Abstract
Serous ovarialcancer (EOC) pasienter ofte bukke under for aggressiv metastatisk sykdom, men lite er kjent om atferd og genetikk på eggstokkreft metastasering. Her har vi som mål å forstå hvordan oment metastaser avvike fra primærsvulster og hvordan disse forskjellene kan påvirke kjemoterapi. Vi analyserte miRNA uttrykket profiler av primær EOC svulster og deres respektive omentfaktorene metastaser fra 9 pasienter som bruker miRNA Taqman qPCR arrays. Vi finner 17 mirnas med differensial uttrykk i omentfaktorene lesjoner i forhold til primære svulster. MIR-21, MIR-150, og MIR-146a har lav uttrykk i de fleste primære svulster med betydelig økt uttrykk i omentfaktorene lesjoner, med samtidig redusert uttrykk av predikerte mRNA mål basert på mRNA uttrykk. Vi finner at MIR-150 og MIR-146a megle spheroid størrelse. Både MIR-146a og MIR-150 øke antall gjenværende overlevende celler med 2-4 ganger når utfordret med dødelige cisplatin konsentrasjoner. Disse observasjoner tyder på at i det minste to av de mirnas, MIR-146a og MIR-150, oppregulert i omentfaktorene lesjoner, stimulere overlevelsen og øke medikamenttoleranse. Våre observasjoner tyder på at kreftceller i omentfaktorene svulster uttrykke viktige mirnas annerledes enn primære svulster, og at i det minste noen av disse microRNAs kan være kritiske regulatorer av fremveksten av resistente sykdoms
Citation. Vang S, Wu HT , Fischer A, Miller DH, MacLaughlan S, Douglass E, et al. (2013) Identifisering av Ovarian Cancer Metastatisk miRNAs. PLoS ONE 8 (3): e58226. doi: 10,1371 /journal.pone.0058226
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 21 september 2012; Godkjent: 31 januar 2013; Publisert: 12 mars 2013
Copyright: © 2013 Vang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Brown University Senter for Computational Molecular Biology, Seed pris fra Brown University National center of Excellence i kvinners helse, og National Institutes of Health /National center for Forskning Resources gi 5P41RR001395. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Serous ovarialcancer (EOC) er en aggressiv sykdom som det finnes få effektive biomarkører og terapier. EOC blir ofte påvist etter at tumorcellene har spredt inne i bukhulen [1]. Til tross for at metastaser står for mesteparten av sykdomsrelaterte dødsfall, forblir eggstokkreft metastaser dårlig forstått [1].
Hensikten med denne studien var å identifisere funksjoner som kan være viktig å etablere metastaser og for å fastslå hvordan disse faktorene kan påvirke kjemoterapi svar. Avansert metastatisk sykdom er fortsatt en krevende utfordring å behandle, som oftest fører til tilbakevendende, medikamentresistente svulster. Metastaser kan være anriket for en distinkt mutasjons spektrum i forhold til primære tumorer [2], [3], [4]. Sammenligning av primære og metastatiske svulster har generert viktig innsikt i sykdomsutviklingen i både dyremodeller [5] og hos pasienter [2]. For å forbedre behandlingen av metastatisk sykdom, er det viktig å forstå gener og stier dukker opp i metastaser som ikke kan være til stede i primære svulster. Selv om metastatisk potensial kan forutsies basert på primærtumor [6], [7], er denne observasjonen ikke gjensidig utelukkende med muligheten for at viktige funksjoner dukke opp i metastaser som ikke er observert i primære svulster. For eksempel kan den nye mikro indusere betydelige fenotypiske endringer i kreftceller, inkludert endringer i metabolsk aktivitet i omentum [8], og økt resistens [9].
