Abstract
Formål
uttrykk for desmogleins (DSGs), som er kjent for å være avgjørende for å etablere og opprettholde celle-celle adhesjon nødvendig for vev integritet, har blitt godt karakterisert epidermis og hårsekken; Imidlertid er deres ekspresjon i andre epiteliale vev som prostata dårlig forstått. Selv om nedregulering av klassiske cadherins, slik som E-cadherin, har blitt beskrevet i prostatakreft vevsprøver, ekspresjonen av desmogleins bare har tidligere blitt rapportert i prostatacancercellelinjer. I denne studien, karakterisert vi desmoglein ekspresjon i normale prostata vev, og videre undersøkt om desmoglein 2 (DSG2) ekspresjon spesifikt kan tjene som en potensiell klinisk prognostisk faktor for pasienter diagnostisert med primær prostatakreft.
Experimental Design
Vi utnyttet immunfluorescens å undersøke DSG2 uttrykk i normal prostata (
n
= 50) og i en klinisk godt karakterisert kohort av prostatakreftpasienter (
n
= 414). Korrelasjon av DSG2 uttrykk med klinisk-patologisk egenskaper og biokjemisk tilbakefall ble analysert for å vurdere den kliniske betydningen.
Resultater
Disse studiene viste at DSG2 og DSG4 ble spesielt uttrykt i prostata luminal celler, mens basal cellene mangler deres uttrykk. I motsetning til dette, ble DSG1 og DSG3 ikke uttrykt i normal prostata epitel. Ytterligere analyser av DSG2 uttrykk i prostata kreft viste at reduserte nivåer av dette biomarkør var en betydelig uavhengig markør for dårlig klinisk utfall.
Konklusjon
Her rapporterer vi for første gang at en lav DSG2 uttrykk fenotype er et nyttig prognostisk biomarkør tumor aggressivitet og kan tjene som et hjelpemiddel for å identifisere pasienter med klinisk signifikant prostatakreft
Citation. Barber AG, Castillo-Martin M, Bonal DM, Rybicki BA, Christiano AM, Cordon -Cardo C (2014) Karakterisering av desmoglein Expression i Normal prostatakjertelen. Desmoglein 2 er en uavhengig prognostisk faktor for aggressiv prostatakreft. PLoS ONE 9 (6): e98786. doi: 10,1371 /journal.pone.0098786
Redaktør: Craig N. Robson, Nord Institute for Cancer Research, Storbritannia
mottatt: 17 februar 2014; Godkjent: 07.05.2014; Publisert: 04.06.2014
Copyright: © 2014 Barber et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er delvis støttet av National Institutes of Health gir P01-CA087497 (CCC og MCM) og R01-ES11126 (BAR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
desmosomes er en type celle-celle forankring krysset funnet i vev med en høy grad av mekanisk stress, og tap av desmosomal vedheft er assosiert med sykdommer som påvirker hud, hår og hjerte [1] – [ ,,,0],1. 3]. I desmosom blir cadherin familien av proteiner representert ved de såkalte «ikke-klassisk» cadherins, som inkluderer desmogleins (DSG 1-4) og desmocollins (DSC 1-3) [14]. Desmogleins og desmocollins spille en dobbel rolle i dannelsen av desmosomes. I det ekstracellulære rom, desmogleins og desmocollins på opposisjonelle celler samhandle på en heterofile kalsiumavhengig måte via sine cadherin gjenta domener. Intracellulært, er cadherins binde til plakoglobin og plakophilin, som i sin tur binder seg til desmoplakin. Desmoplakin bindes deretter til mellomliggende filamenter, for derved å sikre at hele strukturen cytoskjelettet [15], [16]. Mens klart viktig å opprettholde integriteten av voksne vev, er rollen til desmosomale cadherins i kreft progresjon mindre godt forstått. Tap av heterozygositet nær kromosomale regionen inneholder desmosomal cadherin clusteret er rapportert hos kreftfaren samt hode og hals plateepitelkarsinom [17], [18]. Endringer i ekspresjon av desmogleins er blitt rapportert for en rekke kreftformer. Redusert ekspresjon av DSG2 har blitt rapportert i gastriske og pankreatiske karsinomer [19] – [21]. Motsatt, overekspresjon av DSG2 og DSG3 har blitt rapportert i plateepitelkarsinom i huden samt hode- og halskreft, henholdsvis [22], [23].
