Abstract
Det er økende bevis for at mange solide tumorer er hierarkisk organisert med bulk tumorceller har begrenset replikering potensial, men opprettholdes av en stilk-lignende celle som foreviger svulsten. Disse kreftstamceller har blitt antatt å stamme fra transformasjon av voksen vev stamceller, eller gjennom re-oppkjøp av stilk-lignende egenskaper av stamceller. Adenosquamous karsinom (ASC) er en aggressiv type lungekreft som inneholder en blanding av celler med plateepitel (cytokeratin 5+) og adenokarsinom (cytokeratin 7+) fenotyper. Opprinnelsen til disse blandingene er uklart plateepitel karsinom antas å oppstå fra basal celler i de øvre luftveiene, mens adenokarsinomer antas å danne fra stamceller i bronkial alveolar krysset. Vi har isolert og karakterisert kreft stilk-lignende populasjoner fra ASC gjennom bruk av selektiv definert kulturmedium opprinnelig brukt til å dyrke humane lunge stamceller. Homogene celler valgt fra ASC vevsprøver ble stabilt utvidet
in vitro
. Primære xenograft og metastatiske lesjoner avledet fra disse cellene i NSG mus fullt rekapitulere både adenokarsinom og squamous funksjoner i pasientens svulst. Interessant, mens den CSLC alt co-uttrykte cytokeratins 5 og 7, mest xenograft-celler uttrykt enten en, eller ingen av delene, med 10% gjenværende dobbel positiv. Vi viste også potensialet i CSLC å differensiere til multi-avstamning strukturer med forgrening lunge morfologi uttrykke bronkial, alveolære og nevroendokrine markører in vitro. Tatt sammen egenskapene til disse ASC-avledede CSLC antyder at ASC kan oppstå fra en primitiv stamcelle lunge forskjellig fra bronkial-alveolare eller basal stamceller.
Citation: Mather JP, Roberts PE, Pan Z, Chen F, Hooley J, Young P, et al. (2013) Isolering av Cancer Stem lignende celler fra menneskelige Adenosquamous Carcinoma av Lung Støtter et monoklonalt Origin fra et Multipotential Tissue Stem Cell. PLoS ONE 8 (12): e79456. doi: 10,1371 /journal.pone.0079456
Redaktør: Alan P Fields, Mayo Clinic College of Medicine, USA
mottatt: 24 april 2013; Godkjent: 23 september 2013; Publisert: 04.12.2013
Copyright: © 2013 Mather et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Ingen strøm eksterne finansieringskilder for denne studien. Arbeidet ble fullfinansiert av MacroGenics, Inc. gjennom bedriftens pengeinnsamling fra private equity. Oppdragsgivers var ikke involvert i noen aspekter av design og gjennomføring av forsknings
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: dette arbeidet ble fullfinansiert av MacroGenics, Inc. gjennom bedriftens pengeinnsamling fra private equity. Alle forfattere ble ansatt i MacroGenics, Inc. når dette arbeidet ble utført og egne opsjoner og /eller aksjer i selskapet. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
kreft stamcelle hypotesen sier at kreft oppstår fra mutasjons eller epigenetiske forandringer i vev stilk (eller progenitor-celler), som gjør at disse cellene å unnslippe indre og ytre vekstkontroll og blir invaderende [1]. I tillegg til den sterke bevis som støtter denne hypotesen i hematopoetiske kreft, er det en økende mengde bevis for at en rekke solide tumorer, inkludert hjernen, tykktarm, bryst og lunge [2] er hierarkisk organisert med en undergruppe av selvfornyende stem- lignende celler. Videre er det nylig direkte bevis fra dyremodeller som kolon, hjernen, og hudkreft kan oppstå fra vev stilk-lignende celler som finnes i voksent vev [3-5]. Stammen aktige egenskapene til selvfornyelse, tumorgenisitet, medikamentresistens, og evnen til å rekapitulere alle celletyper i svulsten, har tillatt søkere for å løse viktige spørsmål vedrørende biologien til denne cellepopulasjon, som bærer direkte på pasientbehandling [3,6].
