Abstract
Bakgrunn
mikroRNA-34a (MIR-34a) er en transkripsjons mål av p53 og er nedregulert i bukspyttkjertelkreft. Denne studien hadde som mål å undersøke den funksjonelle betydningen av MIR-34a i bukspyttkjertelkreft progresjon gjennom epigenetisk restaurering med kromatin modulatorer, demethylating agenten 5-Aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-DC) og HDAC hemmer Vorinostat (Saha).
metodikk /hovedfunnene
Re-uttrykk for MIR-34a i menneskelige bukspyttkjertelen kreft stamceller (cscs) og i humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved behandling med 5-Aza-dC og Saha sterkt hemmet celle proliferasjon, cellesyklusprogresjon, selvfornyelse, epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og invasjon. I bukspyttkjertelen cscs, modulering av MIR-34a indusert apoptose ved å aktivere caspase-3/7. Behandling av pankreas cscs med kromatin-modulerende midler resulterte i inhibering av Bcl-2, CDK6 og SIRT1, som er de antatte målene for MIR-34a. MiR-34a oppregulering av disse midlene også indusert acetylert p53, p21
WAF1, p27
KIP1 og PUMA i bukspyttkjertelen cscs. Hemming av MIR-34a ved antagomiR opphever virkningene av 5-Aza-DC og Saha, som tyder på at 5-Aza-DC og Saha regulere stamcelleegenskaper gjennom MIR-34a. I cscs, Saha hemmet Notch svei, noe som tyder på dens undertrykkelse kan bidra til inhibering av den selvfornyelse kapasitet og induksjon av apoptose. Interessant, behandling av pankreas cscs med Saha resulterte i inhibering av EMT med den transkripsjonelle opp-regulering av E-cadherin og nedregulering av N-cadherin. Uttrykk for EMT indusere (Zeb-1, Snail og Slug) ble hemmet i cscs ved behandling med Saha. 5-Aza-DC og Saha også forsinke
in vitro
migrasjon og invasjon av cscs.
Konklusjoner
Denne studien viser dermed rollen som MIR-34a som en kritisk regulator av bukspyttkjertelkreft progresjon av regulerings CSC egenskaper. Restaureringen av sitt uttrykk med 5-Aza-DC og Saha i cscs vil ikke bare gi mekanistisk innsikt og terapeutiske mål for kreft i bukspyttkjertelen, men lover også reagenser for å øke pasientens respons på eksisterende chemotherapies eller som en frittstående kreft narkotika ved å eliminere CSC egenskaper.
Citation: Nalls D, Tang SN, Rodova M, Srivastava RK, Shankar S (2011) Targeting epigenetisk regulering av MIR-34a for behandling av bukspyttkjertelkreft ved Hemming av kreft i bukspyttkjertelen stamceller. PLoS ONE 6 (8): e24099. doi: 10,1371 /journal.pone.0024099
Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 29 juni 2011; Godkjent: 31 juli 2011; Publisert: 31 august 2011
Copyright: © 2011 Nalls et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Institutes of Health (R01CA125262, RO1CA114469, 3R01CA114469-05S1, og 3R01CA125262-03S1), Kansas Bioscience Authority, og Susan G. Komen Breast Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreftdød i USA og er en ødeleggende invasiv sykdom og en av de mest aggressive kreftformer [1]. Den dårlig prognose av pankreatisk adenokarsinom tilskrives dens sent presentasjon, mangel på nøyaktig biomarkører for tidlig diagnose for muligheten for kurativ reseksjon samt tilbøyelighet til tidlig metastaser. Derfor er nye diagnostiske modaliteter for tidlig diagnose og nye terapeutiske strategier presserende behov.
microRNAs (mirnas) er endogene, noncoding små RNA 19-25 nukleotider i lengde, som nå er anerkjent som avgjørende innlegget transcriptional regulering av gen uttrykk [2], [3], [4]. Evnen til mirnas å regulere multiple gener i samsvar dem å spille viktige roller i biologiske prosesser som uttrykker tumorprogresjon inkludert migrasjon, invasjon epithelial til mesenchymale overgang (EMT) og metastase [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. Mirnas er veldig lovende så tidlig biomarkører, prognostiske indikatorer og mekanisme basert terapeutiske mål for kreft behandlinger [11], [12], [13], [14], [15] fordi deres avvikende uttrykk knyttet til kreft stamcelle (CSC) deregulering og dermed onkogenese [16].
