Abstract
proteasominhibitor bortezomib (VELCADE) er en lovende ny agent for blærekreft terapi, men induserbare cellebeskyttende mekanismer kan begrense sitt potensial effekt. Vi brukte hele genomet mRNA expression profilering for å studere effekter av bortezomib på stress indusert genekspresjon i et panel av menneskelig blære kreft cellelinjer. Bortezomib indusert sterk oppregulering av induserbare HSP70 isoformene HSPA1A og HSPA1B isoformer av HSP72 i 253J BV og SW780 (HSPA1A
høy) celler, men bare indusert HSPA1B isoformen i UM-UC10 og UM-UC13 (HSPA1A
lav) celler. Bortezomib stimulert bindingen av varmesjokkfaktor-1 (HSF1) til den HSPA1A promoter i 253JB-V, men ikke i UM-UC13-celler. Metylering spesifikke PCR viste at HSPA1A arrangøren ble metylert i HSPA1A
lave cellelinjer (UM-UC10 og UM-UC13), og eksponering for kromatinet demethylating agenten 5-aza-2′-deoxycytidine restaurert HSPA1A uttrykk. Overekspresjon av HSP72 fremmet bortezomib motstand i UM-UC10 og UM-UC13 celler, mens forbigående knockdown av HSPA1B ytterligere sensibilisert disse cellene til bortezomib, og eksponering for kjemikaliet HSF1 inhibitor KNK-437 forfremmet bortezomib følsomhet i 253J B-V celler. Endelig shRNA-mediert stabil knockdown av HSP72 i 253J B-V fremmet følsomhet for bortezomib
in vitro Hotell og i tumorxenotransplantater
in vivo
. Sammen våre resultater gir proof-of-concept for bruk av HSP72-hemmere for å fremme bortezomib følsomhet i blære kreft og foreslå at selektiv målretting av HSPA1B kunne produsere syntetisk dødelighet i svulster som viser HSPA1A arrangøren metylering
Citation. Qi W White MC, Choi W, Guo C, Dinney C, McConkey DJ, et al. (2013) Hemming av induserbare Heat Shock Protein-70 (HSP72) Forbedrer bortezomib celledød i Human blæren kreftceller. PLoS ONE 8 (7): e69509. doi: 10,1371 /journal.pone.0069509
Redaktør: Kevin Robert Kozak, University of Wisconsin School of Medicine og folkehelse, USA
mottatt: 11. desember 2012; Godkjent: 10 juni 2013; Publisert: 18.07.2013
Copyright: © 2013 Qi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av MD Anderson SPORE i Genitourinary Cancer (P50 CA091846), Cancer Center Support Grant (CA016672), og proteasomhemmingen og eR stress (R01 CA127494). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller perparation av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Nyere studier har vist at økt proteinsyntese (oversettelse) er avgjørende for neoplastisk transformasjon. Som en konsekvens av denne økningen, kreftceller ser ut til å være spesielt utsatt for medikamenter som hemmer eliminering av aggregerte eller misfoldede proteiner produsert som et vanlig biprodukt av proteinsyntesen. Proteasome spiller en sentral rolle i clearance av skadede proteiner, og proteasomhemmere indusere tumor celledød i stor grad via protein aggregering og proteotoxicity. Imidlertid er cytobeskyttende mekanismer oppregulert ved proteasomhemmingen, begrense innvirkningen på cancercelledød [1], [2], [3]. Derfor er det mulig at svulster som besitter defekt (er) i disse cellebeskyttende mekanismer vil være særlig følsom for proteasomhemmere. Dersom de relevante cellebeskyttende mekanismer kan identifiseres, kan det være mulig å identifisere disse svulstene prospektivt. Alternativt kan det være mulig å utvikle terapeutiske tilnærminger som forstyrrer disse cytobeskyttende mekanismene for derved å fremme proteasominhibitor følsomhet i tumorer som ellers ville være resistente mot denne klassen av legemidler.
