Abstract
Hypertermi (HT) forbedrer effekten av anti-kreft strålebehandling og kjemoterapi. Men HT også uunngåelig fremkaller stressresponser og øker uttrykket av varme-sjokk proteiner (HSP) i kreftceller. Blant de HSP, er HSP70 kjent som en pro-overlevelse protein. I denne studien undersøkte vi den sensibiliserende virkning av pifithrin (PFT) -μ, et lite molekyl inhibitor av HSP70, når tre humane prostatacancercellelinjer (LnCap, PC-3 og DU-145) ble behandlet med HT (43 ° C i 2 timer). Alle cellelinjer konstitutivt uttrykt HSP70, og HT økt uttrykk videre i LNCaP og DU-145. Knockdown av HSP70 med RNA-interferens nedsatt levedyktighet og kolonidannende evne av kreftceller. PFT-μ reduserte viabilities av alle cellelinjer ved en tiendedel av dosen av quercetin, et velkjent HSP-inhibitor. Kombinasjonsterapi med suboptimale doser av PFT-μ og HT redusert levedyktighet av kreftceller mest effektivt når PFT-μ ble tilsatt umiddelbart før HT, og denne kombinasjonen virkning ble opphevet ved pre-knockdown av HSP70, noe som tyder på at effekten ble formidlet via HSP70 hemming. Den kombinasjonsterapi-indusert celledød, delvis caspase-avhengige, og redusert voksende kreftceller, med redusert ekspresjon av c-myc og cyclin D1 og økt ekspresjon av p21
WAF1 /Cip, noe som indikerer arrest av cellevekst. I tillegg kombinasjonsterapien betydelig redusert kolonidannende evne av kreftceller i forhold til behandling med enten alene. Videre er det i en xenograft musemodell, kombinasjonsterapi inhiberte signifikant PC-3-tumorvekst. Disse funnene antyder at PFT-μ effektivt kan forbedre HT-induserte antitumoreffekter via HSP70 hemning ved å indusere celledød og arrest av cellevekst, og at PFT-μ er et lovende middel for anvendelse i kombinasjon med HT for å behandle prostatakreft.
Citation: Sekihara K, Harashima N, Tongu M, Tamaki Y, Uchida N, inomata T, et al. (2013) Pifithrin-μ, en hemmer av Heat-Shock Protein 70, kan øke antitumor Effekter av Hypertermi mot menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (11): e78772. doi: 10,1371 /journal.pone.0078772
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 10. juni, 2013, Godkjent: 16 september 2013; Publisert: 14.11.2013
Copyright: © 2013 Sekihara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Grants-i-aid for Scientific Research fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan (nr. 18591449 til M. Harada og nei. 23701074 til N. Harashima), og fra Shimane university «S-Takumi Medical nanoteknologi» Project (M. Harada). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen og den tredje vanligste årsaken til kreftrelatert dødelighet hos menn i USA [1]. Selv tidlig stadium prostata kreft kan godt kontrollert av kirurgi eller strålebehandling, pasienter med fremskreden prostatakreft behandles med hormonbehandling [2]. Men etter en kortvarig remisjon, overlevende kreftceller ofte tilbake med økt malignitet [3]. Derfor, for å forbedre overlevelse hos menn med prostatacancer, må nye terapeutiske strategier utvikles.