Cancer stamceller gir opphav til svulsten bulk gjennom kontinuerlig selvfornyelse og differensiering [17]. Bukspyttkjertelen cscs er svært tumorigent og selv fornye sub-populasjon som uttrykker celleoverflaten markør CD133 + /CD44 + /CD24 + /ESA + [17], [18], [19]. Strategier blir utviklet mot målrettede ødeleggelsen av disse tumor stamceller mens sparsom de fysiologiske stamceller, som kan føre til markert bedring i pasientenes prognose. Ved å endre ekspresjonen av spesifikke mirnas som kan spille en viktig rolle i bukspyttkjertelen CSC fornyelse og kan således bidra til utvikling av pankreatisk karsinom, vil bidra til å oppnå en selektiv og målrettet eliminering av pankreatiske cscs. Derfor forstå mekanismene som regulerer selvfornyelse er av størst betydning for oppdagelsen av kreft narkotika rettet mot cscs.
TP53 er en viktig tumor suppressor gen hvis biologiske effekter er i stor grad på grunn av sin funksjon som en transkripsjonsregulator [20 ]. TP53 mutasjoner er relativt vanlig og forekommer hos opptil 70% av tilfellene med bukspyttkjertelen adenokarsinom og er mest sett i dårlig differensierte svulster [21], [22], [23], [24], [25]. Svulsten suppressor TP53 har blitt identifisert som en transcriptional regulator av MIR-34a og flere nyere studier har innblandet Mir-34 familien av miRNAs i p53 tumor suppressor nettverk [20], [26]. MIR-34a er sterkt uttrykt i normale vev, som testikler, lunge, binyre og milt, selv om dets fysiologiske funksjon er ikke kjent. MIR-34a er lokalisert på det humane kromosom 1p36, som er et område som er knyttet til en rekke kreftformer, og har vist seg å være nedregulert i bukspyttkjertelkreft [20]. Redusert uttrykk for MIR-34a i bukspyttkjertelkreft kan være en resulterende av enten transkripsjonsregulering på grunn av p53 mutasjoner som disse er svært hyppig [22] eller gjennom epigenetisk lyddemping. Derfor forstå bidrag fra disse mekanismene i nedregulering av MIR-34a i kreft i bukspyttkjertelen, noe som kan bidra til malignitet i bukspyttkjertelen, kan være av betydning.
MiR-34a fungerer som en suppressor av neuroblastom tumorigenesis ved å målrette den mRNA koder E2F3 og redusere E2F3 protein nivå [27]. Det har også vist seg å være hyper-metylert i bryst, eggstokk, tarm, lunge og hematologiske maligniteter og nedregulere CDK6 oversettelse derved beviste at de tumor suppressor rollen MIR-34a [28], [29], [30]. Mir-34a responsive gener høyanriket for de som regulerer cellesyklusprogresjon, celleproliferasjon, apoptose, DNA-reparasjon, og angiogenese og gir dermed et funksjonelt grunnlag for epigenetisk inaktivering av denne miRNA i bukspyttkjertelkreft [31].
Det er vel etablert at mange tumorsuppressorgener i kreft hos mennesker er brakt til taushet av arrangøren metylering ledsaget av kromatin endringer på grunn av rekruttering av histone deactylases av proteiner som binder til denaturert CpG-rester. Disse epigenetiske markører assosiert med taushet av tumorsuppressorgener kan bidra i tumorprogresjon og kan være terapeutisk reversibel, tjener som mål for kreft i bukspyttkjertelen behandling. Basert på denne forutsetningen, kvantifisert vi uttrykket av MIR-34a i menneskelige bukspyttkjertelen cscs og bukspyttkjertelkreft cellelinjer uavhengig av p53 mutasjon status, sammenlignet med vanlig bukspyttkjertelen duktale epitelceller bruker TaqMan miRNA analyser.