Termisk sjokk induserer også proteinaggregering og proteotoxicity med varmesjokk proteiner (HSP) som fremmer varmetoleranse ved å hindre upassende stress-fremkalt proteinaggregering, bistå i riktig refolding av denaturerte proteiner, og, om nødvendig, å fremme deres degradering [4], [5], [6]. Medlemmer av Hsp70 familien er blant de mest konserverte proteiner i evolusjon og spiller avgjørende roller i disse prosessene [7]. Den store stress-induserbar medlem av familien Hsp70 anstand er referert til som HSP72, og kodes av to gener, HSPA1A og HSPA1B, som produserer HSP72-isoformer som deler alle unntatt to aminosyrer, og er antatt å være funksjonelt overflødig [8]. HSP72 uttrykk styres via rask aktivering av varmesjokkfaktor-1 (HSF1), en transkripsjonsfaktor som binder seg til flere spesifikke responselementene ligger innenfor HSP72 isoform arrangører og arrangører av andre varmeinduserte cellebeskyttende anstand [9]. HSP72 er svært homolog med 78 kDa glukose regulerte protein (HSPA5, GRP78 /BIP) som spiller en sentral rolle i å koordinere aktivering av utfoldet protein respons (UPR) og er også indusert av proteasomhemmere [10]. HSP72 blir konstitutivt uttrykt ved høye nivåer i maligne tumorer av forskjellig opprinnelse [11], [12], fremmer kreftcelleoverlevelse [13], [14]. Viktigere, HSP72 er også robust indusert av proteasomhemmere [15], [16].
I en tidligere studie rapporterte vi at om lag halvparten av menneske blære kreft celler er resistente mot de cytotoksiske effekten av bortezomib
i vitro product: [17]. Her har vi brukt genekspresjon profilering for å undersøke cellebeskyttende mekanismer som bidrar til bortezomibmetabolitter motstand, og fant at HSP72 er en av de mest robust induserte gener på mRNA-nivå etter eksponering bortezomib. Men vi fant ut at HSP72 uttrykket er isoform-spesifikt i en undergruppe av blærekreftceller (UM-UC10 og UM-UC13) som følge av arrangøren metylering av HSPA1A isoformen. Disse cellene DISPLAY økt uttrykk av den HSPA1B isoformen slik at basal og bortezomib-indusert HSP72 protein nivåer er lik de som finnes i cellelinjer som uttrykker både A1A og A1B isoformer (253JB-V og SW780). Vi rapporterer også at undertrykkelse av HSP72 induksjon forbedret bortezomib-indusert celledød i både 235JB-V og UM-UC10, og overekspresjon av HSP72 beskyttet UM-UC10 og UM-UC13 celler fra bortezomib-indusert cytotoksisitet. Overall, uavhengig av hvilken isoform genererer HSP72 protein uttrykk, våre data viser at undertrykkelse av HSP72 induksjon øker bortezomib følsomhet, og støtte den videre utviklingen av HSF1 og HSP72 hemmere for å øke bortezomib følsomhet i blærekreft.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
Blære cancercellelinjer ble erholdt fra MD Anderson blærekreft SPORE cellelinje Repository og opprettholdt i MEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Omega Scientific, Tarzana, California). Ektheten av alle cellelinjene ble bekreftet ved innskudd av DNA fingerprinting, og deres identitet ble bekreftet under rutinemessig eksperimentering i MD Anderson Karakterisert cellelinje Kjerne [18]. Cellelinje 253-JB-V, [19] UMUC-10, [20] og UMUC-13 [20] ble isolert fra pasienter med urothelial kreft. SW780 opprinnelig ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) på Biocompare.com. Bortezomib ble kjøpt fra ChemieTek (IN, USA). For
in vitro eksperimenter
, bortezomib ble løst i DMSO ved en lager-konsentrasjon på 10 mM, sterilisert ved filtrering gjennom en 0,22 um sprøytefilter, med alikvoter lagret ved -20 ° C inntil bruk. Før bruk, ble det lager fortynnet i medium til de ønskede konsentrasjoner. For injeksjon av mus, ble bortezomib oppløst i saltvann inneholdende 10 mg /ml mannitol like før behandling.
cellenes levedyktighet Assays
Celler ble utsatt for bortezomib, oppsamlet ved de angitte tidspunkter ved trypsinering, og resuspendert i 500 ul PBS. Femti pl PBS, pH 7,4, inneholdende 100 ug /ml propidiumjodid (PI) ble tilsatt til den resuspenderte celler, og PI opptak (indikativ for celledød) ble analysert umiddelbart ved strømningscytometri (FACS) på en Cytomics FC 500 med CXP Software (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA.
