Abstract
deregulert aktiviteten til transkripsjonsfaktorer (TFS) av Sp /KLF familie, som SP1, SP3 og SP4 og påfølgende over-uttrykk for Sp-regulerte gener oppstår ofte i kreft hos mennesker. Dette gir begrunnelsen for utvikling av inhibitorer av Sp TFS som kreftbehandling. Mitramycin A (MTM-A) er en naturlig polyketide som binder GC-rik DNA-sekvenser, inhiberer aktiviteten av Sp TFS og utviser potent antitumoraktivitet i eksperimentelle systemer. Imidlertid er klinisk bruk av MTM-A begrenses av alvorlig toksisitet av forbindelsen. Her studerte vi to MTM-A-analoger, som hadde blitt generert ved genetisk engineering av MTM-A-biosyntese-veien og undersøkt deres aktivitet i humane prostatacancer i cellekulturer og musemodeller. Forbindelsene, kalt MTM-SDK og MTM-SK, var svært effektive
in vitro
hemme spredning av prostatakreftceller og transkripsjon av Sp-regulerte gener ved å blokkere binding av Sp proteiner til genet arrangører Når administrert til mus begge forbindelser ble godt tolerert med maksimal tolererte doser av MTM-SDK og henholdsvis MTM-SK, 4- og 32-ganger høyere enn MTM-A. Etter systemisk administrering, ble begge forbindelser elimineres raskt fra blodet, men opprettholdt plasmanivåer godt over aktive konsentrasjoner som kreves
in vitro
for hemming av Sp TF aktivitet og celledeling. Konsekvent, MTM-SDK og MTM-SK hemmet transkripsjon av Sp-regulerte gener i prostata tumorxenotransplantater og utstilt potent antitumor aktivitet i subkutane og metastatisk tumor xenograft modeller med ingen eller minimal toksisitet. Samlet utgjør disse dataene indikerer at MTM-SDK og MTM-SK besitter betydelig forbedrede farmakologiske og toksikologiske egenskaper sammenlignet med MTM-A og representerer lovende medikamenter for behandling av avansert prostatakreft
Citation. Malek A, Núñez LE , Magi M, Brambilla L, Jovic S, Carbone GM, et al. (2012) Modulation av aktiviteten til Sp transkripsjonsfaktorer ved mitramycin analoger som en ny strategi for behandling av metastatisk prostatakreft. PLoS ONE 7 (4): e35130. doi: 10,1371 /journal.pone.0035130
Redaktør: Leo T.O. Lee, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 07.10.2011; Godkjent: 13 mars 2012; Publisert: 19 april 2012
Copyright: © 2012 Malek et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro, Swiss National Science Foundation og sveitsiske Cancer League til CVC og GMC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Medforfattere FM og LEN er ansatte og FM er en aksjonær i EntreChem SL, rettighetshaver selskap av forbindelsene beskrevet i manuskriptet. Alle andre forfattere har til å erklære at ingen konkurrerende interesser exist.This ikke endrer forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tumor initiering og progresjon er mediert av flere signalveier og de terapeutiske fordelene oppnåelig ved å målrette enkelte veier kan være begrenset [1]. Målrette nettstedene til konvergens av ulike regulatoriske kaskader kan representere en mer lovende strategi for kreftbehandling. Transkripsjonsfaktorer (TFS) er spesielt attraktive i denne henseende da de er knutepunkter i signalveier og er ofte deregulert i humane cancere [1], [2]. Avvikende ekspresjon eller aktivitet av medlemmene av Sp /KLF familie av TFS, som Sp1, SP3 og SP4 forekommer i mange humane cancere [3] Sp TF’er binder til GC-rik DNA-elementer (GC-boks) i gen-promotorer, samhandle med komponenter av basal transkripsjonen maskiner, samarbeide med andre TFS og er nedstrøms effektorer av flere signalveier [3]. Flere studier har vist at Sp TF’er ha en viktig rolle i patogenesen av kreft hos mennesker og er lovende terapeutiske mål [3], [4], [5],.