hypertermi (HT) er en effektiv terapi som har lav toksisitet, milde bivirkninger, og har vist seg å være synergistisk med andre typer av anti-cancer-terapier. Tallrike
in vitro Hotell og
in vivo
studier har avdekket at HT forbedrer effektivt effekten av strålebehandling og kjemoterapi mot ulike typer kreft [4] – [6]. I tillegg har mange kliniske forsøk vist at tilsetning av HT til radioterapi eller kjemoterapi kan gi en mer fullstendig respons [7] – [11]. Imidlertid er HT uunngåelig forbundet med varmesjokkproteiner (HSP) [12], [13]. HSP er molekylære anstand som fungerer som den primære cellular forsvar mot skade på proteomet, initiere refolding av denaturert protein og regulere nedbrytning etter alvorlig protein skade [14]. HSP beskytte celler både ved å begrense virkningene av protein-skadende midler ved protein chaperoning og refolding og ved direkte å blokkere celledødsveier [15] – [18]. Blant de HSP, er HSP70 en stress-induserbar HSP som er blitt rapportert å spille en rolle i terapi-motstand [19]. I motsetning til det meget lave nivå i trykksvake normale celler, øker HSP70 ekspresjon raskt i respons til ulike påkjenninger [20], [21]. Viktigere, har økt ekspresjon av HSP70 i kreftceller blitt rapportert å være assosiert med maligne egenskaper og dårligere prognose av kreftpasienter [22]. Dette tyder på at HSP70 er et lovende mål i behandling av kreft. Redusere HSP70 nivåer i enkelte dyrkede tumorceller har blitt rapportert å indusere celledød, og /eller bevisstgjøre dem til cytotoksiske midler, samtidig som de har ingen åpenbare skadelige effekter på ikke-kreftceller [23] -. [28]
Pifithrin (PFT) -μ (2-phenylethynesulfonamide) ble først identifisert som et lite molekyl-inhibitor av bindingen av p53 til mitokondriene [29]. Deretter ble dette molekylet funnet å selektivt kommunisere med HSP70, og for å hemme dens funksjoner [30]. Denne informasjonen førte oss til å teste hypotesen om at PFT-μ kunne forbedre HT-induserte antitumor effekt mot menneskelige prostata kreft celler. I denne studien, etter å ha bekreftet at HSP70 er konstitutivt uttrykt og /eller forsterket av HT og spiller en pro-overlevelse rolle i menneskelige prostata kreft celler, viste vi at kombinasjonen av suboptimale doser av PFT-μ effektivt kan forbedre HT-induserte antitumor effekter mot menneskelige prostata kreft
in vitro
, og at kombinasjonsterapi kan hemme tumorvekst i en xenograft mus modell.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
tre humane prostatacancercellelinjer (LNCaP, PC-3 og DU-145) ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA), og ble opprettholdt i RPMI 1640-medium (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) og 20 pg /ml gentamicin (Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. PFT-μ og quercetin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (SCB: Santa Cruz, CA, USA). Og Cayman Chemical Company (Ann Arbor, Michigan, USA), henholdsvis
Celleviabilitet analysen
Cellelevedyktigheten ble evaluert ved bruk av 2- (2-metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2, 4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium mononatriumsalt (WST-8) analyse (Nacalai tesque, Kyoto, Japan). I korthet ble cellene sådd ut i flatbunnede 96-brønners plater. To dager senere, WST-8 ble tilsatt til hver brønn, og platene ble avlest ved en bølgelengde på 450 nm etter 3 timer.
Kombinasjonsbehandling med HT og PFT-μ
For å indusere HT, kreftceller, som ble sådd ut 1 dag før, ble inkubert ved 43 ° C i 2 timer. Kreftceller ble dyrket alltid i nærvær av PFT-μ i 2 dager. I noen eksperimenter, ble HT utført på dag 1, 2 eller 3 etter startkultur av kreftceller.
Transfeksjon av små interfererende RNA (siRNA)
Transfeksjon av siRNA ble utført ved anvendelse av Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner. HSP70 siRNA (sc-29352) ble kjøpt fra SCB. Kontroll siRNA (# 6568) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA, USA. Tre dager etter transfeksjon siRNA, ble kreftcellene anvendt for eksperimentene.