Tidligere mRNA uttrykk studier som undersøker matchet eggstokkreft primære og metastatiske svulster fra samme pasient, støtter en primærtumor predisposisjon «modell [6], [10], [11], [12]. mRNA-ekspresjon data ved hjelp av tidlig generasjon mikromatriser antyder at det er få signifikante uttrykk forskjeller mellom omentfaktorene lesjoner og primære tumorer [13], [14], [15], men har en rekke studier beskrevet differensial ekspresjon av viktige regulatoriske forhold mellom primære tumorer og metastaser, inkludert E-cadherin [16], MMP [17], [18] og inte [19]. For å møte denne tilsynelatende avviket og for å få ny innsikt i tilstanden av kreftceller i metastaser, profilert vi miRNA uttrykket i matchet par av primær serøs epitelovarialcancer (EOC) svulster og oment lesjoner. miRNA uttrykket profilering identifiserer MIR-150 og MIR-146a å være oppregulert i omentfaktorene metastaser. Vi finner at MIR-150 og MIR-146a fremme spheroid dannelse og øke brøkdel av gjenværende overlevende celler etter cisplatin eksponering. Disse observasjonene tyder på at høyere uttrykk av MIR-146a og MIR-150 i omentfaktorene lesjoner kan føre til mer aggressive, kjemoresistent sykdom.
Resultater
Vi identifiserte 9 Stage IIIC serøs epitelial eggstokkreft pasienter med par av primære og oment metastatiske vevsprøver (figur S1, Tabell S1). Alle pasientene var post-menopausale (mer enn 55 år gammel på diagnosetidspunktet) og hadde metastatisk sykdom i omentum. Vi målte miRNA uttrykket med Taqman qPCR array-kort i de 9 par av svulster. Hver svulst hadde 70% kreftceller, og god RNA kvalitet (Agilent Bioanalyzer RIN 5). Vårt fokus er å forstå endringene manifesterer seg i løpet av sykdomsutviklingen, og derfor har vi fokusert på å sammenligne metastaser til de primære svulster og ikke vurdere normal eggstokk epitelceller.
Identifikasjon av miRNAs forskjellig uttrykt mellom primære og metastatiske svulster
Vi målte 377 mirnas hjelp ABI Taqman qPCR arrays, spesifikk for modne mirnas [20], i 9 matchet primære og metastatiske humane tumorer. 180 mirnas er uttrykt, i det minste i to tumorer, med ingen global opp- eller nedregulering av disse mirnas mellom den primære og metastatiske tumorer. Figur 1A oppsummerer mirnas med store engangs uttrykk forskjeller som er identifisert av en paret t-test (figur S2). Vi testet uttrykket av MIR-146a og MIR-150 i analyser rettet mot nettopp disse mirnas i to par av pasienter for å bekrefte at TAQMAN analysene er spesifikke for disse mirnas uten krysstale fra de andre 376-analyser (Figur S3).
A. miRNA uttrykket profilering av Taqman qPCR arrays identifiserer 17 mirnas forskjellig uttrykt mellom 9 par av primære svulster og oment lesjoner. mirnas med p 0,05 (paret t-test) ble valgt. Ekspresjonsnivået er presentert som gjennomsnittlig +/- standardfeil for gjennomsnittet (s.e.m.) av folden ved hjelp av endringen A C
t metode i forhold til U6 snRNA. Rødt, lavere uttrykk i metastaser, blå, høyere uttrykk i metastaser. B. Venstre, unsupervised hierarkisk clustering av fold endringer av de analyserte pasienter. Høyre, foreningen tomt analyse av miRNA uttrykk identifiserer miRNA klynger angitt i rødt. Clustering ble utført i Gene-E] 50].
hierarkisk clustering av ganger endring mellom primære og metastatiske svulster for de 17 mirnas viser tre forskjellige grupper (Figur 1b). Pasientene ble gruppert med lignende fold endringer i miRNA uttrykket (figur 1B, venstre panel). Tydelig miRNA grupper er lettere visualisert når mirnas er gruppert uavhengig av pasientene (figur 1B, panel til høyre). Fordi MIR-146a, MIR-21 og MIR-150 er representative for de tre store oppregulert klynger, besluttet vi å fokusere vår innsats for å forstå deres mulige funksjoner i eggstokkreft. Vi fant at uttrykket av MIR-21, MIR-146a, MIR-150 er negativt korrelert med sine spådd mRNA mål (figur S4), noe som tyder på at disse mirnas aktivt undertrykke mRNA uttrykk i metastaser i forhold til primære svulster. Vi valgte å fokusere på MIR-146a og MIR-150 fordi disse to mirnas ikke tidligere har vært undersøkt i eggstokkreft til vår kunnskap.