Det er dokumentert fra både dyremodeller og menneskelig sykdom som lungekreft er blant de som oppstår fra stilk-lignende celler [7-10]. Imidlertid er kilden til stamceller (SC) som er involvert i normal lunge utvikling, vedlikehold og reparasjon etter skade noe mer komplisert enn vev så som hud eller kolon (for oversikter se: [11,12]), hvor flere «betinget «stamceller har vært antatt å være involvert i reparasjon av forskjellige deler av lungen etter skade [13]. Disse kan, eller kan ikke, være de samme stamcellene ansvarlig for vev vedlikehold [14]. Det har blitt foreslått at i løpet av lunge cancer, NSCLC (ikke-småcellet lungekreft) adenokarsinomer oppstår fra SC på bronkial alveolar krysset (BASC), plateepitel karsinom oppstår fra basal SC i bronkiene og luftrøret, og små karsinomer oppstår fra lunge neuroendocrine cellene [11,12].
Adenosquamous karsinom (ASC) i lungen er et sjeldent subtype av NSLC cancer diagnostisert av tumorer som inneholder både celler med squamous og adenokarsinom (AC) histologiske fenotyper (definert som 10% av hver). ASC omfatter 4-8% av NSCLC, men er veldig aggressiv, slik at pasienter med ASC har en dårligere prognose at de med enten plateepitelkarsinom eller adeno-karsinom [15]. Det har blitt antatt at slike tumorer oppstår enten fra blandinger av celler avledet fra de to tumorer av forskjellige typer, det ytterligere mutasjon av en type som gir opphav til den andre, eller en monoklonal opprinnelse hvor begge være avledet fra en felles, som ennå uidentifiserte, forløper [16-19]. Studier på ASC svulster fra pasienter har vist at celler fra adeno og squamous partier av en svulst har lignende, men ikke nødvendigvis identiske, kromosomale abnormaliteter [16], eller mutasjoner [17] som tyder på en monoklonal opprinnelse for denne type tumor. Men dette betyr ikke utgjøre bevis på evnen til disse to fenotyper å oppstå fra en enkelt celle, og den cellen hvor ASC kan stamme forblir uidentifisert.
I denne rapporten beskriver vi kreft stammen lignende celler (CSLC ) isolert fra pasienter med ASC ved hjelp av definerte serumfrie dyrkningsbetingelser. Videre viser vi at disse cellene har egenskapene til selvfornyelse, tumorigenitet, og metastasering. Svulster avledet fra disse cellene, utpekte LUCA22 og LUCA35, inkludert de som stammer fra klonede enkeltceller og fra metastaser inneholdt begge komponentene med kjertel (adeno) differensiering og områder av plateepitel differensiering, som støtter et monoklonalt utstedt denne svulsten. Den CSLC vekstegenskaper, genekspresjon og evnen til å danne forgrenede strukturer i 3D ko-kultur med lunge stroma ytterligere støtter hypotesen om at disse CSLC ha stamcelle lignende egenskaper. I tillegg er xenotransplantater avledet fra disse CSLC inneholder cellene som var positive for chromagranin A, mucin 5A, vimentin, overflateaktivt protein D, aquaporin 5 og cytokeratins 5, 7, 14 og 20, som viser den evnen som disse celler til å gjennomgå multilineær differensiering. Disse data tyder på at ASC er monoklonale opprinnelse og muligens oppstå fra en primitiv stamcelle lunge forskjellig fra bronchiolar alveolar stamcelle (BASC) eller basal stamcelle av de øvre luftveiene.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Lungekreft vev ble innhentet gjennom den nasjonale Disease Forskning Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6. etasje, Philadelphia, PA 19103 (url: https://ndriresource.org/) . Institusjonelle IRBs godkjent NDRI protokoller for vev anskaffelse og bruk, og riktig informert samtykke ble innhentet fra pasienter ved NDRI. Ingen informasjon var tilgjengelig som ville på noen måte kompromittere anonymiteten av pasientene. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Den MacroGenics West Institutional Animal Care og bruk komité godkjente alle protokoller ved hjelp av mus. Alle operasjoner ble utført under bedøvelse, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Dyrene ble sjekket daglig og syke dyr fjernes og avlives. Alle dyrene ble avlivet ved slutten av forsøket før vev samling. Avlivning var av CO2 kvelning levert i en komprimert gass sylinder.