kolonidannende analyse
Cellene ble sådd ut i flatbunnede seks-brønns plater. En dag senere ble PFT-μ tilsatt og behandlet med eller uten HT. To dager etter tilsetningen av PFT-μ, ble mediet erstattet med et nytt medium som ikke inneholder noe PFT-μ, og kulturen ble fortsatt i ytterligere 10-12 dager. Deretter kolonier ble fiksert med metanol og farget med 0,05% krystallfiolett, deretter telles
Immun
Celler ble lysert med en pattedyrprotein Ekstraksjonsreagens (M-PER,. Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) inneholdende en protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque). Like mengder protein ble løst på 4-12% gradient eller 12% SDS-PAGE-geler, og deretter overført til polyvinylidenfluorid membraner. Etter blokkering membranene, ble blottene inkubert med følgende primære antistoffer: anti-HSP70 (HSP72; R 0,05 (Student
t
-test) (D) PC-3 og DU-145, som hadde blitt pre-transfektert med HSP70 siRNA eller kontrollere siRNA 2 dager før, ble dyrket for kolonidannelsesbestemmelsen i 12 dager. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. *
P
0,05 (Student
t
-test) (E) LNCaP, som hadde vært pre-transfektert med HSP70 siRNA eller kontrollere siRNA 2 dager før, ble dyrket i 12 dager, og celle-levedyktighet (%) ble bestemt ved bruk av WST-8-analyse. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. *
P
0,05 (Student
t
-test)
Antitumor effekter på humane prostata kreft celler indusert av kombinasjonsbehandling med HT og PFT-. μ
De ovennevnte data tyder på at hemming av HSP70 kan rette behandling av prostatakreft ved hjelp av HT. Derfor vi neste undersøkte effekten av den nye HSP70-inhibitor PFT-μ på HT-induserte antitumoraktivitet. Før evaluering av antitumoreffekten indusert ved en kombinasjon av HT og PFT-μ, sammenlignet vi antitumoreffekt av PFT-μ som i quercetin, et varmesjokk-faktor (HSF) -1-inhibitor, som hemmer den opp-regulering av alle varmesjokk-indusert gener, inkludert
HSP70
genet [31] (fig. 2A). Både quercetin og PFT-μ redusert levedyktighet av tre prostatakreft-cellelinjer på en doseavhengig måte, men PFT-μ utøvet sin antitumoreffekt på nesten en tiendedel av dosen av quercetin. Vi bekreftet også at knockdown av HSP70 mislyktes i å påvirke ekspresjon av HSP90, en annen nøkkel HSP av stressrespons veien (Fig. 2B). PFT-μ hadde ingen effekt på den HSP70-proteinet uttrykket, som rapportert tidligere [30].
(A) Tre cellelinjer ble dyrket med de angitte doser av quercetin eller PFT-μ. Etter 48 timer ble cellelevedyktighet (%) bestemt ved bruk av WST-8-analyse. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. (B) To dager etter transfeksjon av HSP70 siRNA eller kontroll siRNA, uttrykket av HSP90 og HSP70 ble vurdert av immunoblot. Ekspresjonen av disse HSP ble også undersøkt etter behandling med PFT-μ (5 uM). β-Aktin ble anvendt som en kontroll.
Deretter bedømmes vi antitumor effekter indusert ved en kombinasjon av HT og PFT-μ. Vi først utforsket for de optimale protokoller for å maksimere antitumoreffekter forårsaket av denne kombinasjonen. Som vist på fig. 3A, tre humane prostatacancercellelinjer ble behandlet med tre forskjellige protokoller; i protokoll-1 (P-1), ble HT utført 24 timer før tilsetningen av PFT-μ; i protokoll-2 (P-2), ble PFT-μ tilsatt umiddelbart før HT; og i protokoll-3 (P-3), HT ble utført 24 timer etter tilsetning av PFT-μ. Den mest fremtredende effekt ble observert ved anvendelse av P-2-protokollen (fig. 3B). Utvalgte representative data er vist i fig. 3C. Levedyktigheten av kreftceller ble redusert betydelig når HT ble kombinert med en suboptimal dose (5 uM) av PFT-μ. Vi videre bestemt om kombinasjonen effekt kunne observeres i kreftceller som ble pre-transfektert med HSP70 siRNA (Fig 3D.); pre-knockdown av HSP70 avskaffet kombinasjonen effekt mot PC-3 og DU-145. Disse resultatene indikerer at suboptimale doser av PFT-μ kan forbedre HT-induserte antitumoreffekter på prostatakreftceller via HSP70 inhibering, og at den mest fremtredende virkning oppnås når PFT-μ tilsettes umiddelbart før HT.
