Danvers, MA), β- aktin, YAP1 og DKK1 (Sigma-Aldrich Srl, Milan, Italia).
Gene Expression Profilering og dataanalyser
genekspresjonsanalyser ble utført ved hjelp av Agilent 44 K Menneskelig Whole Genome oligonukleotid Mikromatriser ( inneholdende ~44,000 gener), som tidligere beskrevet [20] – [23]. Alle microarray eksperimenter ble utført i duplikat, bruker dye-swap under merking. Den GeneSpring programvare (Agilent, Palo Alto, CA) ble brukt til å generere lister over utvalgte gener for ulike statistiske og visualiseringsmetoder. Nettverk og sti analyser av microarray data ble gjennomført ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare (https://www.Ingenuity.com). Den microarray data er avsatt til GEO database med tiltredelse antall GSE45340.
Semi-kvantitativ RT-PCR (sqrt-PCR) Analyser
Microarray data ble validert for utvalgte differensielt uttrykte gener av sqRT- PCR som tidligere beskrevet [21], [23]. Den β-aktin-genet ble anvendt som en referanse genet. De følgende sense- og antisense-primere ble benyttet, henholdsvis, for å forsterke human BIRC5 (5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3 «og 5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′), DDIT3 (CHOP) (5»-ATGGCAGCTGAGTCATTGCC-3 «og 5»-TCATGCTTGGTGCAGATTC -3 «), FABP1 (5′-CTCTATTGCCACCATGAGTTTC-3′ og 5»-GCTGATTCTCTTGAAGACAAT-3 «), HRK (5′-CTGTGTCCTTGGAGAAAGCTG-3′ og 5»-GTGTTTCTACGATCGCTCCAG-3 «), LARP6 (5»-GGAACAAGCTGGGATATGTGA- 3 «og 5′-GGTGGTCCTCATTCAACTCAA-3′), MT2A (5»-AAGAAAAGCTGCTGCTCCTG-3 «og 5′-TGGAAGTCGCGTTCTTTACAT-3′), YAP1 (5»-GGCAAAGACATCTTCTGGTCA-3 «og 5′-CATCATATTCTGCTGCACTGG-3′) og β-aktin (5»-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3 «og 5′-AGTACAGCTACGAGCAGTTCTTGTT-3»). PCR-reaksjoner ble utført ved bruk av følgende parametere: 95 ° C i 5 min, 94 ° C i 30 sek, 62 ° C for HRK, LARP6, 60 ° C for BIRC5, β-actin, FABP1, MT2A, YAP1, 58 ° C for DDIT3, og 72 ° C i 1 minutt, etterfulgt av en avsluttende forlengelsestrinn på 72 ° C i 8 min. Antallet av sykluser ble justert for å tillate deteksjon i det lineære området. Til slutt ble PCR produktene analysert ved elektroforese på agarosegel, fotografert og kvantifisert ved densitometrisk scanning.
Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) Analyser
Uttrykk av utvalgte gener ble kvantifisert ved kvantitativ real Time PCR (qPCR) med SYBR Grønn fluorescens (Qiagen, Milano, Italia) på StepOnePlus (Applied Biosystems). QuantiTect Primer Analyser for CCND1 (QT00495285), DDIT3 (CHOP) (QT00082278), DKK1 (QT00009093), FGF19 (QT02452289), FNDC3B (QT01882748), KLB (QT02454977), TRIB3 (QT00088543), LARP6 (QT00221445) ble kjøpt fra QIAGEN (Milan, Italia) og forsterkes som anbefalt. Relativ uttrykk ble beregnet ved hjelp av komparative C
t-metoden. Ekspresjon av genet av interesse ble beregnet som fold induksjon sammenlignet med kontroll (DMSO) og ble korrigert med kvantifisert uttrykk nivået av β-aktin (QT00095431).
Resultater
Kombinasjon av Celecoxib med sorafenib synergistisk reduserer celleviabilitet, celleproliferasjon og kolonidannelse og induserer apoptose i HCC celler
Ved hjelp av MTS assay vi først vurderes virkningene av sorafenib (SOR) og celecoxib (CLX) på levedyktigheten av to humane celle HCC linjer, HepG2 og Huh7, som viser forskjellige egenskaper inkludert differensiering, biologisk oppførsel og genetiske defekter, COX-2-ekspresjonsnivåer [21], så vel som Raf /MEK /ERK aktiviteter~~POS=HEADCOMP pathway [23]. Som vist i figur 1, behandling med CLX og SOR i 48 timer effektivt redusert levedyktighet i begge cellelinjer. Etter 72 timer med narkotika eksponering, IC
50-årene av CLX var 76 ± 9,9 og 72,5 ± 0,7 mikrometer i HepG2 og Huh7 celler, henholdsvis; IC
50-årene av SOR var 10,3 ± 1,1 og 10,1 ± 1,8 mikrometer i de samme cellene. Siden COX-2-mRNA-ekspresjon ikke påvises i HepG2 celler [10], [21], vil vekst-hemmende aktivitet av CLX synes å være stort sett COX-2-uavhengig i disse celler [21]. I tillegg vil den SOR-mediert vekst-inhibitorisk aktivitet ser ut til å være uavhengig av MEK /ERK sti inaktivering i HepG2-celler, fordi som tidligere rapportert, ekspresjonen av fosfo-MEK og fosfo-ERK1 /2 er knapt synlig i denne HCC cellen linjen [23].