For trypan blå eksklusjon, ble cellene oppsamlet ved trypsinering, farget med 0,4% trypanblått (Invitrogen), og celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer. eksperimentet ble utført i triplikat.
Microarray Analyser
Microarray eksperimenter ble utført som beskrevet tidligere [21] med mindre modifikasjoner. RNA ble isolert fra celler ved anvendelse av TRIzol Reagens (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY ), fulgt av opprydding med RNeasy Mini-sett (Qiagen, Germantown, MD). RNA ble brukt for syntese av biotin-merket Sort, som ble utarbeidet ved hjelp av Illumina RNA forsterkning kit (ambion /Life Technologies), og deretter hybridiserte til Illumina human-HT12 (Illumina, Inc., Hayward, CA) chips. vasket chips ble skannet med BeadStation 500x (Illumina) og signalintensitet kvantifisert med BeadStudio (Illumina). Heatmap ble gjort ved hjelp Cluster 3.0 og Java Utforsker fra Eisen lab (https://www.eisenlab.org/eisen/). Den microarray datasettet kan bli funnet i Gene Expression Omnibus, tiltredelse antall GSE46132.
mRNA Utvinning, Reverse Transcription og kvantitativ real-time PCR
mRNA utvinning og revers transkripsjon ble utført som beskrevet tidligere [22 ]. RNA ble isolert fra celler ved anvendelse av TRIzol Reagens (Invitrogen), og cDNA-syntese ble utført under anvendelse av Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Real-time PCR for HSPA1A, HSPA8, HSPB1, DNAJB1, og glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble utført ved hjelp av en StepOne real-time PCR system (Applied Biosystems /Life Technologies). De TaqMan primersett for HSPA1A (Hs00359163_s1), HSPA1B (Hs00271244_s1), pan-HSPA1A HSPA1B (Hs00271229_s1), HSPA8 (Hs03045200_g1), HSPB1 (Hs03044127_g1), DNAJB1 (Hs00428680_m1), og for GAPDH (4333764F) ble kjøpt fra Applied Biosystems. Den amplifikasjonsprotokoll besto av en syklus ved 50 ° C i 2 minutter, en syklus ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s, og transkripsjonsnivåer ble kvantifisert ved hjelp sammenlignings C
T-metoden. De resulterende data ble analysert med StepOne programvare og uttrykt som gjennomsnittet av forhold (relativ uttrykk til kontroll) ± SE, og GAPDH tjente som indre kontroll lasting.
Behandling av celler med 5-aza-2′- deoksycytidin (5-AzdC)
celler ble sådd ut ved lav tetthet (~ 5 x 10
4 celler /brønn) i 6-brønners plater og tillatt å feste over natten. Cellene ble deretter eksponert for 5 uM 5-AzdC oppløst i 50% eddiksyre i 5 dager. Bortezomib (30 nM) ble deretter tilsatt til passende brønner 6 timer før høsting på dag 5, og cellene ble oppsamlet for RNA-isolering. 5-AzdC ble hentet fra Sigma.
DNA Metylering Analyse
Genomisk DNA ble isolert ved hjelp av en genomisk DNA kit (Qiagen). DNA (1 pg) ble omdannet med natriumbisulfitt ved hjelp av EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Bisulfitt-modifiserte DNA ble så underkastet metylering-spesifikk PCR (MSP). Primere som brukes for MSP ble utformet ved hjelp Methprimer. Primeren satt for konverterte metylert DNA var 5′-TGTTTTTTTTATTCGGATTAGTTAAC-3 «(fremover) og 5′-CCACCTACTCGCTAAAACTACGTA-3» (bakover); Primeren satt for konverterte unmethylated DNA var 5’TTTTTTTTATTTGGATTAGTTAATGT -3 «(fremover) og 5’CCCACCTACTCACTAAAACTACATA -3» (bakover). PCR-protokollen inkluderte en første inkubasjon ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 35 sykluser av 95 ° C i 30 s, 49 ° C i 30 s og 72 ° C i 40 s etterfulgt av en syklus på 72 ° C i 10 min. MSP PCR-produktene ble separert på 2% agarosegeler, og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Fullt metylert kontroll-DNA og unmethylated kontroll-DNA ble anvendt som kontroller.