mitramycin A (MTM-A) er en naturlig aromatiske polyketide produsert av ulike
Streptomyces
arter [14]. MTM-A bindes fortrinnsvis til GC-rike sekvenser i DNA, blokker kompetitivt bindingen av Sp TFS og andre GC-bindende proteiner til GC-rike elementer i genet arrangører og hemmer transkripsjon av Sp regulert gener [15], [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. Inhibering av Sp regulerte gener som er avgjørende for den biologiske aktivitet av MTM-A i eksperimentelle systemer [20], [21]. Klinisk bruk av MTM-A imidlertid er begrenset på grunn av toksisiteten av forbindelsen [22]. Genetisk prosjektering av MTM-A biosyntesen har gitt mulighet til å generere nye analoger av MTM-A som kan besitter forbedrede farmakologiske og toksikologiske egenskaper [23], [24], [25], [26]. Nylig, to forbindelser, kalt MTM-SDK og MTM-SK, ble oppnådd ved bruk av metabolsk ingeniør tilnærming [27], [28]. MTM-SDK og MTM-SK viste større evne til å blokkere SP1 binding til DNA og cellulært opptak i forhold til MTM-A. Dette førte til økt biologisk aktivitet som inhibitorer av Sp regulert gentranskripsjon og proliferasjon av cancerceller både in vitro og in vivo [27], [29]. Dermed kan disse nye MTM-A analoger være nyttig for behandling av kreft med unormal aktivitet av Sp TFS.
I denne studien har vi evaluert aktiviteten av MTM-A-analoger MTM-SDK og MTM-SK i eksperimentelle modeller for menneskelig prostatakreft. Prostatakreft er den vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftdød i menn i vestlige land [30]. Konvensjonell behandling av prostatakreft omfatter kirurgi, strålebehandling og androgen deprivasjon [31]. Til tross for den gradvise økningen i sykdomsfri overlevelse og livskvalitet, er metastatisk spredning fortsatt den viktigste dødsårsaken for prostatakreftpasienter [31]. Avansert prostatakreft er ofte resistente mot hormonbehandling og systemisk kjemoterapi har begrenset effekt [31], [32]. Palliativ behandling er fortsatt det viktigste alternativet for mange av disse pasientene. Derfor nye terapeutiske tilnærminger må iverksettes for å håndtere metastatisk prostatakreft. Delstaten Sp TFS i prostatakreft har vært dårlig undersøkt hittil. Men vi fant bevis som støtter en rolle for deregulert aktivitet Sp TFS i initiering og progresjon av prostatakreft. Mange gener rapportert å være involvert i prostata tumorigenesis er regulert av Sp faktorer (se Metoder S1, Tabell S1, S2 og referanser deri). Forbindelser som forstyrrer Sp TFS ved forskjellige mekanismer har relevant aktivitet i forskjellige kreftformer, inkludert prostata cancer [7], [8], [9], [10], [11], [33], [34], [35] , [36], [37], [38]. Disse hensynene, sammen med bioinformatikk analyser av publiserte genuttrykk datasett, ledet oss til hypoteser om at Sp TFS kan være relevante mål i prostatakreft, og at de nye MTM-A analoger med forbedrede farmakologiske egenskapene kan være nyttig for behandling av denne sykdommen.
Materialer og metoder
Komponenter og cellelinjer
Menneske prostatakreft PC3, DU145, ble 22Rv1 og LNCaP celler opprettholdt i RPMI 1640 [39]. Normale humane fibroblaster ble opprettholdt i DMEM [27]. MTM-A, ble MTM-SK (EC-7072) og MTM-SDK (EC-7073) fremstilt som tidligere beskrevet [27]. Stamløsninger av forbindelsene (10 mM) ble fremstilt i steril saltoppløsning eller DMSO og fortynnes i steril saltløsning umiddelbart før anvendelse [29]. For genekspresjon og kromatin immunpresipitering (chip) celler ble behandlet med 100 nM av MTM-SDK og MTM-SK eller kjøretøy i 24 timer.
RNA og protein analyse
Total RNA fra dyrkede celler og tumorvev ble isolert og revers transkribert som beskrevet [27], [29]. Kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) ble utført ved hjelp av ABI PRISM 7000HT Sequence Detection System og SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems) som beskrevet [29]. PCR-primere er vist i Tabell S3.
