Abstract
Bakgrunn
De eneste terapeutiske muligheter som finnes for plateepitelkarsinom lungekreft (SCC) er standard stråling og cytostatika. Cancer stamceller (cscs) er antatt å stå for terapeutisk motstand, noe som tyder på at cscs må være spesielt målrettet. Her analyserer vi transkriptom av CSC og ikke-CSC subpopulasjoner av RNA-seq å identifisere nye potensielle terapeutiske strategier for SCC.
Metoder
Vi sortert en SCC inn CD133- og CD133 + subpopulasjoner og deretter undersøkt både med kopi nummer analyse (CNA) og hele genomet og transkriptom sekvensering. Vi analyserte Kreft Genome Atlas (TCGA) transkriptom data for 221 SCCS å bestemme det generelle innholdet i våre observasjoner.
Resultater
Begge subpopulasjoner sterkt uttrykt mange mRNA isoformer som protein produkter er aktive narkotika mål for andre kreftformer; 31 (25%) svarer til 18 gener under aktiv undersøkelse som mAb mål og ytterligere 4 (3%) er av terapeutisk interesse. Videre fant vi bevis for at begge subpopulasjoner ble proliferatively drevet av svært høye nivåer av c-myc og TRAIL lang isoform (TRAIL
L) og at vanlige apoptotiske respons på høy uttrykket av disse genene ble forhindret gjennom høye nivåer av Mcl- 1
L og Bcl-x
L og c-Flip
L-isoformer for hvilke legemidler som nå er i klinisk utvikling. SCC RNA-seq data (n = 221) fra TCGA støttet våre funn. Vår analyse er i strid med CSC konsept som de fleste cellene i en kreftsvulst har mistet sin proliferativ potensial. Videre antyder vår studie hvordan å målrette både CSC og ikke-CSC subpopulasjoner med en behandlingsstrategi.
Konklusjoner
Vår studie er relevant for SCC spesielt for den presenterer mange potensielle alternativer til standard terapi som er rettet mot hele svulsten. Dermed viser det hvordan transkriptomet sekvensering gir innsikt i de molekylære grunnlaget for kreft spre celler som viktigere, kan utnyttes til å identifisere nye potensielle terapeutiske muligheter for kreft utover hva som er mulig med DNA-sekvense
Citation.: Barrett CL, Schwab RB, Jung H, Crain B, Goff DJ, Jamieson CHM, et al. (2013) transkriptomet Sekvensering av Tumor subpopulasjoner avslører et spekter av behandlingsalternativer for plateepitelkreft lungekreft. PLoS ONE 8 (3): e58714. doi: 10,1371 /journal.pone.0058714
Redaktør: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, USA
mottatt: 17 oktober 2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 20 mars 2013
Copyright: © 2013 Barrett et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Senter for translasjonell Science Award (UL1RR031980 og UL1TR000100) fra National Center for Forskning Resources, tre tilskudd (1R21CA152613-01, 1R21CA155615-01A1, CA69375) fra National Cancer Institute, fire tilskudd fra California Institute for Regenerative Medicine (CL1-00502, RT1-01108, TR1-01250, TR2-01789) og et stipend fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (P30 AI036214). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft står for 28% av alle kreftdødsfall-den høyeste andelen av alle krefttilfeller [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ~85-90% av lungekrefttilfellene, hvorav adenokarsinom og plateepitelkreft er de vanligste subtypene [1]. Selv i overkant av 70% av NSCLC pasienter har avansert sykdom som er sjelden kureres når diagnosen, nye fremskritt for undergrupper av lunge adenokarsinomer som havn EGFR mutasjoner eller EML4-ALK Genfusjonene stimulerer til utvikling av målrettede terapier som kan endre denne forferdelige situasjonen [2] . Disse genetiske endringer i hovedsak skje i adenokarsinomer av pasienter som aldri hadde røykt, og er uvanlig i SCC som hovedsakelig assosiert med røyking [3] – [5]. Mens FGFR1 [6] og DDR2 [7] har nylig dukket opp som potensielle terapeutiske mål for noen SCC pasienter, hemmere har ennå ikke nådd kliniske studier. Nylige NSCLC høy gjennomstrømning sekvenseringsstudier primært fokusert på å analysere DNA har vist at noen gener er mutert ved en tilstrekkelig høy frekvens til å være nyttige for målrettet terapi; Men disse studiene gjør forutsi DNA endringer som ofte gruppert i et begrenset antall viktige molekylære stier som tyder på at målretting disse banene kan være en levedyktig terapeutisk strategi [8] – [12]. Deep transkriptomet (RNA-seq) profilering av NSCLC å identifisere gener med deregulert uttrykk som er felles mellom svulster har ennå ikke blitt rapportert, selv om slike rapporter skal forventet gitt de store RNA-seq datasett blir generert av TCGA [13] og andre konsortier.