Cell vitalitet ble vurdert av MTS analysen. HepG2 og Huh7-celler ble behandlet i 48 timer med de angitte konsentrasjoner av CLX og SOR, enten alene eller i kombinasjon. Data er uttrykt som prosentandel av kontrollceller og er gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer. *
p
0,05; **
p
0,01 versus sorafenib alene, # p 0,05; ## P. 0,01 versus celecoxib alene
Vi neste undersøkt de cytotoksiske effektene av SOR + CLX kombinasjon i begge HCC cellelinjer ved hjelp av MTS-analyser (figur 1). Den SOR + CLX kombinasjon vises betydelig økt cytotoksisitet i forhold til de enkelte agenter. CDI ble anvendt for å bestemme den type interaksjon mellom de midler (tabell 1). I begge cellelinjer oppsto sterk synergi når CLX ble brukt i kombinasjon med SOR (tabell 1).
Den cytotoksiske effekten av kombinasjonsbehandling ble ytterligere bekreftet ved hjelp av en klonogene analysen (figur 2). Celler ble behandlet i 2 dager med eller uten forbindelser, ble mediet aspirert og de ble deretter vasket med inhibitor-fri medium. Celler ble tillatt å vokse i ytterligere 14 dager. Det var en doseavhengig reduksjon i kolonidannende evne på grunn av kombinerte SOR + CLX behandlinger i begge cellelinjer. Faktisk, SOR + CLX kombinasjon med en fast doseforhold resulterte i en signifikant økning i tumorcelledreping som målt ved kolonidannelse analyser sammenlignet med de enkle midler (figur 2).
Cellevekst av HepG2-celler og Huh7 ble bestemt ved klonogene assay etter behandling med CLX og SOR, enten alene eller i kombinasjon. Celler ble sådd ut over natten og utsatt for CLX, og SOR alene eller i kombinasjon ved de angitte konsentrasjoner i 48 timer. Etter behandling ble hver brønn vasket og forsøket fortsatte i 14 dager i fravær av legemidler. Overlevende kolonier ble farget (venstre panel) og telles (høyre panel). Data er uttrykt som en prosentandel av koloni i kontrollceller og er gjennomsnitt ± SD av to separate eksperimenter som hver ble utført i duplikat. *
p
0,05; **
p
. 0,01 versus hvert middel alene
Siden anti-vekstvirkningene av den enkelte eller kombinerte behandlinger kan skyldes økt celledød og /eller redusert celle spredning, vi undersøkt separat stoffets virkninger på apoptoseinduksjon og DNA-syntese. Med hensyn til apoptose, behandling av HepG2 og Huh7-celler med opptil 50 uM CLX hadde neglisjerbare effekter på apoptose-induksjon som evaluert ved TUNEL assay (figur 3A). Behandling med 7,5 eller 10 uM SOR økte mengden av apoptotiske HepG2 celler til 3,4 ± 0,85%, og 5,5 ± 1,4%, henholdsvis. Imidlertid SOR + CLX kombinasjon betydelig økt apoptose i HepG2-celler sammenlignet med behandling med enten middel som anvendes alene (
p
0,05), mens det i Huh7-celler ble ikke observert noen effekt (figur 3B). Den BrdU-analysen ble brukt til å studere effekten av kombinasjonsbehandlingen på celleproliferasjon. Som vist på figur 3C, SOR + CLX kombinasjonen hadde en sterk synergistisk effekt på celleformering i begge cellelinjer, viser CDI-verdier under 0,5 og 0,6 i alle SOR + CLX legemidler kombinasjoner i HepG2-celler og Huh7-celler, respektivt.