uttrykk for desmosomale cadherins har blitt grundig karakterisert epidermis, hårsekken, og arachnoidal vev. Selv om ekspresjonen av DSG2 er kjent for å være allestedsnærværende i alle desmosom dannende vev, er ekspresjonen av de gjenværende desmosomale cadherins utsiden av epidermis og hårsekken dårlig forstått [24]. En studie av Whittock og Bower i 2003 benyttet RT-PCR for å analysere uttrykk for
DSG4
i et panel av vev og fant at
DSG4
kunne påvises i flere vev, inkludert prostata, noe som tyder at desmoglein ekspresjonsprofilen av prostata kan strekke seg utover den allestedsnærværende ekspresjon av DSG2 [25]. Den nedregulering eller tap av celle-celle adhesjonsproteiner – slik som den klassiske cadherin, E-cadherin – er et felles trekk ved en rekke krefttyper, inkludert prostata cancer, og kan være forårsaket av en rekke forskjellige mekanismer [26], [ ,,,0],27]. Omvendt, skjønt den avvikende ekspresjon av desmogleins har blitt rapportert i flere typer kreft, ekspresjonen av disse cadherins i prostata cancer har bare blitt rapportert i cellelinjer for å tidspunkt [28] – [30]. I denne studien karakter vi for første gang ekspresjonen av desmogleins i normale humane prostata vevsprøver og bestemme den spesifikke celletype hvor prostataspesifikt desmogleins er uttrykt. Vi deretter analysere uttrykk for DSG2 i en godt karakterisert prostatakreft pasient kohort, og undersøke sammenhengen mellom DSG2 uttrykk og pasientenes kliniske utfall. Våre resultater viser at DSG2 og DSG4 er spesielt uttrykt i luminal cellene i normal menneskelig prostata, mens DSG1 og DSG3 ikke er uttrykt i prostata epitel. Videre ble redusert uttrykk for DSG2 funnet å være uavhengig assosiert med en kortere biokjemisk tilbakefall, fremhever potensialet nytten av DSG2 uttrykk som en prognostisk biomarkør for prostatakreft aggressivitet.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Frosne normale menneskelige prostata vev lysbilder tilsvarer prostataovergangssone med histologisk bekreftet områder av normale kjertler fra pasienter som gjennomgikk en radikal prostatektomi ble oppnådd anonymt fra Columbia Tumor Bank Tjenesten i henhold til Institutional Review Board of Columbia Universitetet Protocol # AAAB2447. Den TMA benyttet i denne studien ble bygget i Cordon-Cardo laboratorium, og ble samlet inn 414 radikal prostatektomi tilfeller, opprinnelig samlet inn mellom september 2000 og januar 2005 Henry Ford Health System i Detroit, etter en Institutional Review Board godkjente protokoll # 1018 [31]. Hver deltaker gjennomført et kort telefonintervju (demografi og helse historie), en mat frekvens spørreskjema, og en ansikt-til-ansikt intervju på jobbrelaterte eksponeringer. I tillegg har alle deltakerne gitt en blodprøve for genetiske analyser og for PSA-testing. Påmelding stengt i våren 2005, og IRB forblir åpen for PSA oppfølging (ikke-pasientkontakt) for forsøkspersonene.