Notch signalene er kjent for å påvirke stamcelle selfrenewal og differensiering, og har blitt foreslått å spille en rolle i løpet av pankreatisk karsinogenese [32], [33]. Flere medlemmer av Notch signalveien er uttrykt i bukspyttkjertelen [32]. Hakket reseptorer aktiveres av Delta og Serrate /Jagged ligander [34], som fremmer proteolytisk spalting og utgivelsen av Notch intracellulære domenet (ICD). Den aktiverte Notch-ICD translocates inn i kjernen og samhandler med transkripsjonsfaktor CSL /RBP-Jκ og co-aktivator Mastermind (MAM) for å aktivere målgener som Hes1 og Hes5 [35], [36], og Hes uttrykk kan derfor brukes som en lese ut for Notch aktivitet [37].
Våre nåværende studier har avdekket at uttrykket nivåer av MIR-34a ble betydelig redusert i bukspyttkjertelen cscs og kreft i bukspyttkjertelen kreftceller uavhengig av deres p53 mutasjonsstatus, sammenlignet med vanlige pancreatic ductal epitelceller. Dette fører oss til hypoteser om at MIR-34a, og dermed kan epigenetiske brakt til taushet i bukspyttkjertelkreft. Reduksjon av MIR-34a genet metylering og endret acetylering mønster ved bruk av kromatin-modifiserende midler førte samtidig reaktivering av MIR-34a uttrykk. Uttrykk av MIR-34a i bukspyttkjertelen cscs og cellelinjer ble betydelig indusert på behandling med kromatin modifikatorer, demethylating agenten 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-DC) eller histondeacetylase inhibitor, Saha (vorionostat). 5-Aza-DC og Saha også hemmet veksten og induserte apoptose i bukspyttkjertelen cscs. Videre, for å forstå den funksjonelle rollen til mir-34a ved regulering av kreft i bukspyttkjertelen progresjon effekten av 5-Aza-dC og Saha på protein ekspresjon av antatte målene for MIR-34a i pankreatiske cscs ble undersøkt. 5-Aza-dC inhiberte ekspresjon av cyclin D1 og CDK4 og tvert imot induserte ekspresjon av p27
/KIP1, og disse effektene ble opphevet i nærvær av miR34a antagonist. Tilsvarende Saha nedregulert ekspresjon av SIRT1, cyklin D1, Survivin, Bcl-2, VEGF og CDK6, og opp-regulert ekspresjon av p21 og Puma på en doseavhengig måte. Videre behandling av pankreas cscs med kromatin modifikatorer resulterte i inhibering av selvfornyelse, EMT, migrering og invasjon av pankreas cscs
in vitro
. Modulering av ekspresjonen av MIR-34a ved Saha hemmet mRNA-ekspresjon av forskjellige komponenter i Notch vei, således som tyder på at MIR-34a kan være involvert i pankreas CSC selvfornyelse. Zeb-en, Snail og Slug transkripsjonen uttrykk ble betydelig redusert i menneskelige bukspyttkjertelen cscs og bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved behandling med Saha. Våre resultater viser at MIR-34a kan spille en viktig rolle i reguleringen av bukspyttkjertelen tumorigenesis. Dette er så langt, den første demonstrasjonen av hemming av pankreas CSC kjennetegn ved epigenetisk modulering av MIR-34a ved terapeutisk intervensjon ved hjelp av 5-Aza-DC og Saha. Derfor vil restaurering av MIR-34a uttrykk med 5-Aza-DC og Saha i bukspyttkjertelen cscs gir ikke bare unike verktøy for undersøkelse av miRNA funksjon, men lover også reagent å øke pasientens respons på eksisterende chemotherapies eller som frittstående kreftmedisinen.