(A) Påvisning av apoptose ved TUNEL analysen. Mikrofotografier av HepG2-celler behandlet i 24 timer med de angitte konsentrasjoner av CLX og SOR, enten alene eller i kombinasjon. Apoptotiske celler ble visualisert ved TUNEL-farging som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. (B) Kvantitativ analyse av TUNEL-positive HepG2 og Huh7 celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av to separate eksperimenter. *
p
0,05, mot hvert middel alene. (C) Celleformering ble bestemt ved BrdU-analyse. Cellene ble behandlet i 48 timer med de angitte konsentrasjoner av CLX og SOR, enten alene eller i kombinasjon. Data er uttrykt som prosent av kontrollcellene og er gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. *
p
0,05; **
p
. 0,01 versus hvert middel alene
Transcriptomic Analyse Identifiserer Gene Expression endringer Felles for begge og Unique til HepG2 og Huh7 Cells Etter Kombinasjonsbehandling
for å identifisere nye potensielle mekanismer den kombinerte virkningen av celecoxib og sorafenib, ble deres effekt på global genekspresjon i begge cellelinjer undersøkt og sammenlignet ved hjelp av DNA mikromatriseteknologi. Agilent 44 K humant helt Genome Oligonukleotid Mikromatriser (inneholdende ~44,000 gener) ble anvendt for å identifisere de globale genekspresjon endringer i HCC cellelinjer, etter samtidig behandling med 50 uM CLX og 7,5 uM SOR i 48 timer. Disse konsentrasjoner ble empirisk beregnet som de maksimale legemiddelkonsentrasjoner som ikke forårsaker en betydelig reduksjon i celleviabilitet (mindre enn 20-30%) og /eller endringer i cellemorfologi i løpet av behandlingsperioden (data ikke vist). Alle microarray eksperimenter ble utført i duplikat anvende dye-bytteavtaler for å unngå merking bias. Ved bruk av denne tilnærmingen, totalt 1.986 differensielt-uttrykte gener med ekspresjonsnivåer ≥2 gangers ble identifisert i HepG2-celler og 2,483 gener vist ≥2 fold ekspresjon i Huh7-celler. Blant disse 975 gener eller 1382 gener var oppregulert og 1,011 eller 1,111 gener ble nedregulert i HepG2 og Huh7 celler, henholdsvis. Det skal understrekes at i begge HCC cellelinjer det kombinerte SOR + CLX behandling produserte en dominerende reduksjon av gener assosiert med metabolisme, cellesykluskontroll og DNA-replikasjon og reparasjon, da tallrike gener involvert i DNA-replikasjon og reparasjon var spesielt nedregulert i HepG2-celler (se tabell 2A og 2C). Gener funksjonelt relaterte til celledød, signaltransduksjon og regulering av transkripsjon var for det meste oppregulert i både HepG2 og Huh7 celler (Tabell 2B og 2D). Gener involvert i cellevekst og proliferasjon og transport var forholdsvis opp- og ned-modulert i HepG2-celler, mens de hovedsakelig ble indusert i Huh7-celler (tabell 2). Tabeller S1 og S2 skjerm fullstendige lister over de forskjellig-uttrykte gener (≥2-fold) i SOR + CLX-behandlede HepG2 og Huh7 celler, henholdsvis.
Vår transcriptomic analyser sterkt bekreftet den observerte synergis virkningene av den kombinerte behandling i HCC celler. Vi har tidligere etterforsket de molekylære mekanismer (inkludert genekspresjon profilering) Celekoksibs [21] og sorafenib [23] cytotoksisitet i HepG2 og Huh7 celler. Venn diagram analyse basert på den tidligere publiserte og de ovenfor angitte gen listene var indikativ for et betydelig antall differensielt-uttrykte gener som utelukkende ble modulert på begge HCC cellelinjer bare ved den kombinerte SOR + CLX behandlingen (figur 4A). Dessuten viste de fleste av disse entydig modulerte gener tydelig HepG2 eller Huh7 celle spesifisitet ved SOR + CLX behandling (se figur 4B). Disse dataene er i overensstemmelse med våre tidligere funn om de ulike molekylære mekanismer av cytotoksiske virkningen av celecoxib eller sorafenib i HepG2 og Huh7 celler [21], [23]. Ovennevnte analyser også bedt oss om å vurdere om SOR + CLX-behandlede HepG2 og Huh7 celler kan skilles på grunnlag av deres genuttrykk profiler. Etter filtrering på to-fold signalintensitet, brukte vi en enveis ANOVA parametrisk test (Welch
t
-test; avvik ikke antatt lik) for å velge diskriminerende gener. Faktisk
t
test med en
p
-verdi cutoff på 0,005 valgt 174 gener for hvilke uttrykk skilte i HepG2 og Huh7 celler. Clustering analyse basert på listen 174 gener ble utført ved hjelp av standard tilstand treet algoritmen gitt i GeneSpring, avslører dannelsen av to store klase grupper som tydelig skille HepG2 og Huh7 celler ved behandling (Figur 4C). Ninety-ni gener fra listen 174-gener ble oppregulert i HepG2-behandlede celler, sammenlignet med Huh7 celler. Store klassifiseringer av disse genene inkludert celleproliferasjon, signaltransduksjon, metabolisme og transport. Gener oppregulert i Huh7-behandlede celler i forhold til HepG2 celler (75 gener) er hovedsakelig involvert i metabolisme, signaltransduksjon, regulering av transkripsjon, immunrespons og DNA replikasjon og reparasjon. Listen 174 gener er presentert i tabell S3.