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP innen en individuell svulst eksistere i forskjellige fenotypiske stater som ofte viser viktige funksjonelle forskjeller. En subpopulasjon av celler med selvfornyende og tumor initiere funksjonene, ofte referert til som kreft-stilk-lignende celler (cscs), er blitt identifisert i en rekke forskjellige tumortyper, inkludert NSCLC [14]. Montering bevis tyder på at cscs er resistente mot anticancer behandling og ligger til grunn for metastasering [15], [16], og dermed er den primære kreftcelletype ansvarlig for tilbakefall og progresjon av ondartede svulster. Den umiddelbare Implikasjonen er at ved å målrette cscs bør det være mulig å eliminere den legemiddelresistente og metastatisk subpopulasjon av en kreft [14]. Imidlertid har nyere studier vist at CSC fenotype er av plast og kan bli rekonstituert ved andre, ikke-CSC, tumorceller [17], [18]; dermed ikke bare cscs men alle kreft subpopulasjoner som er «potensielle cscs» må være målrettet. Transkriptomet sekvensering av CSC og ikke-CSC subpopulasjoner i NSCLC vil gi innsikt i det molekylære grunnlaget bak sine fenotypiske likheter og forskjeller og lette identifisering av nye terapeutiske mål. En slik analyse vil være et viktig og nødvendig supplement til bulk svulst transkriptomet profilering som utføres av TCGA og andre.
De observasjoner som ikke-cscs kan rekonstituere cscs, og vice versa, tyder på at de fenotypiske forskjeller mellom disse undergruppene skyldes epigenetisk snarere enn genetiske forskjeller. Derfor er exome og genomsekvense eksperimenter som tar sikte på å identifisere somatiske mutasjoner ikke forventes å avsløre forskjeller mellom sortert CSC og ikke-CSC delpopulasjoner. På den annen side, transkriptomet profilering, noe som er en avlesning av epigenome (dvs. histon merker og DNA-metylering som regulerer ekspresjonen), bør være en utmerket metode for profilering cscs og ikke-cscs å avdekke mekanistiske forskjeller. Fordelen med RNA-seq data over mikromatriser er evnen til å analysere isoform uttrykk forskjeller [19]. I kreftceller, kan alternative mRNA-isoformer produsere protein isoformene med dominant negativ aktivitet. Den patogene rolle av kreftspesifikke isoformer har blitt grundig demonstrert i alle aspekter av cellulær fysiologi, inkludert mobilnettet vedheft og metastasering (CD44 og RON), cellevekst og tumordannelse (PKM2, MDM2, FGFR2, CRK, nummen), cellesyklus (Pyk ), angiogenese (VEGF), apoptose (GS3KB, CD95, Bcl-X, caspase-2, caspase-9), metabolisme (PK), og medikamentresistens (AR og MRP-1) [20] – [24]. Disse eksemplene understreker fordelen av isoform-nivå transkriptomet informasjon over hele genuttrykk for å få innsikt i de molekylære mekanismene bak CSC og ikke-CSC fenotypiske forskjeller.