Resultatene
Expression og restaurering MIR-34a i bukspyttkjertelen cscs og cellelinjer
Vi først målt uttrykk av MIR-34a i menneskelige bukspyttkjertelen cscs avledet fra primære svulster og kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer [ASPC-1 (p53wt) og MiaPaCa-2 (p53mutant)] og sammenlignet med normale bukspyttkjertelen ductal epitelceller ved hjelp av kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR-Taqman) og av Taqman sanntids Assays. Den komparative Ct (ΔΔCt) metoden ble brukt for å bestemme uttrykket ganger endring av MIR-34a i kreft i bukspyttkjertelen celler i forhold til normal pancreatic epitelceller. Total RNA innspill ble normalisert basert på CT-verdiene oppnådd for RNU48 brukes som endogen kontroll. I samsvar med tidligere studier i bukspyttkjertelkreft [20], observerte vi en global nedgang i uttrykket av MIR-34a i bukspyttkjertelen cscs og cellelinjer uavhengig av deres p53 mutasjonsstatus i forhold til ikke-neoplastiske bukspyttkjertelen epitelceller (Fig. 1a).
(A) Relativ uttrykk for MIR-34a ble kvantifisert i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer ASPC-en (p53wt), MiaPACA-2 (p53mutant), menneskelige bukspyttkjertelen kreft stamceller (PanCSC) og human bukspyttkjertel normal ductal epitel celler (HPNE). (B) Restaurering av miR34a av Saha og Aza-5DC. Bukspyttkjertelkreft cellelinjer ASPC-en (p53wt), MiaPACA-2 (p53mutant) og kreft i bukspyttkjertelen stamceller ble behandlet med Saha (3 mm) eller Aza-5DC (4 mm) i 24 timer. Ekspresjonen av MIR-34a ble kvantifisert ved bruk av kvantitativ revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR-Taqman) og av Taqman sanntids Assays, og normalisert til RNU48 uttrykk. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C), hemmer anti-miR34a evne til Saha og Aza-5DC til å gjenopprette miR34a. Pankreas cscs ble transient transfektert med enten negativ kontroll (kryptert) eller anti-miR34a oligonukleotid, og behandlet med Saha (3 uM) eller Aza-5DC (4 uM) i 24 timer. RNA ble ekstrahert for å måle ekspresjonen av miR34a ved Q-RT-PCR, som beskrevet ovenfor. NC = negativ kontroll. (D), miR34a-luciferase reporter-aktivitet. Pankreas cscs ble transfektert med enten negativ kontroll (kryptert) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med miR34a-Luc konstruere, og behandlet med enten Saha (1 uM) eller Aza-5DC (2 uM) i 24 timer. Luciferase aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Mir-34a er nært forbundet med et stort CpG øy som tyder på at det kan være epigenetiske brakt til taushet i bukspyttkjertelkreft. For å bevise denne hypotesen, undersøkte vi om den reduserte ekspresjon av MIR-34a i kreft i bukspyttkjertelen kan gjenopprettes ved behandling med en DNA-metylering inhibitor, 5-Aza-dc og /eller en histondeacetylase-inhibitor, Saha. Interessant, MIR-34a-ekspresjon i bukspyttkjertelen cscs og bukspyttkjertelcancercellelinjer [ASPC-1 og MiaPaCa-2] økte signifikant etter behandling med disse kromatin-modifiserende midler, sammenlignet med mock behandlede kontroller, som målt ved QRT-PCR (fig. 1B) ved hjelp TaqMan real Time Analyser ved hjelp av sammenlignende Ct (ΔΔCt) -metoden. Total RNA innspill ble normalisert basert på CT-verdiene oppnådd for RNU48. Disse resultatene viser at 5-Aza-DC og Saha induserer restaurering av MIR-34a i kreft i bukspyttkjertelen celler. Dataene tyder også på at epigenetisk modifikasjon av regulatoriske sekvenser i CpG øyer og deacetylering av histoner kan bidra til Mir-34a stanse i bukspyttkjertelkreft. Videre hemming av MIR-34a ved antgomiR opphever virkningene av 5-Aza-DC og Saha i restaurering av uttrykket av MIR-34a i bukspyttkjertelen cscs tyder på at 5-Aza-DC og Saha regulere stamcelle karakteristiske gjennom MIR-34a ( fig. 1C).