(A) Venn-diagram analyser av gener, forskjellig uttrykt (≥2 ganger) i HepG2 og Huh7 cellelinjer ved CLX (50 mm) behandling, SOR (7,5 uM) behandling, og kombinert SOR + CLX behandling. (B) Venn-diagram sammenligning av vanlige og distinkte gener unikt modulert (≥2 ganger) i HepG2 og Huh7 celler bare følgende kombinert SOR + CLX behandling. (C) Hierarkisk clustering basert på listen 174 gener (2 ganger forskjell i genekspresjon;
p
-verdi cutoff på 0,05) som skiller HepG2 og Huh7 celler i henhold til deres reaksjon på kombin SOR + CLX behandling. Rød betyr oppregulering og grønne betegner nedregulering.
hovedbane og nettverk analyser generert gjennom bruk av oppfinnsomhet Pathways Analysis (IPA) programvare bekreftet de vanlige og distinkte store funksjonelt relatert til genet grupper, som ble funnet å være forskjellig uttrykt i SOR + CLX-behandlede HepG2 og Huh7 celler (figur 5). Spesielt de beste funksjonelle trasé nedregulert i begge cellelinjene ble de knyttet til celle- syklus, DNA replikasjon, rekombinasjon og reparasjon, lipidmetabolisme og lite molekyl biokjemi (figur 5B og 5D), mens trasé i forbindelse med celle utvikling og genuttrykk ble funnet å være vanlige fremkalt (figur 5A og 5B). Pathways relatert til celledød og cellevekst og proliferasjon ble både indusert og undertrykket i de to cellelinjene, selv om det, som ventet, i hvert HCC cellelinje celledødsveier var sterkere enn indusert trykkes (figur 5A-5D). De to HCC cellelinjer vises også noen forskjeller ved SOR + CLX behandling; dermed trasé i forbindelse med cellesammensetning og organisering var overveiende nedregulert i HepG2 celler (figur 5B), mens trasé funksjonelt relatert til vitamin, mineral og aminosyre metabolisme ble stort sett nedregulert i Huh7 celler (Figur 5D). Følgelig veier forbundet med cellulær bevegelse, cellemorfologi, cellefunksjon og vedlikehold og cellesyklus var sterkere oppregulert i HepG2-celler (figur 5A), mens Huh7-celler viste spesifikk oppregulering av veier relatert til karbohydratmetabolisme, molekylære transport, lite molekyl biokjemi og DNA replikasjon, rekombinasjon og reparasjon (figur 5C).
en nettverksanalyse identifisert en rekke svært viktige nettverk med en score ≥3 som var ned- eller oppregulert i HepG2 og Huh7 celler på kombinert SOR + CLX behandling. Som forventet, både for HCC cellelinjer de fem-scoring oppregulert nettverk ble i hovedsak knyttet til funksjoner knyttet til celledød og genuttrykk, mens topp-scoring nedregulert nettverk ble hovedsakelig knyttet til cellesyklusen og metabolisme (tabell S4 ). Her igjen, vises hver av de to HCC cellelinjer noen spesifisitet i nettverket modulasjon: således til HepG2-celler, ble de fem-utføre oppregulert nett for det meste assosiert med proteinsyntese og molekyl transport (tabell S4A), mens for Huh7-celler, topp-scoring oppregulert nettverk ble i tillegg knyttet til celle montering og organisasjon, cellefunksjon og vedlikehold og cellesyklus (tabell S4B). Funksjonelle nettverk koblet til DNA-replikasjon, rekombinasjon og reparasjon ble spesifikt undertrykt i HepG2-celler (tabell S4C), mens Huh7-celler som vises nedregulering av nettverkene knyttet til cellulær funksjon og vedlikehold, RNA post-transkripsjonell modifikasjon, cellulær montering og organisasjon, molekylære transport og immunrespons (tabell S4D).
