Abstract
Menneskelig ABCG2, et medlem av ATP-bindende kassett transporter super, spiller en nøkkelrolle i multiresistens og beskytter kreftstamceller . ABCG2-knockout hadde ingen tydelig ugunstig effekt på utvikling, biokjemi, og levetiden til mus. Dermed er ABCG2 en interessant og lovende mål for utvikling av chemo-sensibiliserende midler for bedre behandling av medikamentresistente kreftformer og for å eliminere kreftstamceller. Tidligere rapporterte vi en ny to-modus virkende ABCG2 inhibitor, PZ-39, som induserer ABCG2 degradering i tillegg til å hemme sin aktivitet. I dette manuskriptet, rapporterer vi våre siste fremskritt i å identifisere to ulike grupper av ABCG2 hemmere med en hemme bare ABCG2 funksjon (statisk) og den andre induserer ABCG2 nedbrytning i lysosome i tillegg til å hemme funksjonen (dynamisk). Dermed kan inhibitor-induced ABCG2 degradering være mer vanlig enn vi tidligere har antatt, og videre undersøkelser av de dynamiske hemmere som induserer ABCG2 degradering kan gi en mer effektiv måte å sensibiliserende ABCG2-mediert MDR i kreft kjemoterapi.
Citation : Peng H, Qi J, Dong Z, Zhang JT (2010) Dynamic
vs
Statisk ABCG2 hemmere å bevisstgjøre Drug Resistant kreftceller. PLoS ONE 5 (12): e15276. doi: 10,1371 /journal.pone.0015276
Redaktør: Wenqing Xu, University of Washington, USA
mottatt: 21 september 2010; Godkjent: 03.11.2010; Publisert: 07.12.2010
Copyright: © 2010 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gir CA113384 og CA120221 (JTZ) og av en Showalter Foundation stipend (ZD). Jing Qi er en mottaker av det amerikanske forsvarsdepartementet Breast Cancer Research Program postdoktorstipend. Hui Peng støttes delvis av NNSF av Kinas stipend Antall 30873083. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser : forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ABCG2 er medlem av ATP-bindende kassett (ABC) transporter super og over-uttrykk for ABCG2 har vist seg å føre til. multiresistens (MDR) i modellen kreftcellelinjer og å korrelere med dårlig prognose i både voksne og barn leukemi og brystkreftpasienter (for se [1], [2], [3]). I motsetning til de fleste andre medlemmer av ABC-transportør superfamilien som P-glykoprotein (MDR1 /ABCB1), ABCG2 betraktes som en halv transportør som består av en nukleotid-bindende domene (NBD) ved aminoenden og en membran-dekkende domene (MSD) hos karboksylenden. Det har således vært antatt å eksistere og funksjon som en homo-dimer. Imidlertid nyere bevis viser at ABCG2 kan eksistere og funksjon som en høyere orden av oligomer bestående av 8-12 identiske subenheter [4], [5] og oligomerisering steder er sannsynlig lokalisert i MSD [6].
i prosessen med sikte på å sensitivisere MDR formidlet av ABCG2, en rekke ABCG2-inhibitorer er nylig blitt oppdaget [7], [8], [9], [10], [11], [12] i tillegg til de tidligere identifiserte seg som Fumitremorgin C (FTC) (for en oversikt se [2]). En av disse ABCG2 inhibitorer, PZ-39, var meget effektiv og særegne fra andre, for eksempel FTC med evnen til å forårsake lysosom-avhengig nedbrytning av ABCG2 protein [7].
For å kunne fastslå om-hemmerindusert ABCG2 degradering er unik for PZ-39, testet vi andre ABCG2 hemmere som genereres under innledende screening som førte til identifisering av PZ-39. Vi fant to typer ABCG2 hemmere med en hemmende ABCG2 aktivitet bare (statisk) og den andre hemme ABCG2 aktivitet samt indusere ABCG2 degradering via lysosome (dynamisk). Disse funnene tyder på at inhibitor-induced ABCG2 nedbrytning i lysosome kan være mer vanlig enn det tidligere har vært antatt og videre undersøke de dynamiske hemmere som induserer ABCG2 nedbrytning i lysosome kan gi en mer effektiv måte å sensibiliserende ABCG2-mediert MDR i kreft kjemoterapi.