For å avgjøre om uttrykket endrer stammer fra kreftceller eller stroma, ved hjelp av en ortogonal analysen, vi utførte
in situ
hybridisering (ISH). MIR-21 uttrykkes i både kreft og stromaceller, og oppregulert i omentfaktorene lesjoner, i samsvar med den Taqman qPCR skjermen (figur 2A). Ved ISH, ser vi at de absolutte uttrykk nivåer er variabel, men alle 8 omentfaktorene lesjoner testet viser økt MIR-21 kreftcelle uttrykk i forhold til tilsvarende primærtumor (figur 2 og figur S5). I våre hender, er ISH følsomhet dårlig og avhenger av kvaliteten av sonden, og vi var i stand til å oppnå pålitelig signal for andre mirnas, selv etter grundig undersøkelse av viktige variabler, inkludert hybridisering temperatur, proteinase K konsentrasjon, og sonde konsentrasjon. Disse observasjonene tyder på at Mir-21 stammer fra både kreft og stromaceller, og at MIR-21 expression økninger i omentfaktorene metastaser i kreftceller.
Å.
In situ
hybridisering av MIR-21. Kreftceller er farget rød av Nuclear Red. Høyere ekspresjon i omentfaktorene metastaser er observert i hvert tilfelle, selv med både forholdsvis høy og lav MIR-21 ekspresjon i den primære tumor. Pilene viser områder av MIR-21 uttrykk co-lokalisere med Nuclear Red farging. B. Laser Capture mikrodisseksjon (LCM) på to tilfeller avslører mirnas sannsynlig uttrykt i kreftceller. Varmen Kartet viser ganger endring for de 17 mirnas identifisert i bulk svulst skjermen. Lignende mønstre av differensial uttrykk observeres for mirnas uttrykt i kreftceller som observert i bulk svulst. Svart indikerer at miRNA var ikke påvises i LCM isolerte kreftceller
For å kunne føre en mer global analyse, vi beriket for kreftceller ved Laser Capture mikrodisseksjon (LCM) på H . E farget kreftceller, og utført Taqman qPCR arrays fra to tilfeller. 11 av de 17 mirnas, identifisert i bulktumor skjermen (figur 1A), er uttrykt i LCM anriket kreftceller, og den differensielle ekspresjonen mellom primærsvulster og oment lesjoner er kvalitativt den samme (figur 2B, Figur S6). Disse observasjonene tyder på at den observerte endringen i uttrykket sannsynlig stammer i kreftceller for disse 11 mirnas (figur 2B). mirnas ikke uttrykt i kreftceller, men med store uttrykk endringer i bulk tumor, slik som MIR-124 og MIR-370, kan indikere tilstedeværelse av spesifikke typer av stromaceller slik som fibroblaster eller immunceller. Vi ble først fascinert av MIR-509-3-5p, MIR-508-3p, og MIR-508-5p som disse var de eneste mirnas nedregulert i metastaser i bulk tumormålinger. Imidlertid er disse tre mirnas ikke uttrykt i LCM anriket cancercellepopulasjoner (figur 2B), og er ikke vesentlig uttrykt i de testede ovarie cancer-cellelinjer (figur S7), og således ble ikke betraktet videre.
selv om LCM valgt kreftceller er ikke 100% kreftceller, disse observasjonene sterkt at MIR-146a og MIR-150 er sannsynlig uttrykt i kreftceller og at deres uttrykk er oppregulert i omentfaktorene metastaser. Viktigere, finner vi uttrykk for disse miRNAs i H E farget, LCM beriket kreftceller i både primære og metastatiske svulster, i samsvar med deres sannsynlige uttrykk i kreftceller. TCGA har funnet ut at MIR-150 og MIR-146a uttrykkes på lave nivåer i de fleste primære svulster [21], i samsvar med våre observasjoner.
MIR-150 og MIR-146a fremme spheroid dannelsen
Taqman qPCR arrays viste at åtte av de 17 metastatiske mirnas (Figur 1a) er uttrykt i prolifererende ovčar-8 og Skov-3 celler (Figur S7) og i kreftceller i humane tumorer (figur 2B). MIR-146a uttrykkes ved relativt lave nivåer og MIR-150 er ikke signifikant uttrykt som det ble bare påvist over anbefalt C
t terskler i prolifererende ovarian kreft cellelinjer som ble testet.