Her er vi rapportere bruk av genomikk teknologier til et SCC xenograft som ble sortert i CSC og ikke-CSC subpopulasjoner basert på CD133 markør (figur 1). CD133 (PROM1; Prominin-1) er en 5-transmembran-glykoprotein som er ansett for å være en markør for en undergruppe av cscs i begge undergrupper av NSCLC [15], [25] – [27]. I NSCLC den CD133 + undergruppe har vist seg å ha høyere karsinogent potensial i SCID-mus, til å uttrykke høyere nivåer av stemness gener og for å være mer resistente mot konvensjonell kjemoterapi enn CD133- subpopulasjon [15]. Viktigere, slik at SCC xenograft ville være mer representativ for primærtumor, det var direkte innpodet som hakket primære svulsten i NSG mus og ble aldri vokst
in vitro
. Hel-genom DNA-analyse viste at kromosomene av CD133 + og CD133- subpopulasjoner var svært sinnsforvirret i en svært lik måte; men som forventet svulsten ikke båtplass klinisk handlings mutasjoner. Analyse av mRNA spleise isoform uttrykk profiler av CD133 + og CD133- subpopulasjoner resulterte i identifisering av SCC som en potensiell ny indikasjon for mange legemidler under utvikling og foreslå flere andre nye lovende mål. Endelig, analyse av The Cancer Genome Atlas (TCGA) offentlig tilgjengelig transkriptomet RNA-seq data for 221 SCCS [28] støtter det generelle i våre transkriptom funn for denne sykdommen. Tilsammen vår studie viser evnen til transkriptomet sekvensering av sorterte kreft celle subpopulasjoner å informere klinisk utvikling på måter som ikke er mulig med DNA-sekvensering.
Vi sorterte humane tumorceller av en plateepitel kreft xenograft celle lunge i CD133 + og CD133- subpopulasjoner. Vi deretter utført CNA analyse ved hjelp av genotyping arrays på perifere mononukleære blodceller (PBMC) samt både CD133 + og CD133- subpopulasjoner. Vi sammenlignet genomene til CD133 + befolkningen og PBMC prøve å identifisere somatiske mutasjoner. Til slutt utførte vi hele transkriptomet sekvensering (RNA-seq) av CD133 + og CD133- subpopulasjoner å vurdere sine mRNA isoform uttrykk forskjeller og likheter.
Metoder
Xenografting
En UCSD menneske Forskning Protections Program Institutional Review Board (IRB) godkjent denne studien før eventuelle studierelaterte aktiviteter. Alle dyr eksperimentelle prosedyrer følges Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (Institutt for Forsøksdyr Research, 1996), og ble godkjent av Pfizer Global Research and Development Institutional Animal Care og bruk komité. En 75 år gammel mann med en 30-pack-årige historie av røyking og en forresten funnet lunge nodule gitt skriftlig dokumentert informert samtykke i henhold til denne IRB godkjent protokollen før operasjonen. Reseksjon avdekket en T1 moderat differensiert plateepitelkarsinom. En del av hans resected frisk svulst ble tatt for xenografting i NSG (eksakt stamme navn NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ) mus (The Jackson Laboratory). Påfølgende passasjer ble gjort i CB17.Cg-PrkdcscidLystbg /CRL mus fra Charles River. Hakket frisk tumor ble blandet med Matrigel (BD Biosciences) og innsatt subkutant. Musene ble observert før håndgripelig svulster vokste og disse ble høstet for serie implantasjon og studere. Ved to-års oppfølging emnet forble uten kliniske eller radiografiske tegn på tilbakefall.
Isolering av RNA og DNA
Lysates fra CD133- /EpCAM + og CD133 + /EpCAM + sortert prøver ble behandlet for RNA og DNA ekstraksjon ved hjelp av Qiagen s All Prep Mini Kit (Valencia, California). Prøvene ble behandlet i henhold til produsentens anbefalinger. Ikke mer enn fire volumer ble lastet på en enkelt RNeasy Mini Spin kolonne. Totalt RNA prøver ble evaluert for renhet og konsentrasjon med Agilent 2100 Bioanalyzer på Genechip Microarray Core.