CSLC utvalg, utvidelser og karakterisering
Lungekreft vev ble innhentet gjennom den nasjonale Disease Forskning Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6. etasje, Philadelphia, PA 19103. Institusjonelle IRBs godkjent protokoller for vev anskaffelse og bruk, og riktig informert samtykke ble innhentet fra pasienter ved NDRI. Den lungekreft avledet cellelinjer ble utvidet fra ASC og AC svulster (eller svulst stroma) og master og arbeidscellebanker forberedt. Kort tandem repeat (STR) analyse ble brukt for identifisering.
De definerte vilkår som passer for normale menneskelige foster lungevev epitelceller stilk /stamceller [20] ble brukt først og deretter optimalisert empirisk for isolering og vekst av kreftvevet som tidligere beskrevet [21]. Serumfrie forhold ble utledet at anrike for og tillate utvidelse av, en liten populasjon av celler fra ASC og AC (men ikke squamous cell carcinoma (SCC)) av lungen. Tilsetning av 1-2% serum til hormon kosttilskudd eller supplementering med høy 10% (v /v) serum resulterte i en ikke-tumorigen populasjon av celler med begrenset vekstpotensial
in vitro
og egenskapene til stromaceller . Se Metoder S1 og tabell S1 for detaljerte metoder for isolering av celler fra svulster; og definert media og supplement konsentrasjoner for utvalget, utvidelse, kloning og differensiering av ASC-CSLC; og utvidelse av stromale celler. Betingelsene for differensiering av lunge stamceller i 3-dimensjonale Matrigel
TM kulturer ble modifisert fra Delgado et al som beskrevet i Methods S1. Tumorprøver og isolerte CSLC linjer ble kommersielt preget av deres unike Short Tandem Gjentatte mønstre ved hjelp av 16 STR regioner. Denne analysen er beskrevet i Methods S1 og oppsummert i Tabell S2.
Den tumor type og stadium (fra patologi rapporter) av de fire tumor CSLC og tre stromal CSLC kulturer er oppsummert i tabell S3. Fem ATCC cellelinjer, avledet fra AC, SC og ASC ved hjelp av seruminneholdende medium, ble benyttet som kontroller i en rekke eksperimenter. Det som kjennetegner disse linjene er oppsummert i tabell S4
Genetiske analyser
Reverse transkriptase (RT-PCR) analyse.
DNA ble isolert fra dyreprøver ved hjelp av veiviseren SV Genomisk DNA Purification kit følge produsentens protokollen (Promega). Humant DNA ble kvantifisert ved PCR ved anvendelse av human-spesifikke RPL19 gen primere og prober [22]. Primerne ble kjøpt fra SA biovitenskap som «RT
2 qPCR Primer analyser». Listen av primere og katalognumrene er gitt i tabell S5. For å vurdere ekspresjon av spesifikke gener, ble RT-PCR-reaksjoner utført på cDNA generert fra total-RNA isolert fra de enkelte CSLC kulturene ved hjelp RT² qPCR Primer Analyser og
GAPDH plakater (glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase) som en konstitutivt aktiv gen kontroll, og RT² SYBR® Grønn /ROX qPCR Mastermix (Qiagen). Ekspresjon av utvalgte gener ble også bestemt i normal human lunge og isolerte normale humane bronkiale epitelceller. Terskel Cycle (Ct) for hver primer sett ble bestemt ved å kjøre RT-PCR reaksjoner i ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Life Technologies Corporation). DCT for hver ISC-genet ble bestemt som (Ct [gene] – Ct [GAPDH]).., Deretter Relativ Expression til GAPDH fastsatt som 2
-DCt
Short tandem repeat (STR) analyse
Sixteen-locus kort tandem-repeat (STR) analyse ble utført på de originale vevsprøver, hvis tilstrekkelig materiale var tilgjengelig (7/9 tilfeller), på master og jobber cellebanker, og i lengderetningen på flere intervaller på hver linje, og på vev skåret ut fra mus tumorxenografter å evaluere identitet. STR Analysen ble utført med AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City CA). Amplified loci ble lastet inn i Applied Biosystems er 3730xl Automated Sequencer og analysert ved hjelp av Applied Biosystems er GeneMapper programvareversjon 4. MSI-H ble diagnostisert av tilstedeværelsen av alleliske ustabilitet på mer enn 5 av 15 autosomal STR loci [23].