GAPDH Hotell og
B2M
ble brukt som intern kontroll. Ekspresjonsplasmider data ble uttrykt som en prosentandel av kontroll genekspresjon som beskrevet [29]. Sluttpunkt RT-PCR ble utført som beskrevet tidligere ved hjelp av Superscript One-Step RT-PCR-systemet (Invitrogen) og genspesifikke primere [27]. Cellelysater ble fremstilt fra kontroll- og medikamentbehandlede celler og proteiner separert på SDS-polyakrylamidgeler. Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere [27], [40].
Chromatin immunoutfelling (chip)
Celler ble samlet opp, kryssbundet med formaldehyd og behandlet etter en modifisert EZ-Chip settprotokollen (Upstate Biotechnology) som beskrevet [41]. Kromatin ble immunoutfelt med et antistoff for Sp1 og normal muse-IgG som negativ kontroll. DNA-proteinkryssbindinger ble reversert og DNA ble renset fra totale cellelysater (input) og immunopresipitert fraksjoner. qPCR ble utført som angitt ovenfor. Primere for chip analyse av C-MYC og VEGF-promoteren er vist i Tabell S3. Mengden av bundet DNA ble beregnet med referanse til en standard kurve og uttrykt som prosent av tilført DNA [41].
In vitro
cellevekstinhibering
Cellenes levedyktighet var bestemt ved anvendelse av MTT kolorimetrisk analyse som beskrevet [27]. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater og inkubert med bærer eller forbindelser som i 24 og 72 timer. Hver behandling ble utført i triplikat og Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Dyr og xenograft-modeller
atymiske hann nakne mus (Balb C nu /nu, 6-8 uker gamle) ble kjøpt fra Harlan Laboratories. Musene ble opprettholdt under patogenfrie forhold med mat og vann følger med
ad libitum Hotell og deres generelle helsetilstand ble overvåket daglig. Alle protokoller som involverer forsøksdyr ble utført i samsvar med institusjonens retningslinjer og i samsvar med nasjonale og internasjonale lover og retningslinjer. Eksperimentelle prosedyrer og studieprotokoller er gjennomgått og godkjent av den sveitsiske Cantonal Veterinær Authority (Godkjenning nr. 05/2011). Å etablere subkutane tumorxenotransplantater, PC3 celler (2 × 10
6 celler) ble inokulert i flanken av mus. For metastatisk xenograft modell, PC3 celler (0,6 × 10
6) ble injisert to ganger i halevenen med en 24-timers intervall mellom injeksjonene.
Toxicity
Sunn CD-en mus gitt av Universitetet i Oviedo Animal Facility ble behandlet med enkle eller gjentatte IV injeksjoner av MTM-SK, MTM-SDK og MTM-A. Hver gruppe besto av 4 mus. For gjentatte doser, ble medikamenter administrert av IV injeksjoner hver to eller tre dager for totalt 10 injeksjoner. Kroppsvekt, dødsfall, endringer i atferd, motilitet, spise og drikkevaner, og andre tegn på lokal eller systemisk toksisitet ble registrert daglig.
Farmakokinetiske
Sunn CD-1 mus ble injisert IV med MTM-SK (18 mg /kg) og MTM-SDK (2 mg /kg). Blod ble samlet inn på fem tidspunkter mellom 5 og 120 min. På hvert tidspunkt 3 mus per gruppe ble analysert. Plasmaprøver ble fortynnet med 4 volumdeler acetonitril, virvles og sentrifugert for å fjerne eventuelle uoppløselige bunnfall. Supernatanten ble deretter anvendt for å måle MTM-SDK og MTM-SK ved LC-MS. Plasmanivåene ble evaluert etter intraperitoneal (IP) og IV injeksjon av MTM-SK (18 mg /kg) også ved HPLC-UV.
genekspresjonsanalyser i tumorxenotransplantater
For å evaluere effekten på transkripsjon i tumorvev, ble mus med subkutane tumorer behandlet med MTM-SDK (1,2 mg /kg) og MTM-SK (8 mg /kg) eller saltoppløsning ved IV-injeksjon. Dyrene ble avlivet etter 1, 3 og 7 dager fra injeksjonen. Svulster ble umiddelbart samlet og hurtigfrosset for RNA isolering. QRT-PCR ble utført som beskrevet ovenfor. På hvert tidspunkt 4-mus ble analysert i hver forsøksgruppe og QRT-PCR utført i triplikat for hver prøve.
antitumoraktivitet
Mus som bærer subkutane tumorer ble behandlet med forbindelser eller kjøretøy. Hver forsøksgruppe bestod av 10 mus. Legemidler ble utarbeidet i steril saltoppløsning og gis av IP-injeksjoner hver 3. dag. Kontrollmus mottok IP-injeksjon av steril saltoppløsning. Tumorstørrelse ble målt med en skyvelære to ganger i uken. Data representerer gjennomsnitt ± SD av 10 mus per gruppe.