Vi antok at mirnas oppregulert i omentfaktorene lesjoner vil stimulere vekst som en del av deres evne til å fremme aggressiv sykdom. Vi testet mirnas uttrykt i kreftceller i tumorer (figur 2B) som også beskjedent uttrykk i eggstokkreft cellelinjer for å unngå over-uttrykke mirnas ved suprafysiologiske konsentrasjoner inkludert MIR-150, MIR-146a, MIR-708, og MIR -193a-5p. For å modellere høyere miRNA uttrykket observert i omentfaktorene lesjoner, vi ectopically uttrykt syntetisk pre-Mirs og utført gevinst på funksjonsskjermer i celle levedyktighet og cisplatin følsomhetsanalyser. Transfeksjon av pre-Mirs føre til høy overekspresjon av MIR-146a (figur S8, mens MIR-150 er beskjedent uttrykt i forhold til U6 snRNA (A C
t ~3). Ektopisk uttrykk for MIR-150 beskjedent økt antallet levedyktige celler i SKOV-3 og IGROV-1 over fire dager, men ikke i OVCAR-8 celler (figur 3). Ingen av de andre forhånds Mirs induserte signifikante, reproduserbare virkning på vekst i mer enn en cellelinje.
24 timer etter transfeksjon med 50 nM pre-Mirs, ble cellene sådd ut i 96-brønners plater og dyrket i 4 dager. Levedyktige celler ble bestemt ved Wst-en normalisert til celler transfektert med negativ kontroll pre-Mirs. Feilstolper (sem) representerer indendent biologiske triplicates Hver replikere consistes av som består av tre brønner i en 96-brønners plate **, p .. 0.01, *, p 0,05 ved t-test
Spheroids modell flercellede aggregater. i ascites av eggstokkreft pasienter som etablerer metastaser [22]. spheroids er en mer nøyaktig representasjon av svulster og økende bevis tyder på at narkotika svar er bedre modellert i kuler enn i enlagskultur [23], [24], [25], [26]. Sfæroid formasjon krever vanligvis et minimum antall celler, etterfulgt av spontan aggregering, overlevelse i henhold forankringsuavhengig betingelser, og kompaktering for å forsterke overlevelsen av den samlede [27]. For å evaluere miRNA funksjon i kulene, danner vi enhetlige kuler etter såing celler i agarose micromolds [28]. Interessant, alle uttrykt mirnas er oppregulert i 3D-kuler i forhold til monolaget ved hjelp av et Taqman array-kort (figur S4). Vi testet MIR-146a og MIR-21 ekspresjon av Taqman qPCR, ved anvendelse av primere målrettet mot bare disse to mirnas, og reproduserbart observere oppregulering av disse to mirnas i kulene (figur 4A). For å teste om oppregulering av MIR-146a er viktig for spheroid formasjon, hemmet vi MIR-146a med en Stengte Nucleic Acid (LNA) hemmer. MIR-146a inhibering fører til amorfe, mer løst dannet kuler i begge SKOV-3 og OVCAR-8 celler etter to dager (figur 4B), sammenlignet med de mer kompakte kuler som dannes i de negative kontrollene. Effekten er mer dramatisk i Skov-3 enn ovčar-8. På grunn av den amorfe natur av disse tidlige danner dag 2 kuler, kunne vi ikke sikkert fastslå deres størrelser. Denne observasjonen tyder på at tidlig spheroid formasjonen er påvirket av en reduksjon av MIR-146a aktivitet. Etter 4 dager, da kontroll kulene har mer fullstendig dannet etter under komprimering, hemming av MIR-146a med en LNA inhibitor reduserer spheroid størrelse, sammenlignet med en negativ kontroll LNA, i Skov-3, men bare beskjedent i OVCAR-8 (Figur 4C ). 45 kuler ble målt i hvert replikat, og tre uavhengige replikater ble utført. Størrelsen på hver sfæroide ble bestemt ved ImageJ og størrelsesfordelingen av sfæroidene er representert med boks plott (figur 4C og 4D). Sfæroid formasjon kan være utfordrende på grunn av små forskjeller i antallet celler som anvendes i frø hver sfæroide. Med agarose muggsopp, vurderer vi et stort antall kuler for å overvinne bekymringene med feil i celle nummer som brukes til frø kulene i hver brønn som åpner for ulike miRNA avhengige forskjeller holdes.