RNA sekvense
Total RNA fra både CD133- /EpCAM + og CD133 + /EpCAM + kreft subpopulasjoner ( ~230 ng hver) ble brukt til å generere hele transkriptom biblioteker for sekvensering på solid plattform følgende produsentens anbefaling (Life Technologies, Carlsbad CA, USA). RNA prøver ble fragmentert av RNase III og konsentrert ved hjelp RiboMinus konsentrasjon Module (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). RNA fragmenter ble ligert til solide adapter mikser og revers transkripsjon utført. Rensede cDNA ble valgte størrelsen (150-250 bp) bruker MinElute PCR rensing kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA), og så forsterket 15 sykluser ved hjelp av solid tre «og solid 5» primere. Amplified cDNA ble renset ved hjelp PureLink PCR Micro kit (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), QC’ed av Bioanalyzer 2100 DNA 1000 kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA), og kvantifisert ved hjelp av qubit 2,0 fluorometer (Invitrogen, Carlsbad CA, USA). Hele transkriptom bibliotekene ble brukt for å lage solide malbasert perler etter den solide templated Bead guide Forberedelse og sekvensert med 50 × 25 parvise end-protokollen, for hver prøve å generere mer enn 500 M lese par per prøve.
Computational analyse av RNA-seq data
transkriptomet sekvensering av CD133 + og CD133- subpopulasjoner produsert 529 M og 531 M 50 × 25 lese parene, henholdsvis. Vi først justert hele transkriptomet parvise end leser til rRNA og tRNA-gener som bruker versjon 0.6.4 f av bfast + bwa [29] og beholdt bare de parene som verken har lest ble justert, noe som resulterer i datasett bestående av 77 M og 79 M les par. Vi deretter justert hvert sett av tilbakeholdt lese parene med bfast + bwa til en tilpasset ikke-redundante database av mRNA isoformer konstruert med «cuffcompare» programmet fra versjon 0.9.3 av mansjettknapper programvarepakke (79) og alle isoform modeller i RefSeq [30], UCSC Kjente Genes [31], og Ensembl [32] databaser. Vi neste konvertert lese justering koordinatene i mRNA isoformer databasen til hg19 genomisk koordinater ved hjelp av et egendefinert skript. Fra disse justeringer vi beregnet uttrykk og differensial uttrykk statistikk med «mansjettknapper» og «cuffdiff» programmer av mansjettknapper, henholdsvis. Når du bruker begge programmene vi brukte øvre kvartil normalisering og hg19 menneskelige genom referansesekvens for skjevhet korreksjon. Vi beregnet at 13,612 43,120 gener og gen-isoformer hadde noen ikke-null-nivå av ekspresjon i det minste en av de to subpopulasjoner. Figur S1 i Information S1 viser et histogram av disse forhånds filtrert isoform uttrykk verdier i begge celle subpopulasjoner. Et flertall av disse tilfellene var grunn til å lese kartleggingen av støy, eller for å «lekk» genekspresjon som er av ukjent fysiologisk betydning [33], så vi anvendt minimum ekspresjon og lese deknings kriterier ( 1 FPKM og 60% dekning) for å oppnå en innledende isoform uttrykk anslår i de to undergruppene. Vi observerte at 3,844 gener med 7,558 mRNA isoformer møtt disse minstekrav. Å være svært trygg i våre uttrykk og differensial uttrykk resultater, søkte vi strengere filtrering til de opprinnelige isoform uttrykk estimater; vi begrenset vår analyse til mRNA-isoformer som ble uttrykt ved et nivå på minst 30 FPKM i en av de subpopulasjoner, og som var dekket over minst 60% av deres lengde ved sekvensering leser. I tillegg, for en isoform til å bli kalt uttrykt forskjellig, dens differensial uttrykk måtte bli kalt signifikant ved en FDR på 0,01, og til å ha endret seg minst fire ganger mellom de to subpopulasjoner. Anvendelse av disse kriteriene, ga 572 gener som hadde minst en isoform som var signifikant forskjellig uttrykt. Som et sluttresultat, beregnet vi 671 til 43,120 isoformene (1,6%) å være signifikant forskjellig uttrykt. Tabell S1 i Information S1 viser hvordan disse tallene endres for ulike FPKM og brett endre kriteriene.