Vi neste undersøkt transkripsjonsregulering av MIR-34a i cscs av MIR-34a-luciferase reporter analysen (fig. 1 D). Saha og 5-Aza-dC indusert MIR-34a-luciferase aktivitet, noe som tyder på en funksjonell rolle miR34a i bukspyttkjertelen cscs.
oppregulering av MIR-34a hemmer celledeling, og induserer apoptose og cellesyklus arrest i menneskelig bukspyttkjertelen cscs
Vi undersøkte effekten av 5-Aza-dC og Saha på spredning av pankreas cscs av trypanblått farging. 5-Aza-dC og Saha betydelig hemmet celleproliferasjon i en doseavhengig måte i pankreatiske cscs (Fig. 2A). Videre undersøkte vi effekten av disse kromatin modulatorer på induksjon av apoptose og caspase-3/7-aktivitet i pankreas cscs med henholdsvis annexin-V og PI flekker, og caspase-3/7-aktivitet assay kit,. 5-Aza-DC og Saha indusert apoptose i cscs i en doseavhengig måte som ble assosiert med økt caspase-3/7 aktivitet (Fig. 2B og C).
(A), bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med Saha (3 og 5 uM) og 5-Aza-dC (2 og 4 uM) og cellelevedyktighet ble målt ved 48 timer ved farging med trypanblått ved hjelp av Vi-cELL-analysator (Beckman Counter). (B), i bukspyttkjertelen cscs var ubehandlet (a) eller behandlet med Saha (b) eller 5Aza-dC (c) i 48 timer, og apoptose ble målt ved farging med annexin-PI ved hjelp av Accuri Flowcytometer. (C), Caspase-3/7-aktivitet ble målt i pankreas cscs behandlet med Saha (0,5 og 2 uM) eller 5-aza-dC (1 og 3 uM) i 24 timer. Data representerer middelverdi ± SD. * Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
For bedre å forstå den biologiske betydningen av restaureringen av MIR-34a, ASPC-1 celler ble behandlet med eller uten Saha og dens virkninger på cellesyklusfordeling ble undersøkt ved farging PI hjelp av strømningscytometri (data ikke vist). Saha indusert veksthemming i i G2 /M-fasen av cellesyklusen ved 24 timer i ASPC-1-celler. Videre ble Saha indusert G2 /M arrest opphevet i nærvær av MIR-34a antagonist i forhold til de negative kontroll oligonukleotider dermed antyder involvering av MIR-34a i cellesyklus arrest etter Saha (data ikke vist).
Effekt av 5-Aza-dC og Saha på de antatte målene i MIR-34a i bukspyttkjertelen cscs
Siden Mir-34a er involvert i selv fornye kapasitet og metastasering av bukspyttkjertelen cscs, uttrykk for antatte målene for MIR-34a i bukspyttkjertelen cscs om behandling med 5-Aza-dC og Saha ble undersøkt med Western blot analyse (fig. 3A og B). Våre resultater tyder på at 5-Aza-DC og Saha modulere protein uttrykk nivåer av kjente direkte målgener av MIR-34a. Interessant, Saha hemmet ekspresjon av Cyclin D1 og CDK6 og opp regulert ekspresjon av p21 /CIP1 i pankreas cscs (fig. 3A). Saha også hemmet ekspresjon av SIRT1, Survivin, Bcl-2, VEGF, og induserte ekspresjon av acetylert p53 og Puma på en doseavhengig måte. Tilsvarende 5-Aza-dC hemmet ekspresjon av Notch3, CDK6, Survivin og Bcl-2, og induserte ekspresjon av P21 /CIP1 og Puma på en doseavhengig måte. Siden Saha hemmet uttrykk for SIRT1 gjennom oppregulering av miR34a, vi neste undersøkte effekten av Saha på SIRT1 3’UTR-luciferase reporter aktivitet. Saha inhiberte SIRT1 3’UTR-Luciferase-aktivitet på en doseavhengig måte (fig. 3C). Til sammenligning Saha hadde ingen effekt på SIRT1 mutant 3’UTR-luciferase-aktivitet (som ikke inneholder noen funksjonell miR34a bindingssetet). Disse data tyder på at MiR-34a hemmer SIRT1 uttrykk gjennom en MIR-34a-bindingssetet i 3 «UTR av SIRT1.