24 timer etter transfeksjon med anti- MIR LNA hemmere eller pre-Mir etterligner som indikert, 700 /mikroliter Skov-3 eller 600 /mikroliter OVCAR-8 celler ble sådd i 35 godt agarose micromolds med en celleklump dannes i hver brønn. A. MIR-21 og MIR-146a er oppregulert i fire dagers Skov-3 og ovčar-8 kuler oppdages ved hjelp av Taqman qPCR array-kortene i to paralleller. Feil barer er standardavvik B. Hemming av MIR-146a med 10 nm LNA forsinkelser spheroid dannelse og fører til mer amorfe og løsere dannet kuler i Skov-3 og OVCAR-8 etter 2 dager. Red bar er 400 mikrometer. C. Box og whisker plott viser at hemming av MIR-146a med LNAs reduserer spheroid størrelse etter 4 dager i Skov-3, og beskjedent i OVCAR-8. Representant uttrykk vist fra fire gjentak. D. Ektopisk uttrykk for MIR-150 og MIR-146a øker betydelig spheroid dannelse etter 4 dager. Skov-3 og OVCAR-8 celler ble transfektert med 50 nM av pre-MIR MIR-150 og MIR-146a pre-Mirs før spheroid formasjon. SKOV-3 eller OVCAR-8-celler ble transfektert som angitt. Representative kuler vises. Red bar er 400 mikrometer. Box og whisker plott av størrelsesfordelingen av 45 kuler fra et representativt eksperiment. Forsøket ble gjengitt tre ganger. P-verdier bestemt av t-test.
I tråd med økt uttrykk av miRNAs i kulene blir kritisk for spheroid formasjon, høyere MIR-150 og MIR-146a uttrykk fremme større kuler i Skov-3 og OVCAR-8 (figur 4D). Innføring av MIR-150 og MIR-146a viser de mest konsekvente og største utslagene på kuler i forhold til den negative kontrollen og de andre pre-Mirs testet. For MIR-146a, ser vi mindre kuler når MIR-146a er hemmet (figur 4C) og større kuler ved ektopisk uttrykk (figur 4D) etter 4 dager med spheroid formasjon. Sammen utgjør disse observasjonene støtter MIR-146a fremme spheroid formasjon.
MIR-150 og MIR-146a økning cisplatin toleranse
Når metastaser er etablert, er eggstokkreft svært vanskelig å behandle som tilbakevendende motstandsdyktig svulster ofte dukke opp etter innledende kjemoterapi. Endringer i miRNA uttrykket kan tyde på en annen fysiologisk tilstand for kreftcellene i metastasene som påvirker hvordan disse lesjonene vil svare på kjemoterapi. Vi testet effekten av økt uttrykk av fire miRNAs, oppregulert i omentfaktorene lesjoner, på cisplatin følsomhet. Doseavhengige studier med Wst-1-analyser viser at høyere uttrykk av MIR-150 beskjedent øker cisplatin IC
50 i Skov-3, men ikke ovčar-8 og IGROV-en (figur 5A). Andre mirnas, slik som MIR-146a, påvirkes enten SKOV-3 eller IGROV-1, men ikke begge deler på en statistisk signifikant måte.
A. Behandling av celler med pre-Mir-150 etterligne øker beskjedent den cisplatin IC50 i Skov-3 og IGROV-en, men ikke ovčar-8 celler. WST-1-analyser ble utført 48 timer etter behandling med cisplatin. Grafen viser gjennomsnittlig 3 biologiske replikat. Feilfelt representerer standardavvik B. Skjematisk av cisplatin overlevelse analyse. Celler blir behandlet to ganger med høye konsentrasjoner av cisplatin som fører til overlevelse ved omtrent 1% av cellene. C. MIR-150 og MIR-146a er oppregulert i overlevende celler etter 6 dager med 50 uM cisplatin i SKOV-3 og 7 dager av 30 uM cisplatin i OVCAR-8 celler sammenlignet med ubehandlede, prolifererende celler. Dataene er i dupliserte og feilfelt er standardavvik Flippen endring for MIR-150 er svært stor fordi MIR-150 ikke kunne påvises i voksende celler. C
t ble satt til maksimalt syklus testet, 40, for å estimere ganger endring. D. Inhibering av MIR-146a med 10 nM LNA-inhibitor reduserer antallet av gjenværende celler i SKOV-3 og beskjedent reduserer de overlevende cellene i OVCAR-8 etter 6 dager med 50 uM cisplatin i SKOV-3 og 7 dager av 30 pM cisplatin i OVCAR-8 celler. De overlevende levedyktige celler ble bestemt ved trypan blå eksklusjon assay. Biologiske tredoble eksperimenter er vist. Feil barer er standardavvik E. Transfeksjon av 50 nM pre-MIR-146a og pre-MIR-150 øker langsiktig overlevelse etter 6 dager med 50 M cisplatin i Skov-3 og 7 dager med 30 mikrometer cisplatin i OVCAR-8 celler.