Resultater
Isolering av CSC og ikke-CSC subpopulasjoner
Vi isolerte humane cscs ( CD133 + /EpCAM +) og ikke-cscs (CD133- /EpCAM +) fra en squamous kreft-xenograft celle lunge ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og henholdsvis oppsamlet totalt 9,19 x 10
4 (3,4%) og 2,18 x 10
6 (96.6%) levende celler som tilsvarer de to subpopulasjoner (figur 2). For å vurdere kvaliteten på våre liksom vi målt uttrykk nivåer av CD133 isoformer (Figur S2 i Information S1) i hele transkriptom data (beskrevet nedenfor) og observert moderat uttrykk for tre isoformer i CD133 + undergruppe og ingen påviselig nivå av uttrykk i CD133 – undergruppe. Vi utførte en andre FACS for den samme xenograft isolert fra et annet dyr og oppnås et tilsvarende antall og andelen av CD133 + og CD133- celler (figur S3 i Information S1). Våre resultater viser at vi er i stand til å sortere i rene CD133 + og CD133- subpopulasjoner og at CD133 + undergruppe utgjør en mindre andel av kreftceller i plateepitelkarsinom lunge svulst, som er konsistent med tidligere publiserte studier [15], [26] .
(A) live celler vises distinkte populasjoner av enten mus CD45 /MHC i eller menneskelig EpCAM uttrykk. (B) Isolering av menneskelige CD133 + celler (rød) fra menneskelige CD133- celler (grønt) og muse positive celler (blå). (C) reanalyse av celle populasjoner i panel B viser at C133 + celler (rød) er 3,4% av EpCAM + befolkningen.
Den mutasjons landskapet i squamous celle lunge svulst subpopulasjoner
Vi utførte Kopier nummer Endring (CNA) analyse av microarray (se Resultater og metoder i Information S1) av kimcellelinje, CD133 + og CD133- DNA og funnet ut at omtrent halvparten av hele genomet i både CD133- og CD133 + subpopulasjoner var involvert i store CNAs (figur S4 i Information S1). Overlapping Analysen avdekket potensialet eksistensen av CNAs spesifikke for hver undergruppe, men ved manuell inspeksjon av alle CNAs og tar hensyn til nøyaktigheten av mikromatriser [34], vi kunne ikke trygt identifisere forskjeller. Dermed har vi konkludert med at kromosomene i CD133 + og CD133- subpopulasjoner ble sterkt endret i en stor grad utvisket måte. I tillegg, analyserte vi hele genomet sekvensdata av CD133 + subpopulasjonen og samsvarende kimlinje DNA og konkluderte med at svulsten undersøkt, viste ikke inneholder noen klinisk handlings mutasjoner (tabellene S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10 , S11, S12 i Information S2 og figur S8 i Information S1).
Evaluering av mRNA isoformer av gener som koder for celleoverflateproteiner
deregulert uttrykk for mRNA isoformer kan resultere i generering av kreft tilhørende celleoverflateproteiner som er potensielle antigene mål for terapeutiske monoklonale antistoffer. For å identifisere slike mål, målte vi ekspresjonen av mRNA 1,191 isoformer av 426 CD Molecule [35], 354 GPCR [36], og 212 ionekanal [36] gener (992 totalt antall gener). Vi begrenset våre analyser til isoformer som ble minst moderat uttrykt (30 FPKM) og dekket over minst 60% av sin lengde ved sekvensering leser i enten eller begge CD133 + og CD133- subpopulasjoner, som gir en evaluering sett av 124 isoformer som representerer 80 gener (10,4% av 1,191 isoformene og 8,0% av de 992 genene) (figur 3; Tallene s5a, S5b i Information S1). Av de 124 høyt uttrykte isoformer, 43 (i 25 gener) har minst fire gangers uttrykk forskjeller (FDR 0,01), med 24 viste nedsatt og 19 viser økt ekspresjon i CD133 + celler i forhold til CD133- celler (figur 3). Interessant, 31 (25%) av de 124 høyt uttrykt isoformer tilsvare 18 gener som er under aktiv etterforskning som narkotika mål for mange kreftformer (spesielt ABCG2 [37], ADAM10 [38], Alcam [39], [40], BSG [ ,,,0],41], CD151 [42], CD44 [43], CD47 [44], [45], CD9 [46] – [50], CEACAM5 [51], [52], CEACAM6 [52], CXCR4 [53], EpCAM [54], erbB2 [55], ICAM1 [56], IGF1R [57], NRP1 [58], NT5E [59], TRPM7 [60]. av notatet, ABCG2 