( A) er vist tre forskjellige protokoller. (B) Tre cellelinjer ble dyrket med de angitte doser av PFT-μ basert på tre forskjellige protokoller med HT (stripete bar) eller uten HT (svart strek). HT ble utført ved 43 ° C i 2 timer. Etter 48 timer ble cellelevedyktighet (%) bestemt ved bruk av WST-8-analyse. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. (C) Utvalgte resultater vises. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. *
P
0,05 (Student
t
-test) (D) PC-3 og DU-145, som hadde blitt pre-transfektert med HSP70 siRNA eller kontrollere siRNA 2 dager tidligere, ble culured med PFT-μ (5 uM) med /uten HT (43 ° C i 2 timer). Etter 48 timer ble cellelevedyktighet (%) bestemt ved bruk av WST-8-analyse. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. *
P
0,05 (Student
t
-test) NS, ikke signifikant
Kreft celledød etter kombinasjonsbehandling av HT og PFT-μ.
I de ovennevnte studiene, evaluert vi hovedsakelig antitumoreffekter på prostatakreftceller ved å måle levedyktighet 2 dager etter behandling med HT og PFT-μ. Imidlertid kan slike effekter på levedyktighet reflektere endringer i celledød og /eller vekst. Derfor vi neste vurderes det underliggende virkningsmekanismen. Som vist på fig. 4A, HT alene ikke klarte å øke prosentandelen av Annexin V-
+ -celler, mens behandling med PFT-μ økte det litt. Imidlertid kombinasjonsbehandling drastisk økte prosentandelen av Annexin V
+ celler, både tidlig apoptotisk Annexin V-
+ /PI
– og sent apoptotiske og /eller nekrotisk Annexin V-
+ /PI
+, spesielt i LNCaP-celler. Økningen i andelen Annexin V
+ celler syntes å være eneste tilsetningsstoff i PC-3 og DU-145. I tillegg tilsetning av 20 pM Z-VAD, et pan-kaspaseinhibitor, delvis reduserte andelen av Annexin V
+ -celler i LNCaP etter kombinasjonsbehandling av HT og PFT-μ (Fig. 4B). Z-VAD-indusert utvinning fra Annexin V
+ celler ble detektert i Annexin V
+ /PI
– (tidlig apoptotisk) delsett. Denne dosen av Z-VAD var tilstrekkelig til å hemme TRAIL-fremkalt celledød av død-reseptor-uttrykkende humane kreft i bukspyttkjertelen celler [32]. Disse resultater indikerer at, selv om effekten varierer mellom kreftcellelinjer, kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ kan forbedre død av prostatakreftceller, og at kombinasjonsterapi-indusert celledød av LNCaP er delvis caspase-avhengig.
(A) Tre cellelinjer ble behandlet med HT (43 ° C i 2 timer) og /eller PFT-μ. Etter 48 timer flow cytometri ble utført etter farging med FITC-konjugert Annexin V og PI. Et representativt resultat er vist. Tallene representerer hvor mange prosent av hvert delsett. (B) LNCaP-celler ble behandlet med både HT og PFT-μ (5 uM) i nærvær av Z-VAD (20 uM) eller kontroll DMSO. Etter 48 timer flow cytometri ble utført etter farging med APC-konjugert Annexin V og PI. Tallene representerer prosenter for hver undergruppe.