mutasjon analyse.
mutasjonsanalyse på cellelinjene ble utført av to komplementære metoder. Analyse av
KRAS
ekson 2,
BRAF
ekson 15,
PIK3CA
eksoner 9 og 23, og Mutation Cluster Region (MCR) av
APC
exon 15 ble utført ved sekvensering amplifisert genomisk DNA som tidligere beskrevet [24,25]. MALDI-TOF-massespektrometri plattform og OncoCarta panel ble benyttet for å detektere mutasjoner på 238 steder i 19 genloci, inkludert de ovennevnte, slik som tidligere beskrevet [26].
Flowcytometri analyse
dyrkede celler ble fjernet med collagenase /dispase (Roche Applied Science) eller trypsin /EDTA (Invitrogen), vasket og resuspendert i F12 /DMEM medium (Gibco /Invitrogen) + 1,0% BSA (Rock immunochemicals). Celletall ble oppnådd utnytte Guava ViaCount reagenser (Guava Technologies). Femti tusen levedyktige celler ble alikvotert inn i rund-bundet, lav bindings HTS 96-brønners plater (Beckton Dickinson), inkubert med antistoff ved 4 ° C i 20 min., Vasket i analyse-buffer, og mot flekker, når det er nødvendig, med 2 mg /ml GAM-IgG (H + L) konjugert med Alexafluor532 eller PE (Invitrogen). Cellene ble vasket og enten fiksert i analyse-buffer + 0,1% formaldehyd (Polysciences), eller resuspendert i analysebuffer, og deretter analysert på et Guava-PCA96 eller en FACScan (Becton Dickinson). Data ble analysert ved anvendelse av programvaren FlowJo (TreeStar Inc.). Resultatene ble beregnet som bindende intensitet (log
10 [farget] – logg
10 [isotypekontrollantistoff]). Se Metoder S1 for ytterligere detaljer. ALDH ble vurdert ved hjelp av flyten basert ALDEFLUOR
® analysen (Stem Cell Technologies) [27] med underlaget titrert fra 01:10 til 1:. 100 fortynning
For dobbelt farging analyse av CK5 /7 binding, ble sammenflytende plater av cellene dissosiert med 0,05% trypsin /EDTA, nøytralisert med soyabønnetrypsininhibitor, og vasket ved sentrifugering. Den resulterende pellet ble fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA), etterfulgt av permeablization i 0,1% Triton-X-100 Primær-antiserum ble tilsatt i en 1:50 fortynning av muse-anti-human cytokeratin 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459), tilsettes på samme tid som 0,5 ug /ml av muse-anti-human cytokeratin 5 (Biocare Medical, # PM234AA). Sekundært antiserum var 1 ug /ml geit-anti-kanin Alex Fluor 488 (Life Technologies ™) tilsettes parallelt med 1 ug /ml geite-anti-muse-R-Phycoerytherin (Life Technologies ™). Ufargede prøver, sekundær-bare prøver, og enslige primære prøvekontroller ble brukt i analysen.
In vivo tumorigenicity
CSLC linjer ble implantert under nyrekapselen (SRC) av immunmangel NOD SCID felles γ kjeden reseptor knockout mus (NSG) mus som kollagen-embedded celler som tidligere beskrevet [ ,,,0],22,28] og tillatt å vokse i opptil 32 uker. Dyrene ble undersøkt på 2-8 måneder for svulster og metastaser. Tumorene ble fjernet og innleiret til IHC, eller separert til enkeltceller og anvendt for PCR-analyse eller markør som angitt.
Immunohistochemistry
Faste vev.
skåret tumor xenograft vev ble fiksert i 10% nøytral formalin (Sigma), innebygd i en parafin blokk og 5 um deler kuttet. Objektglassene ble de-paraffinized og rehydrert, forbehandlet med antigen henting løsning (citratbuffer pH 6) i en decloaking kammer (Biocare Medical), og farget i 1 time med angitte anti-humane antistoffer (for eksempel CD34, CD44) ved bruk av leverandørens protokoll ( Biocare Medical). Objektglassene ble vasket med PBS og inkubert i 30 minutter med geite-anti-muse HRP (MACH2, Biocare Medical) og diaminobenzidin kromogen substrat, deretter lett motfarget med hematoksylin og eosin.