Cell Kultur og RNA Isolation
benign prostata epitel BPH- en cellelinje (en generøs gave fra Dr. Ralph Buttyan, og kommersielt tilgjengelig gjennom den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer, DSMZ, Braunschweig, Tyskland) ble dyrket i RPMI med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tre menneskelige metastatisk prostatakreft cellelinjene ble brukt i denne studien: DU145, PC3 og LNCaP. Den DU145-cellelinjen (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i MEM med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den PC3-cellelinjen (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i F12K med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den LNCaP-cellelinjen (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i RPMI med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). For å isolere RNA, ble cellene vasket i 1 x PBS, trypsinert, og pelletert gjennom sentrifugering. Cellene ble dyrket i fire dager forbi konfluens før RNA isolering som det tidligere har vært rapportert at deres fulle desmoglein ekspresjonsprofilen er nådd ved dette tidspunkt [32]. Cellepelletene ble resuspendert i 1 x PBS og deretter pelletert via sentrifugering for å vaskes. Dette vasketrinn ble gjentatt to ganger for å fjerne alle spor av media før slakting RNA. RNA ble deretter høstet ved hjelp av RNeasy Mini Kit og QIAshredder følge produsentens protokoll med tittelen «Rensing av Total RNA fra dyreceller Bruke Spin Technology» (Qiagen, Valencia, CA).
Antistoffer
Anti -DSG3 (klone 5H10) og DSG1 (klon 27B2) mus monoklonale antistoffer har blitt beskrevet tidligere, og ble gitt til oss som en sjenerøs gave fra Dr. James Wahl; begge ble anvendt i en fortynning på 1:10 [33]. Anti-DSG2 mus monoklonalt antistoff (klon 10G11) ble kjøpt fra ARP, Inc (Belmont, MA) og anvendt i en fortynning på 1:50 for immunofluorescens-analyse av normal prostata vev og cellelinjer; anti-DSG1 /2 mus monoklonalt antistoff (klon DG3.10) ble innkjøpt fra Fitzgerald (Acton, MA) og anvendt i en fortynning på 1:20 for TMA. Anti-DSG4 marsvin polyklonale antistoff ble generert av Dr. Lutz Langbein og gitt til oss som en sjenerøs gave, var dette antistoffet som brukes ved fortynning av 1:2000. Anti-cytokeratin 14 (CK14) kanin-polyklonalt antistoff ble kjøpt fra Covance (Princeton, NJ) og anvendt i en fortynning på 1:1000. Anti-PSA monoklonalt antistoff fra mus ble innkjøpt fra Dako (Carpinteria, CA) og anvendt i en fortynning på 1:20. Anti-PSA kanin-monoklonalt antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA) og anvendt i en fortynning på 1:200. Anti-cytokeratins 8/18 (CK8 /18) marsvin polyklonale antistoff ble kjøpt fra Progen (Heidelberg, Tyskland) og brukes ved en fortynning 1:100. Alexa Fluor 594 eller Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California) og ble brukt ved en fortynning på 1:600.
RT-PCR
Total RNA fra human normal hud og normal prostata (begge hentet fra en enkelt donor) ble kjøpt i handelen (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). Først cDNA ble gjort ved hjelp Oligo dT og Super II første-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens anvisninger. PCR ble utført ved hjelp av Platinum PCR Supermix (Invitrogen, Carlsbad, California) og primere for transkripsjoner av interesse (oppsummert i tabell S1). Den følgende PCR-protokoll ble benyttet: trinn 1: 94 ° C i 3 minutter; Trinn 2: 94 ° C i 30 sek, 56 ° C i 45 sek, 72 ° C i 2 minutter; Trinn 3: 72 ° C i 10 min; gjenta trinn 2 for 34 sykluser. PCR produktene ble elektroforese på en 1% agarose /1X TBE gel som inneholder etidiumbromid og visualisert ved hjelp av Kodak Elektroforese Dokumentasjon og Analysis System 120 kamera (Kodak, Rochester, New York).
QRT-PCR
RNA ble høstet fra cellelinjer av interesse som beskrevet. Først cDNA ble gjort ved hjelp Oligo dT og Super III første-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens anvisninger. QRT-PCR ble utført på en Stratagene Mx3005P maskin og analysert ved hjelp av Stratagene MxPro QPCR programvare (Stratagene, Santa Clara, CA). Alle reaksjoner ble utført ved anvendelse QuantiTect SYBR grønn PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), 200 nM primere (oppsummert i tabell S1), og 10 ng cDNA i en 20 ul reaksjonsvolum. Den følgende PCR-reaksjonen ble benyttet: trinn 1: 95 ° C i 10 min; Trinn 2: 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 1 min; gjenta trinn 2 for 40 sykluser. Alle prøver ble kjørt i fire eksemplarer, og prøvene ble normalisert mot en endogen intern kontroll, β-aktin.