Antimetastatic aktivitet
For å evaluere forbindelser evne til å blokkere metastatisk tumorvekst, mus fikk nålevenen injeksjoner av kreftceller til å etablere lungemetastaser. Deretter mus ble behandlet med MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) eller sterilt saltvann gitt av IP-injeksjoner hver 3. dag fra og to uker etter haleveneinjeksjon av tumorceller. To grupper av ubehandlet mus (
n = 3 pr gruppe
) ble avlivet etter 1 og 2 uker etter injeksjonen for å bekrefte implantering og vekst av metastatiske celler. Kontroll og legemiddelbehandlede mus (
n = 3 per gruppe
) ble deretter avlivet etter 1 og 2 uker etter begynnelsen av behandlingen. Lunge vev ble samlet for qPCR analyse og histologisk undersøkelse etter H E farging. Lungemetastaser ble kvantifisert ved anvendelse av en tidligere beskrevet qPCR basert metode [42]. Genomisk DNA ble ekstrahert fra frosne lungevev ble amplifisert med primersett for unik, konservert og art-spesifikke regioner av det humane genom og mus. PCR ble utført ved anvendelse av SYBRGreen qPCR Master Mix [42]. Prosentandelen av humane celler i lungevevet ble bestemt i triplikat sammenkoblet reaksjoner for hvert dyr ved hjelp av standardkurve av blandede human /mus prøver som beskrevet [42]. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 mus pr eksperimentelt punkt.
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. IC50 ble beregnet ved hjelp av Sigmaplot. Forskjeller mellom forsøksgruppene ble analysert for statistisk signifikans ved hjelp av uparet tosidige t-test med GraphPad Prism 4.0 Software. P values≤0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
MTM-SDK og MTM-SK hemme uttrykket av Sp regulerte gener i prostatakreftceller
Analyse av aktuell litteratur viste at mange gener over-uttrykt i grunnskolen og metastatisk prostatakreft er regulert av Sp TFS og er potensielle mål av MTM-A-analoger (se Metoder S1, Tabell S1, S2 og referanser deri). Bruk av bioinformatikk tilnærminger til offentlig tilgjengelige genuttrykk datasett vi funnet at gener med spådd bindingssteder for Sp TFS i deres arrangører ofte ble deregulert i prostatakreft både tidlig og avanserte stadier av sykdommen, til tross for mangel på konkrete bevis om over-uttrykk for Sp TFS i disse svulstene (fig. S1). Videre fant vi at mange gener ned-regulert av MTM-SDK i en eggstokkreft cellelinje og mulige mål for Sp TFS var overrepresentert blant gener oppregulert i grunnskolen og metastatisk prostatakreft (Fig. S1). Derfor vurderte vi effekten av de nye MTM-A-analoger på transkripsjon av Sp-regulerte gener i prostatakreftceller. Vi valgte gener som er kjent å være over-uttrykt i prostata tumorer og er involvert i forskjellige aspekter av prostatatumordannelse som celleproliferasjon, apoptose og angiogenese (tabell S1). Prostatakreft PC3 celler ble behandlet med 100 nM av MTM-SDK, MTM-SK eller kjøretøy i 24 timer og effekter på genuttrykk ble vurdert ved QRT-PCR. Denne dose ble valgt på grunnlag av vårt tidligere arbeid i eggstokkreft celler [27]. Videre har vi bekreftet at 24 timers behandling ved doser ≤ 100 nM var minimal cytotoksisk (≤30% reduksjon i celle levedyktighet, Fig. S2). Under disse forholdene, behandling med MTM-SDK redusert mRNA nivå av
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
,
CCDN1
,
CCNE1
,
XIAP
,
MCL1 Hotell og
BIRC5
av ≥75% (fig. 1a). Som tidligere vist i eggstokkreft celler [27], MTM-SK var litt mindre effektiv enn MTM-SDK. Nivået på
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC Hotell og
CCDN
en mRNA ble redusert i MTM-SK behandlede celler med 50-75% sammenlignet med kontrollceller, mens
XIAP
,
CCNE1
,
MCL1 Hotell og
BIRC5
var minimal eller ikke påvirket.