Fryst vev.
For frosne snitt normalt humant lunge og lungekreft, LUCA-avledet xenoimplantater, celle pellets fra 2D kulturer, eller organoids fra 3D kultur ble innebygd i oktober, så cryostat seksjonert på 7 mikrometer. Seriesnitt ble fiksert i 4 ° C aceton i 10 minutter, og lufttørket i 30 minutter. Platene ble inkubert i 3% H
2o
2 i 10 minutter, fulgt av to skyllinger i buffer. 5% normalt geiteserum ble brukt til lysbildene i 10 minutter og deretter blåst av. Glassene ble inkubert med test antistoffer (konsentrasjoner og inkubasjonstider bestemt ved tidligere optimalisert protokoller) og vasket to ganger med buffer. Kontroller ble inkubert med en isotypekontrollantistoff svarende til hver forsøks antistoff testes. Etter primært antistoff inkubering ble objektglassene inkubert med Dako Envision HRP anti-mus eller kanin polymer i 30 minutter, fulgt av to skyllinger i buffer. Diaminobenzidene tetrahydroklorid (DAB) ble anvendt som et kromogen for å visualisere flekker.
Immunofluorescence på monolagskulturer.
Cellene ble dyrket enten på dekkglass eller glass kammers objektglass (Lab-Tek), deretter fiksert med 4% PFA og permeabilisert med 0,1% TritonX-100. Primær-antiserum ble 1 ug /ml av muse-anti-human cytokeratin 5 (Biocare Medical, # PM234AA), tilsettes på samme tid som en 1: 100 fortynning av kanin-anti-humant cytokeratin 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459). Sekundært antiserum var 2 ug /ml geit-anti-mus Alex Fluor 488 (Life Technologies ™) tilsatt samtidig med 2 ug /ml geit-anti-kanin-Rhodamine Red ™ -X (Life Technologies ™). Mus lgG1 ble anvendt som en isotype-kontroll, og sekundær-bare betingelser ble anvendt for ikke-spesifikk farging kontroller. Farging ble visualisert på en Nikon TE300 mikroskop med en ET Sedat Quad Filter Set og en Retiga Exi CCD kamera. ivision programmet ble brukt til å ta bilder.
Resultater
LUCA CSLC karakterisering
svulstvev, sendt på is, ble mottatt fra en kile reseksjon av primær lungesvulster. Vevet ble dispergert og cellene sådd ut i serumfrie betingelser (eller medium inneholdende serum for utvidelse av stromale celler). Dette definert medium utvalgt og ekspandert en liten andel av epitelceller fra 3 til 4 lunge adenokarsinomer (AC) (32 LUCA, LUCA33) og 2 av to adenosquamous karsinomer (ASC) (LUCA22, LUCA35) vev. I motsetning til dette ble ingen vellykkede kulturer erholdt fra plateepitel carcinom vevsprøver (4 separate forsøk) ved hjelp av denne samme medium. Tilsetningen av serum ved initiering av de primære kulturer fra tumor resulterer i tidlig utvidelse av stromale celler i 3 av tre tilfeller (f.eks LUCA11 (1% serum + hormon tilsetningsstoffer), LUCA36 (10% serum)), som kan bli utvidet for begrenset passasje og banked. Disse stromale celler har en fibroblastisk utseende i 10% FBS, og er ikke tumorigen når implantert på 5×10
5 under sub-nyrekapselen av en immundefekte mus.
STR Karakterisering og mutasjonsanalyse av tumor avledet cellekulturer
Short tandem repeat (STR) analyse på 16 steder ga et unikt mønster for hver av de 6 linjer, som var forskjellig fra hverandre og fra eventuelle ATCC linjer (se tabell S2). Tre av 4 linjer viste noe tap av heterozygositet når man sammenligner den tumorprøve (som kan omfatte ikke-tumorceller) og CSLC. Noen gevinst på heterozygositet ble sett med utvidet passasje (P47 = 150 populasjonsdoblinger)
mutasjonsanalyser viste at 100% av ASC (LUCA22) CSLC utstillinger et enkelt G12V punkt mutasjon i de kodende regioner i
KRAS
, uten mutasjoner funnet i
APC
eller
PIK3CA
. AC linjer (LUCA32 og LUCA33) hadde også et enkelt punkt mutasjon i KRAS bare (henholdsvis G12V og G12C) (tabell S3).