Immunoblotting
Cellene ble høstet ved trypsinering og lysert i buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na
2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM p-glycerofosfat, 1 mM Na
3VO4, 1 ug /ml leupeptin og 1 mM PMSF. Hel-celle-ekstrakter (20 ug totalt protein) ble underkastet natriumdodecylsulfat-10% polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraner ble undersøkt først med enten et monoklonalt antistoff spesifikt for HSP72 (SPA-810, Stressgen /Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York), HSF1 (SPA-901, Stressgen /Enzo) eller human beta-aktin (Sigma, St. Louis , MO), og deretter med passende pepperrotperoksydase-konjugert andre antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). Immundeteksjon ble utført ved hjelp av ECL (Amersham, Piscataway, NJ) i henhold til produsentens instruksjoner.
Chromatin Immunpresipitasjon
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) ble utført med chip-IT ™ Express Enzymatisk kit, og chip -IT ™ Control Kit (Active Motif) i henhold til produsentens protokoll. Kontroll og bortezomib-behandlede 253JB-V og UM-UC13-celler (1,5 x 10
7 hver) ble løst i 8 minutter ved romtemperatur og skåret ved enzymatisk fordøyelse i 10 minutter. Den skjærpåvirkede kromatin ga båndene mellom 200-1500 bp som synliggjort ved agarosegelelektroforese. DNA bundet til HSF1 ble utfelt med et anti-HSF1 antistoff (Stressgen /Enzo, SPA-901). For å forsterke HSF1-bundet HSPA1A arrangøren ble det utfelte DNA utsatt for real-time PCR bruker TaqMan® Gene Expression Master Mix med Custom TaqMan® genuttrykk Analyse primere (ABI) som tilsvarer HSF1-bindende region av HSPA1A promoter ( -10 til -180) [23], [24]. Real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI StepOne med følgende vilkår: 5 minutter ved 50 ° C; 10 minutter ved 95 ° C; deretter 40 sykluser med 95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C i 60 sekunder. De data som er gitt representerer resultater fra tre separate eksperimenter brikke og ble normalisert til reaksjoner som utføres med 1% av inngangs. End-point PCR reaksjoner ble også utført som beskrevet tidligere [25] for å bekrefte real-time PCR resultater. Normal IgG antistoff ble brukt som kontroll.
Molecular Modulation av HSP72 Expression
Den lentiviral pLKO.1 baserte konstruksjoner TRCN0000008762 og TRCN0000008757 spesifikt rettet mot HSP72 genet ble kjøpt fra Open Biosystems, Inc. den tomme pLKO.1 vektor ble anvendt som en kontroll. Rekombinante virus ble produsert ved kalsiumfosfat-transfeksjon av HEK293T celler ved hjelp av standard protokoller. På dag 2-3 etter-kulturen, ble 253J-BV celler inkubert med shRNAs og polybrene (6 ug /ml) for 16~24 timer, og de transduserte celler ble valgt i 1 ug /ml puromycin. For transient stanse av HSP72 i UM-UC10-celler, ble celler inkubert i 6 eller 24-brønners plater i 72 timer med enten ikke-målsøkende (D-001206-14-20), siHSPA1A (L-005168-00), eller HSPA1B (L-003501-00) siRNA konstruerer fra Dharmacon /Thermo Scientific, Waltham, MA. Lipofectamine RNAiMAX transfectionreagent (Invitrogen) ble brukt for å forbedre siRNA levering i henhold til produsentens instruksjoner. For overekspresjon av HSP72, ble den Precision LentiORF RFP kontroll (OHS5832) og Precision LentiORF individuell klone for HSPA1A (OHS5897-100998480) kjøpt fra Open Biosystems, ble Inc. transduced celler valgt i 5 mikrogram /ml blasticidin og FACS sortering av GFP positive celler .
lysosomale Integrity Analyser
Cells (~1-2 × 10
5) ble belagt i seks-brønns plater og lov til å feste natten. Cellene ble deretter eksponert for bortezomib i 24 timer. Etter medikamentelle behandlinger, 100 nM LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probes /Life Technologies, Grand Island, NY) ble lagt inn i celler i 30 minutter før innhøsting. Cellene ble trypsinert, vasket en gang med PBS og resuspendert i fersk PBS, og fluorescensen ble målt ved anvendelse av en Beckman Coulter FC500 strømningscytometer.