immunfluorescens-Frosne vev og cellelinjer
Frosne normale menneskelige prostata vev lysbilder tilsvarer prostataovergangs sone med histologisk bekreftet områder av normale kjertler fra pasienter ble anvendt for å karakterisere antistoffer for påvisning av desmoglein uttrykk. Cellelinjer ble dyrket på dekkglass (Fisher, Pittsburgh, PA) i seks-brønns vevskulturplater (Falcon BD, Bedford, MA). Lysbilder /dekkglass ble fiksert i kald 100% metanol i 15 minutter ved -20 ° C fulgt av kald 100% aceton fiksering i 2 minutter ved -20 ° C. Objektglass /Glassene ble vasket i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) med omrøring, permeabilisert med 1% Triton-X100 i 1 x PBS i romtemperatur i 5 minutter, og vasket en gang i 1 x PBS med omrøring. Objektglass /Glassene ble inkubert i 0,1% Triton X-100/1% bovint serumalbumin (BSA) /1 x PBS blokk ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av primært antistoff inkubasjon over natten ved 4 ° C. Dagen etter lysbilder /dekk ble vasket i 1 x PBS med agitasjon, deretter en 1:600 fortynning av sekundært antistoff, enten Alexa Fluor 594 eller Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, California), ble tilsatt og lysbilder /Dekk ble inkubert ved romtemperatur i 45 min. Lysbilder /Dekk ble deretter vasket i 1 x PBS med uro, nedsenket kort i vannet og montert ved hjelp Vectashield montering medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Immunofluorescensanalyse av Tissue microarray (TMA) §§
TMA ble bygget som følger: Hematoxylin Eosin fargete snitt fra formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) prostatektomi prøvene ble anmeldt for å identifisere levedyktig, morfologisk representative områder av normal prostata kjertler og acinar adenokarsinom som nål kjerneprøver kan tas. Fra hver prøve, triplikate tilstøtende vev kjerner med diameter på 0,6 mm ble stanset og oppstilt på en mottaker parafinblokk ved hjelp av en presisjonsinstrument (Beecher Instruments, MD). Alle slag ble hentet fra et fokus med høyeste Gleason Score, og flertallet av slag ble tatt fra den dominerende svulst nodule – definert som den største nodule med høyest Gleason Score og scene i en bestemt prostatektomi prøven. Oppfølgingsdata for alle saker om bevis for biologisk tilbakefall var tilgjengelig for denne studien. Påfølgende fem mikrometer deler av disse TMA-blokkene ble anvendt for immunofluorescensanalyse, og den første delen ble farget med Hematoxylin-amp; Eosin for å tjene som et templat for morfologi. Glassene ble deparaffinized og rehydrert, og antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming av lysbilder på et dampskip i citratbuffer, pH 6,0 i 15 minutter. Objektglassene ble deretter vasket en gang i 1 x PBS. Platene ble inkubert i 0,1% Triton X-100/1% BSA /1 x PBS blokkering serum ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av primær antistoff inkubasjon over natten ved 4 ° C. Den følgende dag, ble objektglassene vasket i 1 x PBS med omrøring, deretter en 1:600 fortynning av sekundært antistoff, enten Alexa Fluor 594 eller Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ble tilsatt og plater ble inkubert ved romtemperatur i 45 min . Objektglassene ble deretter vasket tre ganger i 1 x PBS + 0,1% Triton X med omrøring, vasket tre ganger i 1 x PBS, raskt neddykket i vann og er montert ved hjelp av monterings Vectashield medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). CK8 /18 ekspresjon ble brukt til å identifisere alle epitel områder (både tumor- og normale glands) i kjernene og ekspresjonen av proteinene av interesse ble skåret ved å bestemme prosentandelen av tumorceller med immunoreaktivitet per vev kjerne (fra 0% til 100% ), uten å ta hensyn intensiteten av signalet. Evalueringen ble utført ved en uropathologist (MCM) ved å følge tidligere anvendt metode: tumor områder i kjernen ble identifisert først med DAPI, bekreftet ved nærværet av CK8 /18 og deretter mottok ved å etablere en prosentandel av tumorer celler med membran ekspresjon av DSG2 [ ,,,0],34] .Den gjennomsnittsverdier av de representative kjerner fra hver pasientprøve ble deretter brukt for statistiske analyser. En positiv cut-off på 60% ble brukt til å utføre statistisk analyse av korrelasjon med klinisk-patologiske trekk og overlevelse, da dette var den omtrentlige midlere uttrykket verdi observert for DSG2 i denne prostatakreft kohort, som tidligere rapportert i litteraturen [35].