tumorigenitet og metastaser
For å teste for karsinogent potensial, LUCA22 cellene ved ulike inokulum (5x10e4, 5x10e3 eller 5x10e2) ble innebygd i kollagen knapper og implantert under sub-nyrekapsel (SRC) av alvorlig immunmangel NSG mus. Tumorer ble observert i det hele tatt celle inokulum av 31 uker (figur 1, tabell S6). Ved høyere celle Inokula metastaser ble observert i flere organer så tidlig som 10 uker etter SRC implantasjon. De metastaser økt i utbredelse og størrelse med tid med alle dyrene inokulert med høyest celle nummer som viser metastaser på 16 uker eller lenger. Metastaser ble sett i leveren, milten, bukspyttkjertelen, mesenteriet, pessar og noen ganger på fjerne steder som lunge og hjerne (figur 1). Celler inokulert subkutant vokste til svulster, men ikke metastaserer (5x10e5, opp til 24 uker).
Sammenligning av morfologi og histopatologi av den opprinnelige pasient svulst som LUCA22 ble avledet og xenografter og metastaser avledet fra LUCA22 CSLC. Deler av svulstene er farget med H E vise adenokarsinom (tykke piler) og plateepitelkreft (tynne piler) morfologi (topp 2 p, til venstre). Øverst til høyre 2 rader viser metastaser til lungene og leveren (piler) og H E deler av disse organene som viser metastatiske knuter (piler). Andre deler er farget for cytokeratins 5 (CK5), 7 (CK7) og 18 (CK18), eller vimentin (VIM). Den nederste raden er dobbel farget for stamcellefaktor (SCF-brun) og c-kit (CD117 (rød). Det innfelte boksen på nedre høyre viser økende forstørrelser på menneske LUCA22 celler (boks, piler) som har metastasized fra en sub nedsatt svulst på hjernen, farget for lunge svulst bestemt Napsin (rød) /TTF1 (brun) dobbel flekken.
Ett element som definerer cscs er at de kan danne en svulst fra en enkelt celle og rekapitulere morfologien av den opprinnelige pasientens tumor. for å teste hvorvidt en enkelt celle kan gi opphav til differensierte tumorer, ble åtte enkeltcellekloner avledet fra LUCA22 utvalgt for ekspansjon og implantasjon i SRC. tumorene vokste fra alle 8 kloner valgt for testing (figur 2 , Tabell S6). To av klonene viste metastaser etter 8 uker
in vivo
. det er således i stand til å gi opphav til en metastatisk svulst fra en enkelt celle i LUCA22 linjen. Deretter undersøkte man xenotransplantater avledet fra LUCA22 ASC til den opprinnelige pasienten svulsten ved hjelp IHC å se på markører karakteristisk for ASC.
de klonede LUCA22 cellene gir opphav til xenografter flekker som adenovirus og plateepitel karsinom. Xenografter som oppstår ved LUCA22 CSLC, 5 LUCA22 kloner, og en metastase fra klon 2G1 er vist farget med H E, Napsin /TTF1, eller p63 /CK5 etter 8 uker i dyr (A). Kloner som metastasized er angitt med *. B. xenografter avledet fra pasienten tumor (øverst) av LUCA 22 og xenografter avledet fra LUCA22 klone 5E11 på tider og forstørrelser angitt. Disse delene er dobbel farget for CK5 (rød) og CK7 (brun).
Komparativ analyse av pasient og xenografttumorer av IHC
Siden CK5 og CK7 uttrykk i ulike deler av samme tumor er karakteristisk for sykdommen for ASC, sammenlignet vi fordelingen av CK5 og CK7 farging innenfor den opprinnelige pasientens tumor, xenotransplantater avledet fra LUCA22 celler, LUCA22 kloner, og metastaser fra disse xenotransplantater. LUCA 22 avledet xenografter fremsto som en dårlig differensiert ASC som lignet den histologi av pasientens opprinnelige svulsten (figur 1). Noen områder av tumoren hadde utseende av et adenokarsinom og var positive for CK7 farging, mens andre områder av tumoren hadde trekk ved en plateepitel carcinom og farget positivt for CK5, således reprodusere ASC fenotype sett i den opprinnelige pasientens tumor. Selv tumorer avledet fra 500 celler oppviste ASC mønster av både CK5 og CK7 farving (data ikke vist). Metastaser til lungene og leveren også inneholdt celler som både var positive for CK5 og CK7 farging (figur 1).