Xenograft-studier
Kvinnelige atymiske nakne mus ble anskaffet fra National Cancer Institute (NCI-Frederick). Musene ble plassert og holdt under spesifikke patogen frie forhold i anlegg som er godkjent av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care og i samsvar med gjeldende regelverk og standarder for United States Department of Agriculture, United States Department of Health and Human Services. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Animal Care og bruk Committee (ACUF Protocol # 11-00-12734). Musene overvåkes daglig, inkludert helger og ferier, med aktiv dødshjelp utført ved hjelp av CO2 i tilfelle noe av det følgende: svulsten er større enn 1,5 cm, 20% vekttap, slapphet, manglende evne til å skaffe mat og /eller vann, anstrengt pust, krum holdning, oppblåst mage tilsvarer en gravid mus eller uføre som følge av tumorvekst.
Nude mus (NIH, 6 ukers alder) ble inokulert subkutant (sc) med 2 × 10
6 253J BV celler transduced med HSPA1A shRNA konstruksjon (253JB-V.KDHsp72) eller en ikke-måls kontroll konstruksjon (253JB-V.NT) (10 mus /gruppe). Når svulster ble følbar (5~7 dager), ble musene randomisert til å kontrollere eller behandlingsgruppene. Musene ble behandlet i.v. (Via halevenen) to ganger i uken med 1 mg /kg bortezomib formuleres i saltvann inneholdende 10 mg /ml mannitol i et volum på 100 pl eller 100 pl saltløsning som inneholdt 10 mg /ml mannitol som en bærerkontroll. Kalibermålinger av de lengste perpendikulære tumor diametere ble utført to ganger i uken etter behandlingsstart, og volumene av tumorene ble beregnet ved anvendelse av formelen: W * W * L /2 (hvor W og L representert tverrgående diameter, og lengste langsgående) . For H . E analyse, svulster ble samlet inn fra mus 24 timer etter den andre medikamentell behandling og deretter festes i oktober og 10% formalin
UCSC Genome Browser
UCSC Genome Browser [26] ble anvendt for å identifisere nærværet av et CpG øy som omgir HSPA1A promoter-regionen, i genomet Browser ble oppslagsverk for databasen [27] DNA-elementer konsortium (ENCODE) som brukes til å identifisere tilstedeværelsen av metylering i andre celletyper. Den UCSC Genome Browser er offentlig tilgjengelig på følgende nettsted. https://genome.ucsc.edu/
statistikker
Statistikk ble generert ved hjelp av Student
t
test funksjoner som er tilgjengelige i GraphPad Prism 5 og Microsoft Excel-programvare. P-verdier for 0,05 ble ansett for å være av betydning
Resultater
Differensial Induksjon av HSPA1A i blærekreft Cells
Vi valgte fire representative humane blærekreft cellelinjer (. 253J BV, SW780, UM-UC10, og UM-UC13) for karakterisering av molekylære biologiske mekanismer som bestemmer cellulære responsen til proteasominhibitor bortezomib. Vi først bekreftet at cellelinjer var heterogen med hensyn til deres sensitiviteter til bortezomib-indusert celledød som bestemt ved anvendelse av propidiumjodidfarging og FACS-analyse (PI-FACS) for å måle tap av plasmamembranintegritet (Fig. 1A). Vi brukte hele genomet mRNA uttrykk profilering (Illumina plattform) for å identifisere genuttrykksmønster forbundet med narkotika følsomhet og /eller motstand. Bortezomib induserte sterk oppregulering av mRNA som koder for hoved induserbare isoform av HSP72 (HSPA1A) i den mest bortezomib-resistent cellelinje (253J B-V), men ikke i den mest medikament-sensitive linje (UM-UC13) (fig. S1). Vi har bekreftet disse resultatene ved hjelp av kvantitativ real-time RT-PCR, som viser at HSPA1A mRNA ble sterkt indusert av bortezomib i 253JB-V og SW780 celler (~25-60 brett over ubehandlede nivåer), mens uttrykk økte bare litt indusert (~2- 4 brett over ubehandlede nivåer) i UM-UC10 og UM-UC13 celler (fig. 1B). Vi har også lagt merke til svært lav basal HSPA1A mRNA uttrykk i UM-UC10 og UM-UC13 celler (~50-250 ganger lavere enn 253JB-V og SW780) og disse forskjellene ble forverret på bortezomib eksponering slik at HSPA1A uttrykk nivåer var ~1000-3000 ganger lavere i UM-UC10 og UM-UC13 celler enn i 253JB-V og SW780 (fig. 1B). Men immunoblotting avslørte sammenlign HSP72 protein nivåer i alle 4 cellelinjer (Fig. 1C).