isoformen (16X høyere uttrykk i CD133 + undergruppe) og CXCR4 isoform (4X høyere uttrykk i CD133 + undergruppe) har tidligere blitt identifisert som biomarkører for kreft svulst lunge initierende celler spart ved cisplatin behandling [15]. i tillegg til disse 18 genene under aktiv etterforskning som legemiddel rettet mot to andre sterkt uttrykte gener -CD97 [61], og IFITM1 [62] -har blitt foreslått, men ikke aktivt fulgt som terapeutiske antistoff mål for primær eller metastatiske svulster. Vi tror at andre høyt uttrykte celleoverflate gener som er vist i figur 3 kan også være potensielle narkotika mål. For eksempel, en isoform av DDR1, en homolog av DDR2 det er et lovende mål for SCC [7], blir sterkt uttrykt i CD133 + -celler. ICAM4, som har vist en rolle i karsinogenese og er plassert i den 19p13.2 mottakelighet locus for flere krefttyper [63], [64], er også sterkt uttrykt. Som disse 22 celleoverflate gener av terapeutisk interesse koder for proteiner involvert i celle-celle interaksjoner, celle adhesjon, migrasjon, og chemoresistance, deres uttrykk likheter og forskjeller som er identifisert her illustrerer hvordan isoform nivå analyser kan gi et nytt nivå av informasjon for både forståelse fysiologi, og for målretting spesifikke kreft subpopulasjoner.
Viste er uttrykket nivåer av 1,191 isoformer av 426 CD Molecule, 354 GPCR og 212 ionekanal gener. Grå sirkler tilsvarer isoformer som ikke oppfyller våre minimums uttrykk nivå kriterier og blå sirklene til isoformer som gjorde, men var ikke signifikant forskjellig uttrykt. Fargede trekanter indikerer signifikant forskjellig uttrykt isoformer; grønne nedover peker trekanter indikerer redusert uttrykk og røde up-peker trekanter indikerer økt uttrykk i CD133 + celler. De diagonale grå linjene er sammenleggbare endrings clines. Isoformer diskutert i teksten er navngitt. Merk at CD133 /PROM1 ikke oppfyller våre uttrykk kriterium, underliggende nivåene av våre data filtrering; men er vist for sammenligning. Her bruker vi HGNC-godkjente genet symboler [96] og UCSC isoform betegnelser [31].
For å vurdere i hvilken grad høy ekspresjon av terapeutisk attraktive celleoverflateproteiner som er beskrevet ovenfor for studert svulsten er et vanlig fenomen i SCC vi undersøkte TCGA transkriptom data for 221 squamous celle lunge kreft [28], [65]. Viktigere er TCGA sekvensering utført på bulk svulst, slik at subpopulasjonen preparatet er forventet å være helt annerledes enn CD133 + og CD133- subpopulasjoner av karsinomer i vårt studium. Den allment tilgjengelige TCGA uttrykk data analyseres ved exon-, spleise junction-, og gen-nivå. Siden det er ingen etablert måte å antyde isoform-nivå uttrykk fra ekson og spleise uttrykk, valgte vi å sammenligne vår isoform nivå uttrykk estimater med TCGA gen ekspresjon estimater. Basert på det faktum at vår analyse fokusert på isoformer med høy uttrykk, begrunnet vi at hvis våre funn er generelt til SCC så ville vi observere høyt uttrykk for tilsvarende hele gener på tvers av et flertall av de 221 tumorprøver. Som vist i figur 4A, 4C, er de fleste av de 22 celleoverflate gener av terapeutisk interesse robust uttrykk på tvers av alle 221 prøver med 12 plassering i topp 10% (median uttrykk 31 RPKM) av de høyest uttrykte gener. Interessant, ABCG2 og ICAM4, som har de to laveste ekspresjonsnivåene av de 22 gener, ble hovedsakelig uttrykt i CD133 + subpopulasjonen. Denne situasjonen speil som CD133 /PROM1 (figur 3), så vi spekulere at den tilsynelatende lav tumor-omfattende ekspresjon av ABCG2 og ICAM4 er fordi de er robust uttrykkes bare i CD133 + -celler, som utgjør en mindre fraksjon av tumorcellene. Samlet er disse resultatene tyder på at våre funn er generelle for SCC og så kunne påvirke klinisk utvikling fordi de identifiserer denne sykdommen som en potensiell ny indikasjon for mange legemidler som er under utvikling, og foreslår flere andre nye lovende mål.