Kombinasjonsbehandling med HT og PFT-μ kan arrestere veksten av prostata kreft celler
Vi videre undersøkt om cellevekst arrest var involvert i antitumor effekter indusert ved kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ. Som vist på fig. 5A, vurderte vi spredning og cellesyklus av kreftceller ved å evaluere BrdU opptak og 7AAD farging. Vi har funnet at kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ redusert prosentandel av BrdU
+ S-fase kreft celler og øket den i G2 /M-fase kreftceller i de tre cellelinjer. Vi vurderte også ekspresjonen av cellesyklusrelaterte molekyler og funnet at kombinasjonsbehandling resulterte i redusert ekspresjon av c-myc i LNCaP og redusert ekspresjon av cyclin D1 i PC-3 og DU-145. I tillegg er uttrykk for p21
WAF1 /Cip ble økt i de tre kreftcellelinjer. Disse dataene tyder på at cellevekstarrest bidrar til antitumor effekter indusert ved kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ.
(A) Tre cellelinjer ble behandlet med eller uten HT (43 ° C i 2 timer) og PFT-μ (5 mm) i 2 dager. I løpet av de siste 5 timer for LNCaP, 90 min for PC-3, og 3 timer for DU-145 ble cellene dyrket med BrdU (10 uM). Deretter ble høstede celler farget med FITC-konjugert anti-BrdU-antistoff og 7AAD, og flow-cytometri ble utført. Tallene representerer prosenter for hver undergruppe. (B) Tre cellelinjer ble behandlet med en eller begge av HT og PFT-μ (5 mm) i 2 dager, og uttrykket nivåer av c-Myc, cyclin D1, og p21
WAF1 /Cip-protein ble bestemt etter immunoblot. β-aktin og α-tubulin ble anvendt som kontroller.
Kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ kan redusere kolonidannende evne av kreftceller
undersøkt ved virkningen av kombinasjonsbehandling med HT og PFT-μ på kolonien dannende evne prostatakreftceller. Kombinasjonsterapi signifikant redusert kolonidannende evne av PC-3 og DU-145-celler (Fig. 6A) og redusert levedyktighet av LNCaP-celler på lang sikt (12 dager) kultur (fig. 6B). Disse resultatene indikerer at kombinasjonsbehandling med HT og PFT-μ kan redusere kolonidannende evne og levedyktighet i et langsiktig kultur, av prostata kreft celler.
(A) PC-3 og DU-145 cellene ble dyrket i 14 dager og deres kolonidannelseskapasitet ble bestemt. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. *
P
0,05 (Student
t
-test) (B) LNCaP celler ble dyrket i 12 dager, og levedyktighet (%) ble bestemt ved bruk av WST-8 analysen. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av tre brønner. *
P
0,05 (Student
t
-test)
In vivo
antitumor effekt av HT og PFT-μ kombinasjon. terapi i en xenograft musemodell
til slutt vurderes vi hvorvidt kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ utøves en antitumoreffekt på etablert human prostatakreft i en xenograft musemodell (fig. 7). De footpads av nakne mus ble inokulert med PC-3 celler og mus ble behandlet med PFT-μ og /eller HT. Gitt anatomi av fotbladet, ble tumorvekst vurdert ved å måle ikke bare et produkt av to perpendikulære diametere, men også den fotputetykkelsen. Som et resultat, selv om lokal administrering av PFT-μ ikke hadde noen antitumoreffekt, men snarere fremmet tumorvekst, og HT redusert tumorvekst litt, men ikke signifikant, kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ signifikant undertrykket tumorvekst sammenlignet med kontrollgruppen.