PC3-celler ble behandlet med 100 nM av MTM-SDK, MTM-SK eller bærer (DMSO) i 24 timer. A) Gene ekspresjon ble målt ved QRT-PCR. Data ble normalisert til
B2M
RNA nivå og er presentert som prosentandel av uttrykket i forhold til kjøretøy-behandlede celler (kontroll). Data representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. B) Binding av SP1 til arrangører av
C-MYC Hotell og
VEGF
i kontroll og legemiddelbehandlede celler ble bestemt av Chip hjelp av en anti-SP1 spesifikt antistoff. DNA i inn- og immunopresipitert fraksjoner ble kvantifisert ved qPCR med primere som omkranser hele Sp-bindingssetet i genet arrangører. Data (gjennomsnitt ± SD) fra 3 uavhengige forsøk er uttrykt som prosent av tilført DNA i immunoprecipated fraksjoner. *, P 0,01; **, P 0,001. C) Nivå av Sp1, sp3 og Sp4 mRNA ble bestemt ved RT-PCR i PC3-celler inkubert med 100 nM av MTM-SDK, MTM-SK eller bærer for 24 og 48 timer. GAPDH ble anvendt som kontroll. D) Protein nivået av SP1, c-myc, XIAP, og cyclin D1 ble bestemt ved immuno i PC3 celler inkubert med 100 nM av MTM-SDK, MTM-SK eller kjøretøy for 24 og 48 timer.
MTM-A og dets analoger binde seg til GC-rik DNA elementer og hindre binding av GC-bindende proteiner som de Sp TFS til genet arrangører. For å avgjøre om virkningene på transkripsjon skyldtes hemming av Sp bindende, vi målte binding av SP1 til
C-MYC Hotell og
VEGFA
promoter i kontroll og narkotika behandlede celler av kromatin immunpresipitering . MTM-SDK og MTM-SK betydelig redusert binding av SP1 til
C-MYC Hotell og
VEGFA
promoter (Fig. 1B). MTM-SDK var mer effektiv enn MTM-SK, i samråd med genuttrykk data. Som Sp proteiner kan kontrollere sin egen transkripsjon [3], evaluert vi om MTM-SDK og MTM-SK påvirket deres uttrykk. Sp1, sp3 og Sp4 er uttrykt i PC3-celler og behandling med MTM-A-analoger redusert mRNA-nivået av Sp1, Sp4 og til en lavere grad SP3 (Fig. 1C). Igjen, MTM-SDK var mer effektiv MTM-SK. Protein nivåer av SP1 og Sp mål, som c-myc, ble også redusert ved behandling med MTM-SDK- og MTM-SK i samråd med mRNA data (Fig. 1 D).
MTM-SDK og MTM- SK hemme spredning av prostata kreft celler
Hemming av Sp TFS har vist seg å påvirke spredning og overlevelse av kreftceller. Vi undersøkte antiproliferative effekter av MTM-SDK og MTM-SK i et panel av prostatakreftcellelinjer som representerer androgen-avhengige (AD) og androgen-uavhengig (AI) prostatakreft. LNCaP-celler er androgenreseptoren (AR) positiv og er avhengig av AR signalering. 22Rv1 er AR positiv, men AI. PC3 og DU145 er AR negative og AI. Vekst av alle cellelinjene som ble testet, uavhengig av deres AR tilstand, ble sterkt hemmet av begge forbindelser, med MTM-SDK å være mer effektive enn MTM-SK (fig. 2). IC
50 verdier er rapportert i figur 2. Videre vekst av prostata kreft celler ble hemmet av ≥50% ved ≤100 nM av både narkotika. Spesielt, stoffet ikke hadde noen virkning på disse dosene på normale humane fibroblaster (fig. 2). Livskraftig av normale fibroblaster ble påvirket noe bare ved høyere doser (~20-30% hemming ved 500 nm). Denne forskjellen i følsomhet mellom normale celler og kreftceller var i tråd med våre tidligere data som viser at normale fibroblaster var mer motstandsdyktig enn eggstokkreft celler til induksjon av apoptose når de utsettes for MTM-SDK [27].