Vanlige nettverk, generert ved sammenslåing av fire topp-scoring nettverk som inkluderte både ned- og opp-regulerte gener (≤2 fold), anerkjent noen funksjonelt-relaterte genet noder som ble spesifikt modulert i de to HCC cellelinjer ved SOR + CLX behandling (figur 6 og 7). Spesielt i HepG2 celler en rekke gen noder implisert i cellesykluskontroll og DNA replikasjon, rekombinasjon og reparasjon (inkludert erbB2, EPO, CCNE1, CDC25A, CCNB1, BIRC5, NDC80, BUB1, PXN, KPNB1, KITLG, CDCA5, CDCA8 , TCF3, CDH1, CDKN3) var nedregulert, mens genet noder koblet til celledød (inkludert bilsportforbund, SOX4, EPAS1, S100P, IRS2, LCN2, IGFBP1, TRIB3, PHLDA2, AURKB) var for det meste indusert, med unntak av AURKB gen node (figur 6). Gene noder spesielt nedregulert i Huh7 celler inkludert en rekke cellesyklus og transkripsjon regulatorer (CCND1, CCNE1, TCF3, FANCA, CENPF, FGFR3, ID1, ID2, ID3, MSX1 og medlemmer av NF-kB kompleks), samt som gener involvert i RNA post-transcriptional modifisering (CDKN2A, SREK, SRSF1), mens oppregulert noder (inkludert SP1, ATF3, SRSF1, BMP4, MSX1, KLF4, JMJD6) var for det meste i forbindelse med kontroll av celledød (figur 7) .
de fire toppscorings nettverk har blitt slått sammen og vises grafisk som noder (gener /genprodukter) og kanter (de biologiske relasjoner mellom nodene). Intensiteten av noden farge angir graden av opp- (rød) eller ned (grønn) -regulation. Noder vises ved hjelp av ulike former som representerer funksjonsklasse av genproduktet (firkant = cytokin, vertikal oval = transmembrane reseptor, rektangel = kjernefysisk reseptor; diamant = enzym; rhomboid = transporter; seks = oversettelse faktor; horisontal oval = transkripsjonsfaktor; sirkel = andre). Kantene er vist med ulike merkelapper som beskriver innholdet i forholdet mellom nodene: –
bindende bare
, →
virker på
. Lengden av en kant reflekterer bevis som støtter at node-til-node forhold og kanter støttes av artikler fra litteraturen er kortere. Prikkete kantene representerer indirekte interaksjon.
De fire toppscorings nettverk har blitt slått sammen og vises grafisk som noder (gener /genprodukter) og kanter (de biologiske relasjoner mellom nodene). Figur legender er som beskrevet i Figur 6.
Validering av Microarray funn med semi-kvantitativ RT-PCR (sqrt-PCR) og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
For å validere våre microarray resultater, vi tilfeldig valgt 13 differensielt-uttrykte gener følgende kombinasjonsbehandling. Noen av disse genene ble tidligere rapportert å bli påvirket av sorafenib og av celecoxib og er involvert i reguleringen av apoptose, ER stress respons, DNA-skade respons, celle-proliferasjon og invasjon. Disse genene inkludert BIRC5 (survivin), cyclin D1 (CCND1), Harakiri (HRK), DNA-skade-induserbare transkripsjonsfaktor 3 (DDIT3, også kjent som GADD153 eller CHOP), Tribbles-relaterte protein 3 (TRIB3, også kjent som TRB3 ), metallothionein 2A (MT2A), La ribonucleoprotein domene familiemedlem 6 (LARP6), Ja-assosiert protein 1 (YAP1), fettsyrebindende protein 1 (FABP1, også kjent som lever-type fettsyre-bindende protein, L- FABP), og Dickkopf 1 (DKK1). I tillegg, ekspresjon av andre gener nylig rapportert å være involvert i hepatocarcinogenesis, slik som Klotho-beta (KLB), fibroblast vekstfaktor 19 (FGF19), fibronektin type III domene-inneholdende 3B (FNDC3B), ble også analysert. Genekspresjon ble kvantifisert ved sqrt-PCR og i noen tilfeller ved QRT-PCR i kontroll og i behandlede celler. ROT-PCR og QRT-PCR-analyser ble utført på prøvene som tidligere anvendt for de eksperimenter microarray så gjentatt ved bruk av RNA ekstrahert fra to andre forskjellige eksperimenter. Tabell 3 viser genuttrykk målinger av alle validerte genene.
Validering av Microarray Funn med Western Blotting
Microarray data viste at genet som koder for survivin (BIRC5) var betydelig ned -regulated i HepG2-celler etter behandling med kombinasjonen sammenlignet med monoterapi.