A. Effekter av bortezomib på celledød. Blærekreft cellelinjer (253JB-V, SW780, UM-UC10, UM-UC13) ble inkubert med eller uten 100nM bortezomib i 24 timer og PI /FACS ble brukt til å kvantifisere celledød. Mean ± SEM, n = 3. B. Effekter av bortezomib på mRNA uttrykk av HSP72 isoform HSPA1A. Celler ble utsatt for 30 nM bortezomib i 6 timer og HSPA1A ble målt med kvantitativ RT-PCR. RQ = relativ mengde (til GAPDH). Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM (N≥3) C. Effekter av bortezomib på HSP72 protein nivåer. Cellene ble inkubert i 16-18 timer med 30 nM for bortezomib (nM), og HSP72-nivåer ble målt i helcellelysater ved immunblotting. Blot er representative for to uavhengige eksperimenter.
HSPA1B isoform Kompenserer for tap av HSPA1A Expression i UM-UC10 og UM-UC13 Cells
HSP72 kodes av to uavhengige genetiske loci (HSPA1A og HSPA1B) som produserer svært homologe protein produkter. Vi kjennetegnes derfor HSPA1B uttrykk i HSPA1A
lave celler. Vi brukte primere som var spesifikke for de to isoformer av HSP72, HSPA1A og HSPA1B, samt en primer som gjenkjennes begge (PAN) isoformer for sammenligning. Våre data viste at HSPA1A
lave celler (UM-UC10, UM-UC13) hadde høyere ekspresjon av HSPA1B isoformen i utgangspunktet enn de HSPA1A-høy-celler (253JB-V, SW780) (Fig. 2A). I tillegg ble HSPA1B uttrykk mer robust indusert etter bortezomib eksponering i HSPA1A
lave cellelinjer som manglet A1A isoformen (Fig. 2B). Viktigere, uttrykk målt ved pan-primer var lik på tvers av alle fire cellelinjer, bekreftende immunoblottingsteknologi data (Fig. 1C). Disse data tyder på at økt HSPA1B uttrykk kompensert for manglende HSPA1A og sto for den HSP72 protein uttrykk i UM-UC10 og UM-UC13 celler.
A. Basal ekspresjon av HSPA1A og HSPA1B isoformer på tvers av de fire cellelinjer. B. bortezomib-indusert uttrykk for HSPA1A og HSPA1B over de fire cellelinjer. Spesifikke primere for hver isoform, samt et pan-primer som gjenkjennes begge isoformer, ble brukt til å måle ekspresjon ved kvantitativ RT-PCR. Verdier representerer gjennomsnitt ± SE (n = 2). RQ = relativ mengde (til GAPDH).