prostate Cancer Cohort og klinisk-patologisk Kjennetegn
i denne studien analyserte vi en kohort av 414 pasienter diagnostisert med primær prostatakreft. Klinisk-patologiske trekk ved disse pasientene er oppsummert i Tabell 1. Gjennomsnittlig alder ved diagnose var 61 år (spredning: 41-74.7 år). De fleste av pasientene var hvite (56%) eller African-American (43%). Gjennomsnittlig oppfølgings var 56,8 måneder (spredning: 1.4-123.6 måneder). Bare 98 (24%) av pasientene viste en biokjemisk tilbakefall, definert som å ha to påfølgende påvisbare økende PSA-nivå (mer enn 0,2 ng /ml) i fire uker eller mer etter operasjonen. Biokjemisk tilbakefall gratis overlevelseskurver som svarer til kjente klinisk-patologisk risikofaktorer som Pre-kirurgisk PSA, Patologisk Stage, Gleason Score, Angiolymphatic Invasion og perinevral invasjon, er vist i figur S1.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med SPSS v18.0 (IBM, Armonk, New York). Den t-test ble anvendt for å sammenligne ekspresjon av proteinet av interesse i grunn prostata cancer og normal prostatavevet. Spearmans rank korrelasjon ble brukt til å analysere sammenhengen mellom proteiner av interesse og klinisk-patologiske funksjoner. Biokjemisk tilbakefall overlevelse ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier overlevelseskurver og kurver ble sammenlignet med log-rank test. Multivariat analyse inkludert DSG2 uttrykk og klinisk-patologiske parametre ble utført ved hjelp av Cox modell. En
P
-verdi ≤0.05 ble betraktet som statistisk signifikant.
Resultater
Desmogleins er spesielt uttrykt i Luminal cellene i menneske Normal prostata
Som ekspresjon av desmogleins i prostatakjertelen hadde ikke blitt karakterisert hittil, starter vi denne studien ved å undersøke hele desmoglein ekspresjonsprofilen i normalt humant prostatavev, ved hjelp av RT-PCR og immunfluorescens-analyser. RT-PCR-analyse viste at de fleste desmogleins lett kunne påvises i normal human prostata på RNA-nivå, med unntak av
DSG1
som viste bare svak mRNA ekspresjon (figur 1A). Immunofluorescens-analyse viste at bare ekspresjon av DSG2 og DSG4 kan være lett og konsekvent detekteres i prostata epitel på proteinnivå (figur 1B-C), mens DSG1 og DSG3 ikke var påviselig i normal prostata epitelet (figur S2).
(A) Klar ekspresjon av mRNA kan påvises for de fleste desmogleins, med unntak av
DSG1
som viser bare svak ekspresjon. (B-C) Representative immunfluorescens analyser av DSG2 (B) og DSG4 (C) ved cellekanten av normal human prostatakjertel epitel. Original forstørrelse: 200X. Skala barer tilsvarer 100 mikrometer.