A) celleoverflaten og B) apoptose-relatert hele genekspresjon estimater fra 221 lungekreft plateepitelkarsinom prøver. C) Fordelingen av uttrykk nivåer beregnet for 20,533 gener per prøve, i gjennomsnitt over alle 221 prøver. Den stiplede horisontale linjen viser topp 5% av gener, da rangert etter uttrykk.
Evaluering av mRNA isoformer av gener involvert i apoptose
Gitt omfanget av genomisk endringer observert i CNA analyse av den undersøkte SCC og de tallrike kjente celledød mekanismer som reagerer på DNA-skade, mistanke om vi at kreftcellene må ha endret ekspresjon av apoptose-relaterte gener for å overleve under en så høy mutasjonsbelastnings. For å få innsikt i overlevelse kapasitet CD133 + og CD133- subpopulasjoner, utførte vi en fokusert uttrykk analyse på et sett av 106 apoptose relaterte gener (Tabell S2 i Information S2) som til sammen hadde 434 mRNA isoformer. Som ovenfor, er begrenset vi vår analyse for å isoformer som ble uttrykt ved det nivå på minst 30 FPKM og som var dekket over minst 60% av deres lengde ved sekvensering leser i en eller begge av de subpopulasjoner. Tretti av de 106 gener (28%) og 37 av de 434 isoformene (9%) møtte disse kriteriene (figur 5, figur S6 i Information S1). Interessant nok bare 9 isoformer i 6-genene var signifikant forskjellig uttrykt med minst en fire-ganger forskjell mellom de to subpopulasjoner (FDR 0,01). Verdt å merke seg er den høye uttrykk for en L-myc isoform (MYCL1, uc001cer) og en XIAP isoform (XIAP, ucoo4etx) i begge delpopulasjoner, med fire ganger oppregulering i CD133 + og CD133- subpopulasjoner, henholdsvis. L-Myc er et globalt virkende transkripsjonsfaktor og av alle proteinene i Myc familien (N-Myc, c-Myc, og L-Myc) det har den sterkeste og mest spesifikk aktivitet i å fremme human IPSC generasjon-antagelig gjennom sin evne til å undertrykke differensierings-assosierte gener [66]. XIAP er en velkjent suppressor av apoptose i tillegg til andre fysiologiske roller knyttet til sin E3 ubiquitin ligase aktivitet [67]. Også verdt å merke seg er de få isoformene (dvs BCLAF1 og BFAR isoformer) med 16x differensial uttrykk. BCLAF1, som har en isoform høyt uttrykt bare i CD133- undergruppe, spiller viktige roller i mange prosesser [68], inkludert lunge- utvikling [69]. BFAR, en E3 ubiquitin ligase som sannsynligvis formidler crosstalk mellom indre og ytre apoptotiske trasé [70], har en isoform uttrykt utelukkende i CD133 + og en annen utelukkende i CD133-. Disse resultater antyder at, selv om den totale CD133 + og CD133- subpopulasjoner tilsvarende uttrykk for apoptose-relaterte gener, kan ekspresjons forskjeller i isoformer av nøkkel apoptose gener delvis bidrar til selvfornyelse og overlevelses forskjeller mellom disse kreftcelletyper.