Nøye undersøkelse av cellene i monolagskultur under cisplatinbehandling antydet at sunnere celler overlevde med høyere ekspresjon MIR-146a og MIR-150 i høye konsentrasjoner cisplatin. Det dynamiske området for gjenværende celler er under påvisningsgrensen for den Wst-1-assay. Nyere studier har identifisert reversible narkotika tolerante hvilende celler som overlever dødelige konsentrasjoner av legemidler [29]. Dermed undersøkelse av overlevende celler representerer en alternativ modell for å undersøke hvordan kreftcellene overlever kjemoterapi. For å teste om de metastatiske mirnas fremme overlevelse i dødelige doser av cisplatin, undersøkte vi miRNA uttrykket i overlevende gjenværende cellene i enlagskultur utsatt for dødelige doser av cisplatin i 6-7 dager. Vi finner at MIR-150 og MIR-146a er betydelig oppregulert i overlevende celler i forhold til prolifererende populasjonen (figur 5C). MIR-150 ikke påvises i OVCAR-8 celler og under den anbefalte ABI terskel i SKOV-3-celler (C
t~36 sykluser) i voksende celler, men blir vesentlig uttrykt i gjenværende overlevende celler i begge cellelinjer, noe som tyder mulige rolle i overlevende cisplatin. For å teste om MIR-146a påvirker evnen av eggstokkreft celler for å overleve langvarig cisplatin behandling, inhibering av MIR-146a med LNAs reduserer antallet levedyktige overlevende gjenværende celler beskjedent i OVCAR-8, og mer betydelig i SKOV-3-celler (figur 5D). I samsvar med deres økte uttrykk i overlevende celler, finner vi at høyere uttrykk av MIR-150 eller MIR-146a øker antall overlevende levedyktige celler ved trypanblått eksklusjon analysen betraktelig, seks (Skov-3) eller sju (OVCAR-8) dager etter tilsetning av dødelige konsentrasjoner av cisplatin (figur 5E). Trypanblått er en indikator på antallet levedyktige celler og gjenspeiler den økede antall overlevende celler vi observert visuelt. Ikke alle ectopically uttrykt mirnas forbedre overlevelse tyder på at effekten av MIR-150 og MIR-146a er spesifikke. Disse observasjonene tyder på at økt uttrykk av MIR-150 og MIR-146a fremme overlevelse, eller i det minste forsinke cisplatin-indusert celledød, i eggstokkreft celler.
Diskusjoner
Våre viktigste funn viser at metastatiske svulster up-regulere spesifikke mirnas forhold til sine primære svulster og at blant disse mirnas, MIR-146a og MIR-150 fremme 3D spheroid dannelse og øke toleranse for cisplatin i eggstokkreft celler, noe som tyder på en rolle for disse mirnas for å overleve i spesifikke forhold. Vi observerer betydelig felles gjentakelse av differensiell regulering av 17 mirnas, noe som tyder på at kravene til å tilpasse seg den omentum er svært like i de fleste EOC pasientene. Sammen utgjør disse dataene støtter ideen om at omentfaktorene lesjoner er beriket for trekk ved aggressiv sykdom, som også formidler pasientens respons på kjemoterapi. Noen av disse funksjonene, slik som MIR-146a og Mir-150 uttrykk kan være unik for metastaser, som de er veldig ydmyk uttrykt i de fleste primære svulster i våre datasett og i TCGA [21]. Lav uttrykk for disse miRNAs i primærsvulster er assosiert med dårlig generell pasientoverlevelse [21]. Fordi disse mirnas er ofte oppregulert i omentfaktorene lesjoner og høyt korrelert med uttrykk i primærsvulster (Pearson = 0,7 for MIR-150 og 0,78 for MIR-146a), spår vi at høyere uttrykk i metastaser vil bli assosiert med kortere total overlevelse og sykdomsprogresjon.