Etter å ha etablert et uttrykk for desmogleins i normal menneskelig prostata, rettet vi å bestemme celletype spesifikke uttrykk for DSG2 og DSG4. Kjertelvevet av prostata består av kanaler og acini som er omgitt av en enkel cuboidal epitel mot lumen av lymfekjertlene. I tillegg til dette sekretoriske komponenten, to andre spesialiserte celler som er en integrert del av prostata kjertelstrukturer, nemlig basalcellene og nevroendokrine celler [36], [37]. Luminal cellene skiller ut blant andre molekyler, prostata spesifikt antigen (PSA) og representerer hoved funksjonell enhet av orgelet. Disse cellene danner et kontinuerlig lag som ligger på toppen av basalcellene. Basal cellene er preget av uttrykk for vekt cytokeratins høy molekyl (CKs) – som CK14 – og p63. Dispergert gjennom hele acini er den tredje cellepopulasjon, de nevroendokrine celler, opprinnelsen og funksjon som i normal prostata er ennå ikke godt definert.
Co-immunofluorescens-analyse ble utført for å undersøke lokalisering av DSG2 og DSG4 med CK14 bestemt basalcellemarkør samt luminal bestemt protein, Ptil. Co-immunofluorescensanalyse av DSG2 og CK14 viser at DSG2 er robust uttrykt i luminal cellene i prostata, og at dette uttrykket sjelden ko-lokaliserer med den for basal CK14 uttrykket (figur 2A-C). Analyse av DSG2 og PSA ekspresjon viste ko-lokalisering av både biomarkører i luminal celler (figur 2D-F). Ekspresjonen av DSG4 var meget lik den til DSG2, og viser sterk ekspresjon i luminal cellene, sjelden ko-lokaliserende med basal ekspresjon CK14 (figur 2G-I), men ko-lokaliserende med luminal PSA uttrykk (figur 2J-L). Videre er ekspresjon av DSG2 viste nesten fullstendig ko-lokalisering med den for DSG4, med de fleste luminal-celler som viser et jevnt nivå av ekspresjon for både desmogleins og noen celler som viser en litt høyere ekspresjonsnivå for en i forhold til den andre (fig 2M- O). Tatt sammen disse resultatene viser at ekspresjon av DSG2 og DSG4 er hovedsakelig begrenset til den luminale celler av humane prostata epiteliale glands.
(A-C) DSG2 blir uttrykt i luminal cellene av prostatakjertler og denne uttrykk sjelden co-lokaliserer med basalcelle CK14 uttrykk. (D-F) DSG2 co-lokaliserer med PSA uttrykk i luminal rommet av kjertelen. (G-I) DSG4 kommer også til uttrykk i luminal celler og sjelden co-lokaliserer med basalcelle CK14 uttrykk. (J-L) DSG4 uttrykk co-lokaliserer med luminal celle PSA uttrykk. (M-O) Et uttrykk for DSG4 viser også nesten fullstendig ko-lokalisering med den av DSG2 i luminal cellene. Original forstørrelse: 200X. Skala barer tilsvarer 100 mikrometer.
DSG2 er uttrykt i Human Prostate Cancer Cell Lines
Etter å ha preget uttrykk for desmogleins i normal menneskelig prostata vev, vi ønsket å fokusere på DSG2 for resten av undersøkelsen, da dette er den mest uttrykte desmoglein isoform – viser allestedsnærværende ekspresjon i alle desmosom dannende vev. Etter vår tidligere funn som DSG2 er uttrykt i normale menneskelige prostata epitel, spurte vi om dette proteinet er også uttrykt i humane prostata kreft cellelinjer. For å undersøke dette spørsmålet, ble QRT-PCR utføres på RNA hentet fra tre kommersielt tilgjengelige og godt karakteriserte metastatiske menneske prostatakreft cellelinjer (figur 3A). De kreftcellelinjer som anvendes for denne delen av studien omfatter den LNCaP-cellelinjen, som ble avledet fra en prostatakreft som metastasert til lymfeknute; den PC3-cellelinjen, som ble avledet fra en prostatakreft som metastasert til benet; og DU145 cellelinje, som ble avledet fra en prostatakreft som metastasert til hjernen [38] – [40]. Den BPH-1 cellelinjen tjente som en kontroll for denne studien, siden det er en immortalisert, ikke-tumorigen prostatisk epitelial cellelinje avledet fra en pasient med benign prostatahyperplasi, en tilstand som ikke er relatert til malign transformasjon prostata [41]. Resultatene av denne QRT-PCR-analyse viste at
DSG2
uttrykkes på forskjellige nivåer i alle cellelinjer som ble undersøkt. Interessant, DSG2
er uttrykk for
økt i alle de metastatisk prostatakreft cellelinjer undersøkt enn det er i den ikke-tumorigent BPH-en kontroll.