Mangel på HSPA1A induserbarheten i UM-UC10 og UM-UC13 Cells skyldes Arrangøren Metylering
Heat shock factor-1 (HSF1) aktivering styrer den globale varmesjokk respons og stress-indusert oppregulering av HSP72 [28]. For å teste om HSF1 uttrykk ble påvirke forskjeller i HSPA1A uttrykk blant våre cellelinjer, målte vi HSF1 mRNA og proteinnivåer i 253JB-V (HSPA1A
høy) og UM-UC13 (HSPA1A
lav) celler. Vi observerte beskjedne forskjeller i basal og BZ-indusert HSF1 mRNA nivåer mellom 253JB-V og UM-UC13 celler; spesielt, viste 253JB-V en 2-ganger økning i HSF1 nivåer ved legemiddeleksponering, mens UM-UC13 viste bare ~1.3 dobling, men hadde 2 ganger høyere HSF1 mRNA uttrykk ved baseline enn gjorde 253JB-V (fig. 3A, venstre panel). Men protein nivåer dukket hovedsak lik mellom begge celletyper (Fig. 3A, panel høyre). Videre er andre HSF1 målene ble sterkt indusert, inkludert nevnte HSPA1B (fig. 2) og DNAJB1 (Hsp40) (fig. S2) i de UM-UC10 og UM-UC13-celler som tyder på at det ikke var noen generaliserte feil i endogen HSF1 aktivering i disse cellene. Vi har derfor begrunnet at UM-UC10 og UM-UC13 celler kan ha spesifikke defekt (e) i HSF1-mediert aktivering av HSPA1A promoter. I samsvar med denne ideen, kromatin immunoutfelling (chip) avslørte at 253J BV celler besatt høyere nivåer av HSF1 bindende til HSPA1A arrangøren ved baseline og etter bortezomib eksponering enn gjorde UM-UC13 (~ 2 ganger og ~ 5 ganger høyere, henholdsvis) (fig. 3B). Fold-induksjon av HSF1 binding av bortezomib var ~9 ganger vs. ~4 ganger i 253JB-V og UM-UC13, henholdsvis. Analyse av HSPA1A arrangøren bruker UCSC Genome Browser avslørt at det ligger innenfor et CpG øy som er metylert i andre kreftcellelinjer (Fig. S3). Ved hjelp av metylering-spesifikke PCR, bekreftet vi at HSPA1A arrangøren var sterkt metylert i UM-UC10 og UM-UC13 men ikke i 253J B-V eller SW780 celler (fig. 3C), som muligens sto for defekte bortezomib-indusert HSPA1A induksjon. For direkte å teste denne muligheten, undersøkte vi effekten av histon-metyltransferase-inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin på basal og bortezomib-indusert HSPA1A mRNA-nivåer i UM-UC10 og UM-UC13-celler. Den hemmer indusert store økninger i både basal og proteasominhibitor-indusert HSPA1A nivåer i både bortezomib-sensitive cellelinjer (Fig. 3D). Sammen utgjør disse resultatene viser at kromatin metylering er ansvarlig for den defekte HSPA1A induksjon observert i UM-UC10 og UM-UC13 celler.
A. Uttrykk for HSF1. 253J B-V og UM-UC13 blærekreftcellelinjer ble utsatt for bortezomib for 12 timer og HSF1 mRNA (venstre panel) og proteinnivåer (panel høyre) ble målt ved kvantitativ RT-PCR og immunoblotting, henholdsvis. Verdier representerer gjennomsnitt ± SE (n = 2); blot er representative for minst to uavhengige eksperimenter. B. Chromatin immunoprecipitation (chip) analyse av HSF1 binding til HSPA1A arrangøren. Vær oppmerksom på at basal og bortezomib-indusert HSF1 bindende ble sterkt redusert i bortezomib-sensitive UM-UC13 celler. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3. * P 0,05 C. Selektiv metylering av HSPA1A promoter i bortezomib følsomme menneskelige blære kreftceller. Metylering spesifikke PCR ble brukt til å vurdere kromatin metylering i narkotika-sensitive (UM-UC10, UM-UC13) og multiresistent (253J B-V, SW780) cellelinjer som beskrevet i materialer og metoder. m, metylert; u, unmethylated. m /u forhold ble beregnet ved hjelp densitometry. Dataene er representative for minst to uavhengige eksperimenter. D. DNA metyltransferase hemmer 5-aza-2′-deoxycytidine gjenoppretter HSPA1A uttrykk i bortezomib-sensitive celler. Celler ble inkubert med 5 uM 5-AzdC i 5 dager og deretter inkubert med eller uten 30nm bortezomib i 6 timer, og HSPA1A ekspresjon ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM, n = 3. RQ = relativ mengde (til GAPDH).