Et av målene med denne studien var å forstå hvor like eller ulike primære ovarietumorer er fra omentfaktorene metastaser. Tidligere forsøk som sammenligner disse svulstene har søkt microarray-teknologi for å undersøke mRNA uttrykk nivåer. Ved hjelp av strenge terskler, ble rapportert relativt små forskjeller mellom primære og metastatiske svulster [15]. Imidlertid er en rekke studier rapporterer signifikante forskjeller etter andre metoder, inkludert immunohistokjemi av E-cadherin [19], MMP’er [17], og den nylige funn av adipocytt signale påvirke kreftceller i omentum [8]. mirnas har dukket opp som viktige regulatorer av celle skjebne og mange miRNA profilering studier tyder på at mirnas kan ha et større dynamisk omfang i sine uttrykk forskjeller mellom vev som muliggjør identifisering av distinkte vev og tumorspesifikke uttrykk signaturer.
Fordi stromaceller skiller mellom de to tumorene, noen av de store forskjeller miRNA ekspresjonssystemer kan stamme fra disse cellene. For å identifisere hvilken, om noen, miRNA uttrykk forskjeller stammer fra kreftceller, utførte vi to eksperimenter. Vi var i stand til å oppdage MIR-21 ved ISH, som viser økt MIR-21 uttrykk i H E farget kreftceller (Figur 2A og figur S5). Disse data viser også at noen øket MIR-21-ekspresjon i enkelte pasienter som har opprinnelse fra stromaceller. For å utføre en mer omfattende analyse, kombinert vi Taqman qPCR arrays med LCM å undersøke en beriket kreftcelle befolkning. Disse data indikerer at noen av de mirnas identifisert i bulk skjermen (MIR-370, MIR-124, MIR-508, MIR-509), vil sannsynligvis ikke uttrykt i kreftceller etter hvert som de ikke lett ble detektert i LCM anriket populasjon. På den annen side, 11/17 av de mirnas, inkludert MIR-146a og MIR-150, identifiseres i bulk tumor er uttrykt og opprettholde tilsvarende uttrykk forskjeller i LCM anrikede kreftceller.
ekspresjonsanalyse fra både bulk svulst og LCM anriket kreftcellepopulasjoner, samt ISH data viser betydelig oppregulering av MIR-21 i metastaser i forhold til primære tumorer. MIR-21 er kjent for å være et anti-apoptotisk, pro-overlevelse miRNA i mange kreftformer, inkludert ovarie [30], og våre foreløpige observasjoner støtter også MIR-21 rolle i å fremme sfæroide formasjonen (data ikke vist). Disse observasjoner støtter ideen om at omentfaktorene metastaser kan velges til å være mer resistente overfor kjemoterapi har overlevd flukt fra den primære tumoren.
mirnas ofte nedregulerer ekspresjon ved binding av 3’UTR av mRNA. Den effekt på mRNA-stabilitet og total RNA-nivåer er ofte beskjeden, [31], [32], vurdering av mRNA-ekspresjon endringer kan være vanskelig å observere. For å få innsikt i hvordan oppregulert metastatiske mirnas er formidling spredning og cisplatin respons, vi evaluert sine spådd mål. Vi finner at MIR-21, MIR-146a og MIR-150 mRNA målene er betydelig nedregulert i forhold til tilfeldig utvalgte equivalently store gensettene (figur S4), i samsvar med disse mirnas aktivt undertrykker mRNA i metastatiske svulster.
MIR-150 er mest kjent for sin rolle i regulering av B-celledifferensiering og timingen av uttrykket er kritisk for sin rette rolle i å fremme B-celle utvikling [33], [34]. Nyere rapporter tyder på at Mir-150 kan enten fremme eller hemme svulster [35], [36], [37], [38], fremhever et felles tema for kontekstavhengige funksjoner av miRNAs [39], [40]. Vi har ikke observere invers korrelasjon med uttrykk for tidligere identifisert Mir-150 mål P2RX7 [41] eller EGR2 [35] i våre primær /metastatiske kreft data.