Viste er uttrykket nivåer av 434 isoformer av 106 apoptose relaterte gener. Grå sirkler tilsvarer isoformer som ikke oppfyller våre minimums uttrykk nivå kriterier og blå sirklene til isoformer som gjorde, men var ikke signifikant forskjellig uttrykt. Fargede trekanter indikerer signifikant forskjellig uttrykt isoformer; grønne nedover peker trekanter indikerer redusert uttrykk og røde up-peker trekanter indikerer økt uttrykk i CD133 + celler. De diagonale grå linjene er sammenleggbare endrings clines. Isoformer diskutert i teksten er navngitt. Isoformer diskutert i teksten er navngitt. Her bruker vi HGNC-godkjente genet symboler [96] og UCSC isoform betegnelser [31].
neste fokusert på de mest høyt uttrykte apoptose relaterte gener i både CD133 + og CD133- subpopulasjoner å få innsikt i overlevelsesmekanismer felles mellom disse kreftcelletyper. Dette fokusert analyse avslørte c-myc (MYC, uc003ysi), og de lange isoformer av TRAIL /TNFSF10 (TNFSF10, uc003fid), Mcl-en (MCL1, uc010pch), og BCL-x (BCL2L1, uc002wwl) for å være blant de mest høyt uttrykte apoptose-relaterte gener (figur 5). Vi bekreftet av RT-qPCR høy uttrykk for c-myc, Mcl-en
L, og BCL-x
L i både CD133 + og CD133- subpopulasjoner (Figur S7 i Information S1). Det er velkjent at høy c-myc ekspresjonen potent induserer den indre (mitokondriene-mediert) celledød reaksjonsvei; men samtidig høyt uttrykk for Mcl-en
L og Bcl-x
L kan beslaglegge mitokondrie ytre membranproteiner Bak og Bax [71], [72], og dermed blokkere apoptotiske konsekvensene av c-myc. En slik rolle for Mcl-en
L og Bcl-x
L har nylig blitt demonstrert i 14 c-myc-drevet ikke-plateepitel lungekreft humane cellelinjer [73], i musemodeller av adenokarsinom lungekreft [74], og i andre sammenhenger malignitet [75]. Våre data impliserer Mcl-1
L og Bcl-x
L i blokkering av apoptotiske virkninger av c-myc i både CSC og den ikke-CSC subpopulasjon av den undersøkte squamous cell carcinoma. Vi merker oss at mens de lange isoformer av Mcl-en og Bcl-x har vist pro-overlevelse funksjoner, de korte isoformer av disse genene, som ikke ble uttrykt, er pro-apoptotiske [76]. Høy ekspresjon av den lange isoformen av TRAIL (TRAIL
L) i begge subpopulasjoner er betydelig, da dette cytokin er under undersøkelse som et anti-cancermiddel [77] fordi det kan selektivt å drepe tumorceller via reseptor-mediert apoptose. Men langvarig eksponering for høye nivåer av TRAIL
L kan resultere i TRAIL
L motstand, etter som TRAIL
L blir en sterk induser av spredning og metastasering [78]. Tidligere studier har vist både Mcl-en
L, og BCL-x
L å være ansvarlig for ervervet TRAIL
L motstand i ikke-plateepitel lungekreft cellelinjer [79] og i andre kreftcellelinjer [ ,,,0],80] – [83]. Av notatet, en annen viktig faktor for TRAIL motstand, c-Flip
L (CFLAR, uc002uxb) -den lang isoform av Flip /CFLAR som er en katalytisk inaktiv homolog av caspase-8-er også sterkt til uttrykk i begge subpopulasjoner av vår studerte SCC (figur 5) [79], [84] – [87]. De korte isoformer av både TRAIL og c-Flip har også versene pro-apoptotiske roller i forhold til de lange isoformene [79], [88]. Helt vår isoform-nivå genekspresjon analyse tyder på at i det studerte SCC både CD133 + og CD133- subpopulasjoner ble drevet ved meget høye nivåer av c-myc og TRAIL
L, og at den normale apoptotiske respons på høy ekspresjon av disse genene ble forhindret gjennom svært høye nivåer av Mcl-en
L og Bcl-x
L og c-Flip
L.
Igjen har vi brukt TCGA transkriptom data for 221 squamous celle lunge kreft til bestemme det generelle i våre apoptose genet isoform analyseresultater. Som ovenfor for ABCG2 og ICAM4, attributt vi den tilsynelatende lav tumor-omfattende ekspresjon av L-Myc (MYCL1) (figur 4B, 4C) for å muligheten for at i SCC er det robust uttrykkes bare i CD133 + -celler, som utgjør en liten brøkdel av tumorceller.