Modulation av HSPA1A og HSPA1B Expression i HSPA1A
lave Cells
Siden UM -UC10 og UM-UC13 manglet HSPA1A uttrykk, vi undersøkt om å erstatte HSPA1A isoform ville fremme bortezomib motstand. For å løse dette, vi stabilt overexpressed HSPA1A i både UM-UC10 og -UC13 celler ved hjelp av en lentiviral vektor. HSPA1A mRNA uttrykk ble bekreftet ved hjelp QRT-PCR og HSP72 totale protein øker med immunoblotting (fig. 4A). HSPA1A overekspresjon celler og tom vektor-transduserte celler ble deretter eksponert for bortezomib, og vi oppdaget at overekspresjon betydelig redusert bortezomib-indusert celledød (Fig. 4B). Omvendt, fordi UM-UC10 og -UC13 celler syntes å være å stole utelukkende på HSPA1B mRNA for HSP72 protein uttrykk, hypotese vi at disse cellene kan være spesielt utsatt for målretting av HSPA1B. For å teste dette, brukte vi siRNA til forbigående taushet HSPA1B i UM-UC10 celler. Analyse av knockdown effektivitet viste at det kommersielt tilgjengelige sirnas ikke kan spesifikt rettet mot individuelle isoformer (dvs. siHSPA1A stilnet HSPA1B) (fig. 4C). Likevel, en kombinasjon av siHSPA1A og siHSPA1B sekvenser ga den beste (men ikke fullstendig) samlet knockdown av A1B isoformen i både RNA og proteinnivå (fig. 4C). Ved hjelp av denne strategien, fikk vi bekreftet at blokaden av HSPA1B induksjon sensibilisert UM-UC10 celler til bortezomib (fig. 4D).
A. Effekter av tvangs HSPA1A overekspresjon på HSPA1A mRNA og HSP72 totale proteinnivået i UM-UC10 og UM-UC13 celler. Celler ble stabilt transdusert med en lentiviral HSPA1A ekspresjonskonstruksjon, og HSPA1A nivåene ble målt ved kvantitativ RT-PCR. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3. RQ = relativ mengde (til GAPDH). Protein ble målt via immunoblotting. Blot er representative for to uavhengige eksperimenter. B. Effekter av HSPA1A overekspresjon på bortezomib-indusert celledød. Celler transdusert med tom vektor (NT) eller med den HSPA1A ekspresjonskonstruksjon ble utsatt for 30 nM bortezomib i 24 timer, og plasmamembranintegritet ble målt ved trypan blå opptaket. (Tilstedeværelsen av RFP i ekspresjonskonstruksjonen hindret vår bruk av PI /FACS-celledød-analysen.) Gjennomsnitt ± SEM, n = 3. *, P 0,02. C. knockdown av HSPA1B i UM-UC10 celler. Venstre panel, knockdown effektivitet på siRNA mot HSPA1A, HSPA1B, eller begge isoformer som målt ved kvantitativ RT-PCR etter eksponering overfor 30 nM bortezomib i 6 timer. RQ = relativ mengde (til GAPDH). Høyre panel, tilsvarende knockdown av HSP72 proteinnivåer ved forskjellen siRNA-sekvensene etter eksponering for 30 nM BZ i 14 timer. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. D. Effekt av HSPA1B knockdown på bortezomib-indusert celledød i UM-UC10 celler. Etter 72 t knockdown, ble cellene eksponert for 30 nM bortezomib i 24 timer og celledød målt ved PI /FACS-analyse. Verdier representerer gjennomsnitt ± SE (n = 3). * P. 0,01
HSP72 Induksjon hemmer bortezomib celledød
For mer direkte avgjøre om bortezomib-indusert HSP72 oppregulering fremmet motstand, vi stabilt slått ned HSP72 i 253JB-V bortezomib-resistente celler ved hjelp av en lentiviral shRNA vektor (fig. 5A). Baseline HSPA1A mRNA-nivåene ble redusert med mer enn 75% i cellene, men shRNA-mediert undertrykkelse av HSPA1A mRNA (fig. 5A. Øvre panel) og HSP72-proteinet (fig. 5A, nedre panel) var mindre imponerende etter eksponering for bortezomib, antagelig fordi proteasominhibitor produsert en så sterk oppregulering av HSP72. Likevel, stabil HSP72 knockdown betydelig forbedret bortezomib-indusert tap av plasmamembranen integritet målt ved propidiumjodid opptak (fig. 5B). Tidligere studier konkluderte med at HSP72 induksjon serverer en cytoprotective funksjon i den integrerte stressrespons (ISR) av stabiliserende lysosomer [29]. Som sådan, sammenlignet vi effektene av bortezomib på lysosomale integritet i 253JB-V-celler transdusert med kontroll-vektor (253JB-V NT) eller KD9 HSPA1A spesifikke shRNA-konstruksjonen. Bortezomib hadde liten eller ingen effekt på lysosomale integritet i 253JB-V NT celler, men indusert sterk, konsentrasjonsavhengig tap av lysosomal integritet i 253JB-V-KD9 celler (figur 5C).