(A), bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med eller uten Saha i 48 timer. Ekspresjonen av acetylert-p53, p21, Puma, SIRT1, CDK6, CyclinD1, Survivin og Bcl-2 ble målt ved hjelp av Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med eller uten 5Aza-DC i 48 timer. Ekspresjonen av p21, Puma, Notch 3, CDK6, Survivin og Bcl-2 ble målt ved hjelp av Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C), SIRT1 3’UTR-Luciferase-aktivitet. Bukspyttkjertelen cscs ble omformet med enten SIRT1 3’UTR-Luc konstruere eller SIRT1 mutant 3’UTR-Luc konstruere, og behandlet med Saha (0-3 mm) i 24 timer. Luciferase aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Data representerer middelverdi ± SD. *, # Eller% = signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Videre manipulere uttrykket av MIR-34a ved hjelp MIR-34a antagomiR endret protein uttrykk for sine målgener (Fig. 4A og B). 5-Aza-DC og Saha hemmer uttrykk av cellesyklusregulerende proteiner (cyclin D1 og CDK2) og VEGF, og opp regulerer uttrykket av p27 /KIP1 i bukspyttkjertelen cscs. Transfeksjon med antagomiR for MIR-34a var alene tilstrekkelig til å oppheve denne effekten. Disse dataene antyder en viktig og ny mekanisme som 5-Aza-DC og Saha formidle deres effekter på cellevekst og apoptose i bukspyttkjertelen cscs.
(A), bukspyttkjertelen cscs ble transient transfektert med enten negativ kontroll (egge ) eller anti-miR34a oligonukleotid og behandlet med Aza-5DC (4 uM) i 48 timer. Western blot-analyse ble utført for å måle ekspresjonen av cyclin D1, CDK2, p27 og VEGF. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B), ble Pankreas cscs transient transfektert med enten negativ kontroll (kryptert) eller anti-miR34a oligonukleotid og behandlet med Saha (3 uM) i 48 timer. Western blot-analyse ble utført for å måle ekspresjonen av cyclin D1, CDK2, p27 og VEGF. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C), Regulering av VEGF-B 3’UTR-Luciferase aktivitet ved Aza-5DC. Pankreas cscs ble transfektert med enten negativ kontroll (kryptert) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med VEGF-B 3’UTR-LUC konstruere, og behandlet med Aza-5DC (0-3 uM) i 24 timer. Luciferase aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Data representerer middelverdi ± SD. *, @ Eller # = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (D), Regulering av VEGF-B 3’UTR-Luciferase aktivitet. Pankreas cscs ble transfektert med enten negativ kontroll (kryptert) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med VEGF-B 3’UTR-LUC konstruere, og behandlet med Saha (0-3 uM) i 24 timer. Luciferase aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Data representerer middelverdi ± SD. *, @, # = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Siden 5-Aza-dC hemmet uttrykket av VEGF gjennom oppregulering av miR34a, vi neste undersøkte effekten av 5- aza-dC på VEGF-B 3’UTR-luciferase reporter aktivitet (fig. 4C). 5-Aza-dC inhiberte VEGF-B 3’UTR-luciferase reporter-aktivitet på en doseavhengig måte. Til sammenligning, anti-miR34a blokkerte de inhiberende virkninger av 5-Aza-dC på luciferase-aktivitet. Siden Saha hemmet uttrykket av VEGF gjennom oppregulering av miR34a, vi også undersøkt effekten av Saha på VEGF-B 3’UTR-luciferase reporter aktivitet. Som vist i fig. 4D, Saha inhiberte VEGF-B 3’UTR-Luciferase-aktivitet på en doseavhengig måte. Til sammenligning, anti-miR34a blokkerte de inhiberende virkninger av Saha på luciferase-aktivitet. Disse data tyder på at oppregulering av MIR-34a med 5-Aza-DC og Saha kan ha funksjonell betydning om reguleringen av Notch og selvfornyelse.