For ytterligere å karakterisere disse svulstene, vi farget vev med to antistoffkombinasjoner som brukes av patologer å differensiere lunge adenokarsinomer (Napsin A + TTF1) [29] og plateepitelkarsinom (p63 + CK5) [30]. Disse to sett med antistoffer ble observert å farge forskjellige områder av foreldrenes svulst og alle 8 clonally avledet xenograft og metastaser (figur 2 A, Figur S1). Clonally avledet xenografter, dobbel farget for CK5 og CK7, også ble uttrykt i distinkte, men tilstøtende områder av svulsten (figur 2 B). Interessant, pasientens tumor, samt xenotransplantater, uttrykt CK18, en epitelial markør, og vimentin, en mesenchymale markør (figur 1), med den stromal parti av pasientens tumor, men ikke de xenograft, også farging positivt med anti- menneskelig vimentin antistoff.
I tillegg undersøkte vi svulstene for stamcellefaktor (SCF) og det er receptor CD117 (c-KIT) og ALDH1A1 [9], proteiner rapportert å spille en rolle i lunge tumorigenesis. Både pasientens tumor, og de xenograft tumorer var positive for begge SCF og CD117, som finnes i tilstøtende områder av tumoren (figur 1), selv om SCF-farging var mer omfattende enn CD117-farging (figur S2 A). ALDH1A1 også ble funnet i både pasienten og tumoren xenotransplantater avledet fra LUCA22 så vel som metastaser i lungen (fig S2 A, B). Den LUCA22 CSLC var positive for ALDH-aktivitet, hvorav en del kan bli nøytralisert ved ALDH1 spesifikk hemmer DEAB (figur S2 C)
Cytokeration ekspresjon i CSLC
Siden ekspresjonen av både CK5 og CK7, innenfor ulike områder av svulsten, er karakteristisk for ASC vi dobbel farget LUCA22 og LUCA35 CSLC monolag for CK5 og CK7 hjelp rhodamin eller FITC merkede antistoffer. Overraskende, de fleste CSLC celler var dobbelt positiv CK5 + CK7 +. De dobbelt fargede celler så ut til å ha varierende nivåer av CK5 og CK7 på cellene (figur 3). Dette gjaldt også for den clonally avledet linjen 5E11 (figur 3 D). Kvantifisering av CK5 og CK7 doble fargede celler ble utført ved hjelp av flowcytometri av permeabilized, faste og fargede celler (figur 4 A). Igjen, LUCA 22, klonede LUCA22 -5E11 og LUCA35 celler alle var overveiende dobbelt positiv for CK5 og CK7. Som kontroller ble fire ATCC serum-avledet cellelinjer dobbel farget for IHC og strømningsanalyse (Se resultater S1). Ingen viste denne doble fargemønster av CSLC. Interessant, når LUCA22 CSLC (inkludert enkelt celle kloner) får lov til å danne svulster CK5 og CK7 uttrykk sorterer inn i forskjellige cellepopulasjoner (figur 2 B). Dermed er det CK5 + /CK7-, CK5- /CK7 +, og en liten bestand av CK5 + /CK7 + celler i svulster (figur S4). Den store CK5- /CK7- befolkningen sett i spredt SQ og SRC svulster kan være forurensende murine stromale celler, siden vi ikke aktivt velger mot disse cellene for denne analysen.
immunfluorescens (paneler AG) og fasekontrast (H) i permeabiliserte monolagskulturer farget for CK5 (rød), CK7 (grønn), eller begge deler. LUCA22 (A-C) LUCA22 klon 5E11 (D) og LUCA35 (E-G) er vist. Paneler A-C og E-G viser det samme feltet individuelt farget og overlay av begge. Panel H viser den samme felt som (E-G) som et fasekontrastbilde. Alle bilder er 40X forstørrelse.