Prostatakreft -celler (DU145, 22Rv1, PC3 og LNCaP) og primære kulturer av normale humane fibroblaster (NHF) ble inkubert med forbindelser i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved kolorimetrisk MTT-analysen. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver av 3 uavhengige eksperimenter. IC
50 for hver celletype er rapportert i det nederste panelet.
Giftig for MTM-SDK og MTM-SK
Systemisk toksisitet er en stor begrensning til klinisk bruk av MTM-A. Derfor vurderte vi de doser som MTM-SDK og MTM-SK kunne være trygt administrert til mus på både akutt og kronisk administrering. Den maksimale tolererte dose (MTD) av MTM-SDK og MTM-SK etter en enkelt intravenøs injeksjon var 4 mg /kg og 32 mg /kg, henholdsvis (tabell 1). MTD av MTM-SK for gjentatt behandling var 8 og 18 mg /kg ved hjelp av q2d × 10 og Q3D × 10 tidsplan, henholdsvis. MTD av MTM-SDK var 1,2 mg /kg og 1,8 mg /kg, henholdsvis, når det gis med q2d × 10 og Q3D × 10 timeplan. Vi testet for sammenligning MTM-A og fant at MTDs var 1 mg /kg og 0,5 mg /kg for enkel og gjentatt (q2d × 10) administrasjon, henholdsvis. Ytterligere doseøkning av både MTM-SK enn MTM-SDK og gjentatt behandling resulterte i progressivt tap av kroppsvekt og andre tegn på alvorlig kronisk toksisitet, inkludert redusert mobilitet, konjunktivitt og perifer neuropati. Som konklusjon, kan bemerkelsesverdig høyere doser av MTM-SK enn MTM-SDK forhold til MTM-A gis trygt både som enkel og gjentatt injeksjoner til mus uten tegn på toksisitet.
farmakokinetikk MTM-SDK og MTM-SK
blod nivåer av MTM-SK og MTM-SDK ble målt etter enkelt IV injeksjoner i en dose på 18 og 2 mg /kg (fig. 3). Begge forbindelser ble fjernet raskt fra blodet med liknende samlede kinetikk. Etter 5 min plasmanivåene var ca 20 og 0,7 mikrometer for henholdsvis MTM-SK og MTM-SDK,. Etter 1 time nivåene av MTM-SK og MTM-SDK var omtrent 1 og 0,1 mM, respektivt. Således plasmanivåer av begge forbindelser var lik eller bedre enn konsentrasjonen som er nødvendig
in vitro
for hemming av cellevekst og undertrykkelse av Sp1 avhengig transkripsjon. Deretter sammenlignet vi farmakokinetikken for MTM-SK etter enkelt IV og IP-injeksjoner. Ved siden av den første topp sett med IV-injeksjon, kinetikken etter IV og IP-administrering var ganske like, nå sammenlignbare legemiddelnivåer i plasma i løpet av 15-30 min og opprettholde tilsvarende nivåer i løpet av den 2-timers periode av analysen (fig. S3 ).
Mus (n = 3 /gruppe) mottatt en eneste IV injeksjon av MTM-SK (A) eller MTM-SDK (B) og plasmanivået ble bestemt ved LC-MS. Doser på MTM-SK og MTM-SDK var 18 mg /kg og 2 mg /kg, henholdsvis.
MTM-SDK og MTM-SK hemme genuttrykk i menneskelige prostata tumorxenotransplantater
for å fastslå om MTM-A analoger var i stand til å forstyrre aktiviteten til Sp TFS in vivo ved systemisk administrasjon, mus med PC3 tumorxenotransplantater ble behandlet med en enkelt intravenøs injeksjon av MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM -SK (8 mg /kg) eller saltoppløsning. Svulster ble skåret ut ved 1, 3 og 7 dager etter injeksjonen, og RNA-nivåer av utvalgte Sp-regulerte gener ble målt ved QRT-PCR. Uttrykk for
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
,
CCDN1
,
CCNE1
,
XIAP
,
MCL1 Hotell og
BIRC5
ble betydelig redusert med både MTM-SDK og MTM-SK på 24 timer (Fig. 4). Imidlertid var det en forskjell mellom de to forbindelsene i kinetikken ved utvinning fra transkripsjonen inhibering. Effekten av MTM-SDK varte lenger. De fleste genene ble likevel undertrykt med 30 til 50% etter 3 dager. Selv etter 7 dager
VEGFA
,
C-SRC Hotell og
XIAP
var fortsatt betydelig nedregulert. Effekten av MTM-SK ble reversert mer hurtig med de fleste genene vende tilbake til kontrollnivåer i løpet av 3 eller 7 dager. Således begge medikamenter var effektive i å redusere transkripsjonen av Sp-regulerte gener når de gis systemisk til mus, noe som bekrefter akkumulering av aktive legemiddelkonsentrasjoner i tumorvevet. Videre er effekten av MTM-SDK var mer uttalt og vedvarende i forhold til MTM-SK, i samsvar med
in vitro
data om Sp1-binding og genekspresjon.