Effekt av MIR-34a restaurering på uttrykk for stamcelle fornyelses gener
Notch signalering har vist seg å spille en rolle i stammen cellefornyelse og celle skjebne besluttsomhet i nevrale, blodkreft og embryonale stamceller [38]. Jagged en uttrykk på stamceller induserer selvfornyelse av stamceller grunn til Notch signale aktivering [39]. Notch reseptorer, ligander samt nedstrøms mål har blitt identifisert til å være oppregulert i preneoplastiske lesjoner til invasive bukspyttkjertel kreft i mennesker og mus, noe som tyder på at Notch signale kan være et tidlig hendelse som fører til opphopning av udifferensierte forløper celler i bukspyttkjertelen. Vi viser at re-håndheves uttrykk for MIR-34a i bukspyttkjertelen cscs ved behandling med Saha, fører til en hemming i mRNA uttrykk av alle komponenter i Notch vei, Notch reseptor Notch1, Notch 3 og dens ligand Jagged1 og nedstrøms Notch target gen Hes1 ekspresjon (fig. 5A). Nedregulering av Notch kan dermed bidra til hemming av stamcelle fornyelse og invasiv kapasitet på pancreatic cscs.
(A), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med Saha (1 og 3 mm) i 24 timer, og uttrykk for Notch1, JAGGED1, NOTCH3 og HES1 ble målt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * Eller $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), RBP-Jκ reporter aktivitet. Pankreas cscs ble transfektert med enten negativ kontroll (kryptert) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med RBP-Jκ-LUC konstruere, og behandlet med Saha (0-3 uM) i 24 timer. Luciferase aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Data representerer middelverdi ± SD. *, # Eller @ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Siden Saha hemmet uttrykket av flere komponenter i Notch vei, vi neste målte RBP-Jκ reporter aktivitet ved luciferase assay ( fig. 5B). Saha inhiberte RBP-Jκ-Luciferase-aktivitet på en doseavhengig måte. Til sammenligning, anti-miR34a blokkerte de inhiberende virkninger av Saha på RBP-Jκ-luciferase-aktivitet. Disse data tyder på at oppregulering av MIR-34a av Saha kan ha funksjonell betydning om regulering av VEGF.
Effekt av MIR-34a restaurering på epitelial-mesenchymale overgang fra bukspyttkjertelen cscs
EMT induksjon i kreftceller resulterer i kjøp av invasive og metastatiske egenskaper [40]. Vi undersøkte derfor rollen som MIR-34a restaurering i EMT regulering i bukspyttkjertelen cscs. Zeb-1 er en avgjørende EMT aktivator og undertrykker ekspresjon av basalmembrankomponenter og celle polaritet faktorer derved fremmer metastase av tumorceller. Zeb-1 transkripsjon ble betydelig inhibert i bukspyttkjertelen cscs og cancercellelinjer ved behandling med Saha (fig. 6A og B). Vi neste undersøkte effekten av Saha på uttrykk for andre EMT transkripsjon faktorer sneglen og Slug i bukspyttkjertelen cscs. Til sammen Saha resulterte i hemming av sneglen, Slug og Zeb1 transkripsjon (Fig. 6B), og dermed tyder på en rolle MIR-34a i reversering av EMT overgang i bukspyttkjertelen cscs. Interessant, 5-Aza-dC også hemmet transkripsjonen av Slug (data ikke vist), noe som muligens spiller en rolle ved inhibering av invasjon.
(A), kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer [ASPC-1 (p53wt ) og MiaPACA-2 (p53mutant)] og pankreatiske cscs ble behandlet med Saha (1 uM) i 24 timer, og ekspresjon av Zeb1 ble målt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med Saha (1 mm) i 24 timer og uttrykk for sneglen, Slug og Zeb1 ble målt ved QRT-PCR. HK-GAPD ble anvendt som endogene normaliseringskontroll. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C), Regulering av Zeb-en 3’UTR reporter aktivitet. Pankreas cscs ble transfektert med enten negativ kontroll (kryptert) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med Zeb1 3’UTR-Luciferase-konstruksjon, og behandlet med Saha (0-3 uM) i 24 timer. Luciferase aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Promega). Data representerer middelverdi ± SD. *, #,% = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (D), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med Saha (1 uM) eller 5-aza-dC (2 uM) i 24 timer og ekspresjon av E-cadherin og N-cadherin ble målt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Siden Saha hemmet uttrykk for Zeb-en via oppregulering av miR34a, vi også undersøkt effekten av Saha på Zeb1 3’UTR-luciferase reporter aktivitet. Som vist i fig. 6C, Saha hemmet Zeb-1 3’UTR-Luciferase-aktivitet på en doseavhengig måte. Til sammenligning, anti-miR34a blokkerte de inhiberende virkninger av Saha på Zeb-1 3’UTR-Luciferase-aktivitet. Disse data tyder på at oppregulering av MIR-34a av Saha kan ha funksjonell betydning på EMT regulering ved å hemme Zeb-en.
cadherin switch har vist seg å oppstå under EMT regulering. Behandling av pankreas cscs med Saha og 5-Aza-dC alene indusert ekspresjon av E-cadherin og hemmet uttrykk for N-cadherin, og dermed viser at MIR-34a er en sterk induser av en epitelial fenotype (Fig. 6D).