(A) DSG2 uttrykk er oppdaget i alle cellelinjene som ble undersøkt, inkludert det normale immortalisert prostata cellelinje BPH-1. Data blir representert som middelverdi ± SD. ** P 0,01; *** P 0,001. (B-E) DSG2 er uttrykt ved cellekanten av LNCaP og DU145-celler; imidlertid celle grensen uttrykk ikke oppdaget i PC3 celler med bare noen celler som viser svak, punktformet, og diffuse flekker (sett inn forstørrelse, vist på 2,5x). Original forstørrelse: 200X. Skala barer tilsvarer 100 mikrometer.
Deretter ble benyttet immunfluorescens analyse for å undersøke uttrykket av DSG2 i disse metastatiske menneske prostatakreft cellelinjer på proteinnivå (figur 3B-E). Cell grensen uttrykk for DSG2 ble påvist i BPH-en, LNCaP og DU145 cellene. Men PC3 cellene manglet uttrykk for DSG2 på celle grensen, mens en liten populasjon av celler viste bare en diffus granulær farging for DSG2 i cytoplasma (se innsats forstørrelse i figur 3D). Disse resultatene er i samsvar med og ytterligere forbedre resultatene av en tidligere studie av Lang
et al.
Der et antistoff spesifikt for både DSG1 og DSG2 ble brukt til å undersøke desmoglein uttrykk i LNCaP, PC3 og DU145 cellene [ ,,,0],29], [42]. Resultatene av QRT-PCR og immunfluorescens analyse viser at uttrykket av
DSG2
er til stede i alle prostatakreftcellelinjer og at i to av de tre prostatakreft cellelinjer undersøkt, lokaliserer DSG2 til cellen grensen som tyder på at desmosomal dannelse er beholdt i de fleste metastatisk prostatakreft cellelinjer undersøkt
in vitro
.
En lav DSG2 Phenotype er assosiert med tumorprogresjon hos pasienter med primær prostatakarsinom
som nevnt tidligere, mens tapet av klassiske cadherin uttrykk er blitt beskrevet i prostata cancer, hittil ekspresjon av desmosomale cadherins i prostata carcinoma vevsprøver er ikke blitt rapportert. For å vurdere den prosentandelen av celler som var positive for DSG2 ekspresjon i prostata carcinoma i forhold til normal prostatavev, ble utført immunofluorescensanalyse av DSG2 uttrykk på prostata-karsinom TMA (
n
= 414), så vel som normal prostata TMA (
n
= 50). I tillegg til et antistoff for proteinet av interesse, et antistoff for CK8 /18 – cytokeratins som finnes i både normal prostata luminale epitel-celler og adenokarcinomceller -. Ble også inkludert på hver TMA som et middel for identifisering av epitelcellene i hver prøve
En betydelig reduksjon i prosentandelen av celler som var positive for DSG2 ekspresjon ble funnet i prostata karsinomer i forhold til normal prostata (tabell 2 og fig S3). Normal prostata epitel ble karakterisert ved en høy prosentandel av celler som var positive for DSG2 uttrykket (bety ekspresjon av 81,1%, median på 84,5%), mens prostata tumorprøver viste en vesentlig lavere prosentandel av DSG2 positive celler (gjennomsnitt ekspresjon av 57,5%, median 66,7%;
P
= 0,0002). En cut-off-verdi på 60% DSG2 positiv celle-ekspresjon ble anvendt, som var den omtrentlige midlere uttrykket verdi observert for DSG2 i prostata cancer-kullet, og median har vært tidligere, og mye brukt til å utføre overlevelse analyse [35]. Ved hjelp av denne cut-off-verdi, ble det observert at 96% av de normale prostata vevsprøver ble betraktet som positive for DSG2, sammenlignet med bare 46% av prostatakarsinom-prøvene som ble studert. Spesielt er mengden av celler som var positive for ekspresjon av DSG2 cellerammen var generelt høyere i godt differensierte områder av tumoren, mens mengden av celler som viser dette uttrykket var ofte mye lavere i dårlig differensierte områder av tumoren (figur 4A-L ), et funn som ble ytterligere validert av Spearmans rank korrelasjon (tabell 3).