Mus (n = 4 /gruppe ) med subkutane tumorer ble behandlet med en enkelt intravenøs injeksjon av MTM-SDK, MTM-SK eller steril saltoppløsning. Doser på MTM-SK og MTM-SDK var 8 mg /kg og 1,2 mg /kg, henholdsvis. Svulster ble høstet 1, 3 og 7 dager etter sprøyte. Genekspresjon ble bestemt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD av transkriptet nivå normalisert til B2M RNA og er presentert som prosent av ekspresjon sammenlignet med kontroll mus som mottok steril saltvannsløsning. *, P 0,01; **, P . 0.001
MTM-SDK og MTM-SK hemme veksten av prostata tumorxenotransplantater
Den anti-tumor aktivitet av MTM-SDK og MTM-SK ble undersøkt ved hjelp av subkutane tumorxenotransplantater av PC3 prostata kreft celler. PC3 celler er AI, svært tumorigent og metastatisk. Således er disse celler representerer en god modell av avansert kastrering-motstandsdyktig prostatakreft. Mus med PC3 tumorxenotransplantater mottatt MTM-SDK (0,6, 1,2 og 1,8 mg /kg, Q3D × 10) og MTM-SK (4, 8 og 12 mg /kg,) hver 3 dager ved IP-injeksjoner. IP-administrasjonen ble valgt fordi det er ofte brukt i lengre behandlinger med kreft forbindelser. Videre injeksjoner IV og IP var nesten tilsvarende i form av plasmanivåer og farmakokinetikk. Doser og doseringsplan ble også basert på de farmakodynamiske og MTD data som er beskrevet ovenfor. Behandlingen ble avsluttet når mus i kontrollgruppene måtte ofres på grunn av for stor tumorbyrde. Medikamentbehandlede mus ble fulgt i en uke etter avsluttet behandling. Behandling med MTM-SDK og MTM-SK redusert tumorvekst (Fig. 5A-B). Forskjellen mellom behandlede og ubehandlede mus var svært statistisk signifikant ved alle doser som ble testet. Etter behandlingen ble avbrutt, veksten av subkutane tumorer langsomt gjenopptatt med en litt raskere kinetikk i tilfelle av lavere doser av MTM-SK. Dette er i samsvar med farmakodynamiske data, noe som indikerer en raskere utvinning av genekspresjon etter MTM-SK behandling. Interessant er imidlertid minimal tumorveksten ble observert i mus behandlet med den høyeste dosen av MTM-SK. Behandling med MTM-SDK og MTM-SK resulterte i lite tap av kroppsvekt, noe som ble korrelert med et dosenivå men ikke statistisk signifikant (fig. 5C-D). Ingen tegn til akutt giftighet eller lokal irritasjon på injeksjonsstedet ble observert under behandling. To mus behandlet med den høyeste dosen av MTM-SDK (1,8 mg /kg) viste tegn på toksisitet (f.eks nedsatt bevegelighet, perifer neuropati) etter flere injeksjoner. Disse mus ble tatt av behandling og ble ikke tatt med i vurderingen av antitumoraktivitet. Siden den samme dose ble gitt en sikker måte til ikke-tumorbærende mus, kan toksisiteten observert ved denne dose være på grunn av nærværet av svulsten eller forskjeller i mus belastning eller kjønn.