BALB
nu /nu
hannmus ble inokulert i den høyre fotpute med 1 x 10
6 PC-3-celler med Matrigel. På dag 15 ble musene samlet og delt inn i fire grupper. Hver gruppe inneholdt seks mus. På dag 0 og 4 etter gruppering, ble PC-3-bærende mus injisert lokalt med PFT-μ (100 ug i 50 ul) og /eller behandles med HT (43 ° C i 30 minutter). Pilene representerer dag av behandlingen. Som en vehikkel kontroll ble 50 pl DMSO injisert. HT ble utført en time etter lokal injeksjon av PFT-μ. Deretter ble tumorstørrelsen, er produktet av to perpendikulære diametere (A, B), og den fotputetykkelsen (C, D) målt to ganger ukentlig. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD av seks mus. *
P
0,05 **
P
. 0,01 (Dunnett test) NS, ikke signifikant
Diskusjoner
Blant en rekke krefttyper, er HT anvendelig spesielt for prostata kreft [33]. Imidlertid, som diskutert i innledningen, HT fremkaller uunngåelig stressresponser i kreftceller. HSP70 er en potent varme induserbar pro-overlevelse protein som overfører cytobeskyttelse mot ulike dødsinduserende stimuli og øker tumorigenicity [25], [27], [34]. Derfor HSP70 har blitt foreslått som et lovende mål for behandling av kreft [19]. I denne studien, viste vi at tre prostata kreft cellelinjer er konstitutivt positivt for HSP70, og at HT kan øke sitt uttrykk i LNCaP og cellelinjer DU-145. Uventet, uttrykk for HSP70 i PC-3 var litt redusert åtte timer etter HT; Vi kan ikke forklare denne observasjon i dag. Det er imidlertid å merke seg at selektiv knockdown av HSP70 i kreftceller betydelig redusert deres levedyktighet og kolonidannende evne. Våre resultater tyder på at HSP70 er et pro-overlevelse protein i prostatakreftceller, i samsvar med tidligere rapporter [23] – [28]. Disse funnene førte oss til å teste effekten av kombinasjonen av HT med PFT-μ, en nylig identifisert HSP70-inhibitor [30], på human prostata kreftceller.
Kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ signifikant reduserte levedyktigheten til tre prostatakreft-cellelinjer sammenlignet med behandling med enten terapi alene. Når det gjelder underliggende mekanisme, testet vi to muligheter;
vil si.
, Celledød og cellevekst arrest. Annexin V /PI farging viste at kombinasjonsbehandlingen økte prosentandelen av Annexin V
+ celler (fig. 4A). Selv om kombinasjonen effekten var liten i PC-3 og DU-145-celler, en drastisk og synergistisk økning i prosentandelen av Annexin V
+ celler ble observert i LNCaP-celler. HT alene ikke påvirke den prosentandel av Annexin V
+ celler, og effekten av PFT-μ alene var også marginal. Annexin V
+ /PI
+ positivitet angir ikke apoptotiske celler fordi sene-nekrotiske celler er også positivt for både Annexin V og PI. Med hensyn til cellevekstarrest, redusert kombinasjonsterapien i S-fasefraksjon og økt G2 /M-fase fraksjonen i tre kreftcellelinjer (Fig. 5A). Disse resultatene er i samsvar med de fra en fersk rapport som viser at PFT-μ kan indusere G2 /M arrest i kreftceller [35]. I tillegg sank kombinasjonsterapi ekspresjonen av c-myc i LNCaP og cyklin D1 i PC-3 og DU-145, og økt ekspresjon av p21
WAF1 /Cip i tre cellelinjer. Disse endringene i cellesyklusrelaterte molekyler kan delvis står for arrestasjonen av veksten av prostata kreft celler som respons på kombinasjonsbehandling.
HSP90 og HSP70 påvirke hverandre [36]. Siden HSP90 inhibering er forbundet med den opp-regulering av HSP70 [37], flere grupper har rapportert at samtidig inhibering av HSP70 markert øker cytotoksisiteten av HSP90-inhibitorer for flere forskjellige tumortyper [38]. Motsatt er HSP70 en kritisk co-chaperon til HSP90, og er involvert i leveringen av klient proteiner til HSP90 [39], og HSP70 hemning kan indusere tumorspesifikt apoptose via HSP90 funksjon [28]. Disse linjene med informasjon antyder at knockdown av HSP70 og PFT-μ forsterket virkningen av HT via hemming av HSP90. Derfor, undersøkte vi effekten av knockdown av HSP70 eller PFT-μ på ekspresjonen av HSP90 i kreftceller, mens ingen endring i HSP90-ekspresjon ble observert (fig. 2B). Imidlertid kan dette resultatet ikke utelukke at inhibering av HSP70 eller PFT-μ påvirket lagring av HSP90-klient proteiner, inkludert epidermal vekstfaktor-reseptor, HER2 /ErbB2 og AKT, til en uløselig fraksjon og fremmet deres aggregering og inaktivering, som rapportert [ ,,,0],40].