5-Aza-dC og Saha hemme migrasjon, kolonidannelse, invasjon og spheroid formasjon
for ytterligere å forstå effekten av oppregulering av MIR-34a uttrykk på invasiv potensialet i bukspyttkjertelen cscs, vi neste undersøkt effekten av 5-Aza-dC og Saha på pancreatic cscs bruker scratch migrasjon, myk agar-kolonidannelse, og transwell Boyden kammer invasjon analyser. Representative mikrofotografier av cellene som invaderer gjennom grunnen generert for kontroll og 5-Aza-dC og Saha behandlet pancreatic cscs viste signifikant mindre migrering i den behandlede gruppe panel sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 7A).
(A ) Mikrofotografier som viser resultatene av in vitro migrering av bukspyttkjertelen cscs ved hjelp av enkel skrapeteknikk. Pankreas cscs ble dyrket i monolayer, riper og behandlet med Saha og 5-Aza-dC i 24 timer. (B), Saha og 5-Aza-dC inhibere kolonidannelse av cscs. Pankreas cscs ble sådd i myk agar og behandlet med Saha (1 og 3 uM) eller 5-aza-dC (2 og 4 uM) i 21 dager. Ved slutten av inkubasjonstiden ble kolonier tellet. Data representerer middelverdi ± SD. * Og $ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C), cscs ble platet ut på Matrigel-belagte membran i det øvre kammer av transwell og behandlet med Saha (1 og 3 uM) eller 5-aza-dC (2 og 4 uM) i 48 timer. Celler invaderte til det nedre kammer ble fiksert med metanol, farget og fotografert. (D), ble bukspyttkjertelen cscs sådd i suspensjon, og ble behandlet med Saha (1 og 3 uM) eller Aza-5DC (2 og 4 uM) i 7 dager. Bilder av sfæroider som dannes i suspensjon ble tatt av et mikroskop
. 5-Aza-dC og Saha redusert evne til bukspyttkjertelen cscs å danne soft agar kolonier sammenlignet med kontrollen (Fig. 7B) og transfeksjon med anti-MIR-34a oppheves virkningen av 5-Aza-dC og Saha på kolonidannelse (data ikke vist). Invasjon av bukspyttkjertelen cscs gjennom matrigel belagte membranen viste at antallet av invaderende celler ble signifikant hemmet i 5-Aza-dC og Saha behandlede celler og var omtrent 75% mindre enn det antall celler invaderende i kontrollgruppen (fig. 7C) . Videre er 5-Aza-dC og Saha inhiberte den sfæroide formasjonen i bukspyttkjertelen cscs som vist på fig. 7D. Disse resultatene viser at Mir-34a kan spille en viktig rolle i reguleringen av bukspyttkjertel tumorigenesis ved å hemme selvfornyelse kapasitet på bukspyttkjertelen cscs, metastaser og invasjon.
Diskusjon
microRNAs (miRNAs) er små ikke-kodende RNA som regulerer ekspresjon av andre gener av transkripsjonen inhibering eller undertrykkelse translasjonell. Samle bevis antyder en rolle for microRNAs i menneskelig kreft som nye typer kreftdempere eller onkogener [41], [42]. Nylig ble MIR-34a familiemedlemmer funnet å være direkte regulert av TP53, og den funksjonelle aktiviteten til mir-34a antydet en mulig rolle som en tumor suppressor. Vi viser i denne studien som MIR-34a-ekspresjon nedregulert i humane pankreatiske cscs og pankreatiske tumorcellelinjer utvunnet, uavhengig av p53-mutasjonsstatus.