Mus med subkutane tumorer ble behandlet med de angitte doser av MTM-SDK, MTM-SK eller sterilt saltvann (kontroll) gitt av IP-injeksjoner to ganger i uken i fem uker (Q3D × 10). Tumorvolum (A) og kroppsvekt (B) ble målt to ganger i uken. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tumorvolumet i hver gruppe. Piler indikerer start og slutten av behandlingen. **, P . 0.001
MTM-SDK og MTM-SK hemme vekst av metastatisk prostatakreft
Vi var interessert i å avgjøre om behandling med MTM-A analoger var også effektive i en modell metastatisk prostatakreft. For dette formål benyttet en eksperimentell lungemetastase modell for å studere effektene av behandlingen på disseminerte humane kreftceller i immundefekte mus. PC3-celler ble injisert i halevenen til mus og veksten av lungemetastase ble overvåket ved qPCR i løpet av en 4 ukers periode [42]. En gruppe ubehandlede kontrollmus ble avlivet etter den første og andre uke fra injeksjonen av tumorceller. På denne tiden, i lungene inneholdt 0,015 og 0,135% av humane celler, henholdsvis, noe som bekrefter implantasjon og proliferasjon av de injiserte humane cancerceller (Fig. 6A). Deretter mottok musene 3 dager IP-injeksjoner av MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) eller bærer. Grupper av kontrolldyr og legemiddelbehandlede mus ble ofret to dager etter den andre og fjerde injeksjon og lungene undersøkt for tilstedeværelse av metastasering. På dette tidspunkt kontrollmus inneholdt 2,08% og 5,94%, henholdsvis, av humane cancerceller i overensstemmelse med utvidelsen av metastaser i lungene (Fig. 6A). I stedet mus behandlet med MTM-SDK hadde 0,14% og 0,09%, og de som ble behandlet med MTM-SK hadde 0,43% og 0,42% av humane kreftceller etter den andre og fjerde injeksjon, respektivt. Således kan veksten av spres humane metastatiske celler ble nesten fullstendig undertrykket ved behandlingen. QPCR data ble bekreftet ved histologisk undersøkelse fra lunge snitt tatt ved slutten av eksperimentet (fig. 6B). Multiple metastatiske noduler ble påvist i lunge av kontrollmus, mens det var ingen metastaser detekterbare ved mikroskopisk undersøkelse av seriesnitt av lungene hos de medikamentbehandlede dyrene.
Mus ble gitt PC3 ved IV-injeksjon inn i halevenen og deretter starter 3 uker senere fikk IP injeksjoner av MTM-SDK, MTM-SK eller sterilt saltvann to ganger i uken i to uker. Dosene av MTM-SK og MTM-SDK var 8 mg /kg og 1,2 mg /kg, henholdsvis. A) qPCR vurdering av lungemetastaser. Kontrollmus ble avlivet 1 og 2 uker før behandling og deretter kontrollere og legemiddelbehandlede mus ble avlivet ved slutten av det første og andre uke av behandlingen. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av prosentandelen av humane celler i forhold til total museceller i lungen (n = 3). Pilene angir tidspunktet for narkotika injeksjoner. B) Mikroskopisk evaluering av lungemetastaser. Lungevev ble oppsamlet fra kontroll- og medikamentbehandlede mus ved slutten av eksperimentet og farget med H E for histologisk undersøkelse. Representative seksjoner er vist (x 20). **, P . 0.001
Diskusjoner
Sp familie transkripsjonsfaktorer kontrollerer mange cellulære prosesser viktige for utvikling av menneskelige svulster [3]. Diverse strategier har blitt utforsket i de senere årene for å forstyrre aktiviteten til Sp TFS inkludert naturlige forbindelser og små interfererende RNA. Aureolic syrederivater, som MTM-A, er effektive inhibitorer av Sp TF’er [15], [18], [19], [20]. Disse forbindelsene binder til GC-rik DNA og forhindre interaksjonen av TFS med GC-rike sekvenser i genet promotorer. I tillegg, siden Sp TF’er kontrollere sin egen transkripsjon, MTM-A reduserer nivået av Sp-proteiner, og dermed forsterke den virkning på transkripsjonen aktivitet [21], [34]. Ulike faktorer kan påvirke de farmakologiske og toksikologiske egenskapene til aureolic antibiotika: affinitet for GC-rike sekvenser, forening /dissosiasjon kinetikk til DNA, evne til å konkurrere med Sp proteiner for å binde seg til DNA og cellulært opptak [17], [20], [ ,,,0],27], [43].