(A-L) representant immunfluorescens analyse av DSG2 og CK8 /18 i prostatakreft. (D, E-H) TMA som viser høy DSG2 ekspresjon i cellen grensen av godt differensierte områder av tumoren (panel D, innvendig gul stiplet linje). (D, I-L) TMA som viser lav DSG2 ekspresjon i dårlig differensierte områder av tumor (panel D, vist i resten av tumoren utsiden av gule stiplet linje). Original forstørrelse: 200X. Skala barer svarer til 100 um. (M) Pasienter uttrykker høyere nivåer av DSG2 hadde en betydelig lengre tilbakefall overlevelse enn de som uttrykker lavere nivåer av DSG2 (
P
= 0,01).
sammenhengen mellom uttrykket av DSG2 og klinisk-patologiske egenskaper som vanligvis forbindes med en aggressiv prostatakreft fenotype, inkludert serum Pre-kirurgisk PSA konsentrasjon, Gleason Score, og patologisk Stage ble deretter undersøkt ved hjelp av Spearmans rank korrelasjon (tabell 3). Interessant, var det en signifikant negativ korrelasjon mellom DSG2 uttrykk og Pre-kirurgisk PSA konsentrasjon samt Gleason Score. Resultatene viste at en lav-til-negative DSG2 uttrykk fenotype var assosiert med økt serum Pre-kirurgiske PSA konsentrasjonsnivåer, så vel som med høy Gleason score.
Redusert DSG2 Expression er en selvstendig faktor assosiert med en dårlig klinisk utfall hos pasienter med primær prostatakarsinom
Etter å ha undersøkt sammenhengen mellom DSG2 fenotype og klinisk-patologisk risikofaktorer for prostata kreft, neste fastsatte vi om DSG2 uttrykk er knyttet til biokjemisk tilbakefall overlevelse. Interessant, pasienter med tumorer uttrykt ≥ 60% DSG2 hadde en lengre tilbakefall overlevelse enn de som uttrykker 60%, og forskjellen mellom disse to gruppene var statistisk signifikant (figur 4M,
P
= 0,01). ble observert hos pasienter med 60% DSG2 uttrykk fenotype, mens de med ≥60% DSG2 uttrykk fenotype ikke nådde median tid til biokjemisk: En median tid til biokjemisk tilbakefall av 103.7 måneder (87.7-119.8 måneder KI 95% intervall) tilbakefall etter en oppfølgingstid på 123,6 måneder. Enda viktigere, når vi utført en multivariat analyse, observerte vi at DSG2 uttrykk var en faktor av betydning for biokjemisk tilbakefall (HR = 1,579,
P
= 0,050), samt de klassiske klinisk-patologiske funksjoner: Gleason Score og Patologisk Stage (tabell 4). Til sammen viser disse resultatene at redusert DSG2 uttrykk er uavhengig biomarkører i forbindelse med en kortere biokjemisk tilbakefall i prostata cancer, for derved å avsløre den potensielle kliniske anvendelsen av DSG2 som en prognostisk biomarkør av tumor aggressiviteten for pasienter som lider av dette ofte forekommende sykdom.
Diskusjoner
resultatene som presenteres i denne studien gir den første molekylær karakterisering av desmoglein uttrykk i normal menneskelig prostata, karakterisering av DSG2 i metastatisk prostatakreft cellelinjer, og den første analysen av DSG2 uttrykk i vevsprøver av primær prostatakarsinom. Resultatene som er rapportert her viser at mens de fleste desmogleins er tydelig uttrykt i den humane prostata på RNA-nivå, blir bare DSG2 og DSG4 konsekvent identifisert på et høyt nivå i normal human prostata på proteinnivået.