MIR-146a har blitt identifisert som en tumor suppressor gjennom nedregulering av NFkB aktivatorer IRAK1 og TRAF6 [42], [43]. Imidlertid finner vi at IRAK1 og TRAF6 ikke er uttrykt i Skov-3 eller OVCAR-8 ved qPCR (data ikke vist). I noen sammenhenger er MIR-146a onkogen, ved å undertrykke BRCA1 [44] eller FAS [45]. Vi observerte ikke signifikant reduksjon av BRCA1, BRCA2, eller FAS uttrykk på MIR-146a ektopisk uttrykk (data ikke vist). Undertrykkelse av BRCA1 ville ikke være fornuftig med økt overlevelse, som redusert BRCA1 /BRCA2 mediert DNA reparasjonsfunksjoner er assosiert med høyere cisplatin følsomhet [46]. Dermed ser MIR-146a å arbeide gjennom en ny mekanisme i eggstokkreft celler for å øke overlevelsen.
Vi antok at endringer i miRNA uttrykket i metastaser i forhold til primære svulster kan tyde funksjoner i metastatisk miljø som avviker fra primærtumor miljø. For å begynne å modellere hvordan disse mirnas kan støtte fortsatt vekst og overlevelse av metastatiske svulster, vi la ut på en rekke funksjonelle eksperimenter med etablerte eggstokkreft cellelinjer. Vi brukte gevinst og tap av funksjonsstudier i cisplatin celle levedyktighet analyser for å finne ingen signifikante effekter av MIR-146a og MIR-150 om narkotika følsomhet eller vekst i eggstokkreft celler. Foreløpige undersøkelser testing migrasjon viste ikke signifikante avhengige effekter miRNA (data ikke vist). Imidlertid finner vi at MIR-146a og MIR-150 megle dannelse og størrelse på kuler. Som kreftceller unnslippe den primære svulsten og skriv bukhulen, de ofte danner aggregater fra 50-750 mikrometer i størrelse. Spheroids ligne disse aggregatene isolert fra pasienter [47] og ligner xenografttumorer bedre enn enlagskultur [48]. Noen av de endringer som økt ekspresjon av integriner sett i etablerte metastaser er også observert i disse kuler (data ikke vist), og kan reflektere samfunnet virkning mer minner om human sykdom [19], [47], [49]. Våre observasjoner som MIR-146a er oppregulert i menneskelige omentfaktorene metastaser, med en samtidig reduksjon i spådd mRNA mål og kuler i forbindelse med gevinst og tap av funksjonsanalyser alt tyder på en viktig rolle for MIR-146a i dannelse og vedlikehold av metastaser . Disse dataene støtter også en rolle for MIR-150, men uten tap av funksjonsdata, konklusjonene basert på de funksjonelle eksperimenter er ikke så sterk. Sammen med cisplatin toleransetest, støtter disse dataene muligheten for at MIR-146a og MIR-150 er behov for å understøtte overlevelse under stressede betingelser som sfæroide vekst, høye konsentrasjoner av cisplatinbehandling, og tilpasning til nye forhold under formidling hos pasienter.
En forbeholdet med denne studien er at disse cellelinjene ikke kan rekapitulere viktige funksjoner i kreftceller i tumorer, inkludert uttrykk for MIR-150 sett i ovarietumorer. Vår manglende evne til å modellere eggstokkreft
in vitro
eller
in vivo
kan skjule flere funksjoner i disse mirnas oppregulert i omentfaktorene metastaser. Korttidskulturer av nylig avledede cellelinjer eller undersøkelse av miRNA funksjon i dyremodeller kan være nødvendig for å identifisere ytterligere funksjoner av disse mirnas i metastasering. Disse data fremheve hvordan enkelte mirnas kan være viktig for å overleve i spesifikke forhold og velges således for økt ekspresjon i metastaser. Fremtidige studier som undersøker MIR-146a og MIR-150 ved hjelp av
in vivo
modeller og co-kultur systemer kan bidra til å gi innsikt i funksjonene til disse mirnas.
En av de store utfordringene i behandling av avansert