Vi bestemt hvorvidt kombinasjonsterapi-indusert celledød av LNCaP-celler var avhengig av caspase (fig. 4B). Tilsetningen av de pan-kaspaseinhibitor Z-VAD redusert prosentandel av Annexin V
+ /PI
– begynnelsen av apoptotiske LNCaP-celler, noe som tyder på at caspase-avhengig apoptose var delvis ansvarlig for den kombinasjonsterapi-indusert celledød av LNCaP. Gitt at HT alene ikke klarte å indusere celledød, synes denne effekten å reflektere hovedsakelig virkningen av PFT-μ. Vi rapporterte nylig at PFT-μ fører caspase-avhengig og-uavhengig celledød av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler [32]. Når det gjelder caspase-uavhengig celledød, har HSP70 blitt rapportert å binde seg til apoptose-induserende faktor (AIF), som induserer caspase-uavhengig apoptose ved translokasjon inn i kjernen [41]. Imidlertid RNA interferens av AIF hadde ingen virkning på PFT-μ-indusert celledød av prostatacancerceller (data ikke vist). Således, AIF sannsynligvis ikke deltar i kombinasjonsterapi-indusert død av LNCaP-celler. Alternativt HSP70 har blitt rapportert å lokalisere til membraner i lysosomer, fremme kreftcelle levedyktighet, og inhiberer TNF-indusert celledød ved å inhibere lysosomal membranpermeabilitet [42]. Således forbedrer HSP70 overlevelse ved å stabil lysosomene i kreftceller. Siden PFT-μ binder HSP70, er det mulig at PFT-μ inhiberer HSP70-indusert stabilisering av lysosomal membranpermeabilitet, noe som resulterer i økt celledød. Det er imidlertid videre studier for å belyse den nøyaktige mekanisme av celledød etter kombinasjonsterapi med HT og PFT-μ.
Når HT er kombinert med anti-kreftlegemidler, er kritisk [tidspunktet for administrering av legemidlet ,,,0],1. 3]. Derfor, i denne undersøkelsen, sammenlignet vi antitumor effekter indusert ved tre forskjellige protokoller, og fant at det HT umiddelbart etter tilsetningen av PFT-μ ga de største antitumoreffekter (fig. 3). Denne indirekte antyder at HSP70 spiller en beskyttende rolle umiddelbart etter varmestress.
Vi evaluerte antitumor effekten av kombinasjonsbehandling ved koloni-formasjon analysen. Dette assay ble utført i 12 dager, og resultatet kan gjenspeile virkningen av både celledød og cellevekstarrest. Kombinasjonen med HT og PFT-μ signifikant redusert kolonidannende evne av PC-3 og DU-145-celler. I tilfelle av LNCaP, kombinasjonsterapi forårsaket en antitumoreffekt på LNCaP i en langvarig (12 dager) celleviabilitet assay. I disse assays ble PFT-μ fjernet etter den første to-dagers kultur fordi den kontinuerlige tilstedeværelsen av PFT-μ, selv ved forholdsvis lav dose brukes for kortvarig celleviabilitet assay, var for høy til å tillate kolonier til å danne. Vi antar at kolonien-formasjon analysen og den langsiktige (12-dagers) celleviabilitet analyse er nyttig for å teste de langvarige effekter på kreftceller etter forbigående anti-kreft terapi.
Selv om Quercetin er en velkjent HSP hemmer [31], har dette stoffet ikke blitt brukt klinisk fordi relativt høye doser er nødvendig for å lokke fram antitumor effekter
in vivo
. Vi sammenlignet antitumor-virkningene av quercetin og PFT-μ og fant at PFT-μ kan indusere antitumoreffekt selv ved en tiendedel av dosen av quercetin (fig. 2A).