Panel A er data fra strømningsanalyse av permeabilized LUCA22 klone 5E11 og LUCA 35 ASC celler dobbel farget for CK5 og CK7. De% positive celler og logge signal fra strømningsanalyse av celleoverflateproteiner (B) er vist for to ASC-avledet CSLC (LUCA22 (mørkegrønne søyler), LUCA35 (lys grønn)), 2 AC-avledet CSLC (LUCA32 ( gul), LUCA33 (oransje)) og lungekreft stromale celler (LUCA11 (mørk blå), LUCA36 (lys blå)) i panel B. loggen binding (symboler) og prosent bindende løpet isotypekontrollantistoff (søyler) er vist for hver. Panel C viser en enkelt befolkning som to etiketter med CD44 og CD24 antistoffer for LUCA22 og LUCA35 celler.
Cell overflaten markør analyse
For ytterligere å karakterisere populasjonene selektivt avledet fra lunge celle svulster, celler fra 4 CSLC linjer (ASC: LUCA22, LUCA35, AC: LUCA32, LUCA33) og 2 stromale linjer (LUCA11, LUCA36) ble analysert ved strømningscytometri for binding av et panel av antistoffer mot humane markører ofte brukt til å velge om eller identifisere, CSLC fra faste tumorer (figur 4 B). CD44 og CD29 var til stede på alle linjer, inkludert stromal linjer. CD24 var til stede på alle fire av de CSLC linjer, men ikke de stromale celler. Ingen av linjene bundet enten av CD133 monoklonale antistoffer som er rapportert til å velge for CSC i noen svulster, selv om universalitet CD133 som en stamcelle markør i lungekreft har blitt utfordret [12]. Mucin 1 (MUC1) og stadium spesifikk embryonale antigen 1 (SSEA1) ble uttrykt ved et høyere nivå på strøm linjer enn de linjer, mens ASC ABCG2 er funnet på LUCA22, men ikke de andre linjer. Å se for homogenitet av befolkningen, ble det LUCA22-5E11 klone og LUCA35 cellelinjen dobbeltmerket for CD24 /CD44 (figur 4 C). Den doble merking viste at en populasjon bundet begge antistoffer. Fire kloner av LUCA22 ble selektert og analysert i parallell med LUCA22 foreldrelinjen. Binding var svært lik for de kloner og foreldrelinjen for de fleste markører med unimodale distribusjoner, selv om noen variasjon i topp binding ble observert. (Figur S5 A-C). Siden stamcelle markør CD117 ble funnet på bare en liten del av CSLC, forsøkte vi å anrike for denne pasientgruppen ved hjelp av FACS. Etter 4 påfølgende slag, var vi ikke i stand til å øke andelen av celler positive for CD117, noe som tyder på at disse cellene ikke representerer en delbar undergruppe av celler i CSLC (figur S5 D).
genuttrykk i CSLC linjer
for mer omfattende karakter genuttrykk i disse CSLC, vi så på et sett av 23 gener valgt fra de som angivelig uttrykt i AC og SCC lunge kreft og differensierte normale lungecelletyper ved rtPCR. Uttrykket mønster av ASC linjene var unik ved at de co-uttrykte (inkludert kloner) multiple gener antas å være karakteristisk for AC og SCC, samt et antall normale lunge avstamning markører. Uttrykket av en rekke gener var sterkt oppregulert i ASC linjer i forhold til strømledningene (figur 5) inkludert:
MAGEA3, MAGEA6, CSTA, TFPI2
,
KRT5, TWIST1
og
PTHLH
. Av disse ble bare den MAGEA3 /A6 uttrykk helt begrenset til lungekreftceller ( 30X høyere i ASC enn AC) og ikke sees i det hele tatt i tumoren stroma eller normale lungeprøver. Markører for andre differensierte celletyper ble uttrykt ved lave nivåer i CSLC (
SCGB1A1
, Clara celler;
MUC5AC
, slimceller;
AQP5
, skriver jeg pneumocytes, og
SFTPC
, BASC) eller på svært lave nivåer (
SFTPD
, type II pneumocytes;
CHGA
, nevroendokrine celler).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