Resultater
To typer ABCG2 hemmere
Tidligere rapporterte vi at den rasjonelle screening av representanter for ulike typer sammensatte bibliotek fra Specs (www.specs.net) førte til identifikasjon av en to-modus virkende ABCG2 inhibitor PZ-39 [7]. Under den innledende screening, flere andre ABCG2-inhibitorer, som er strukturelt forskjellig fra PZ-39 og dets derivater (Fig. 1), ble også identifisert og deres aktivitet til å inhibere ABCG2 formidlet medisin effluks er blitt bekreftet ved bruk av HEK293-celler med overekspresjon ektopisk ABCG2 (HEK293 /ABCG2) (fig. 2A). For å finne ut om disse hemmere også besitter to-modus fungerende eiendom, må vi først testet effekten av disse hemmere på ABCG2 uttrykk ved hjelp av Western blot analyse. Som vist på fig. 2B, tre av de fire nye inhibitorer (PZ-8, 34, og 38) sammen med PZ-39 inhiberer ekspresjon ABCG2 mens PZ-16 ikke gjør det. Sammen med vår tidligere funn at FTC hemmer bare ABCG2 aktivitet [7], konkluderer vi med at det er sannsynlig to typer ABCG2 hemmere med en hemmende bare ABCG2 aktivitet mens den andre hemme både aktivitet og uttrykk av ABCG2.
de kjemiske strukturer er vist for PZ-8, (12E)-N»-((5-(3,4-dihydro-4-oxo-3-phenylquinazolin-2-ylthio)furan-2-yl)methylene)-2-(4-ethylphenoxy)acetohydrazide; PZ-16, 2- (4- (4-nitrofenoksy) fenyl) -2-oxoethyl2- (2- (4- klor- benzamido) acetamido) acetat; PZ-34, (E) -2- (4-etoksyfenyl) -N «- (1- (4- (furan-2-karboksamido) fenyl) etyliden) kinolin-4-karbohydrazid; PZ-38, (N-(2,5-dimethoxyphenyl)-2-({4-[4-(dimethylamino)benzylidene]-5-oxo-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl}sulfanyl)acetamide); og PZ-39 (N- (4-klorfenyl) -2 – [(6 – {[4,6-di (4- morfolinyl) -1,3,5- triazin-2-yl] amino} -1,3 benzotiazol-2-yl) sulfanyl] acetamid).
A, mitoksantron akkumulering. HEK293 /ABCG2-celler ble inkubert med mitoxantron i 30 minutter i nærvær av DMSO (tynn linje) eller 10 pM PZ forbindelser (tykk linje), etterfulgt av FACS-analyse av mitoxantron nivå. B, ABCG2 uttrykk. HEK293 /ABCG2-celler ble inkubert med 3,3 uM PZ forbindelser eller DMSO kontroll i forskjellige tidsrom, etterfulgt av samling av celler og Western blot-analyse av ABCG2 probet med monoklonale antistoff BXP-21.
Undertrykkelse av ABCG2 ekspresjon av den kjente og eksisterende ABCG2 hemmere
resultatene ovenfor tyder på at inhibitor-indusert undertrykkelse av ABCG2 uttrykk kan være mer vanlig enn forventet. For ytterligere å teste denne muligheten, undersøkte vi effekten av to andre publiserte ABCG2 inhibitorer (NSC-168201 og NSC-120668) [12] på ABCG2 ekspresjon ved hjelp av Western blot-analyse. Som vist på fig. 3A, både NSC-168201 og NSC-120668 effektivt undertrykke ABCG2 uttrykk. Imidlertid styre ABCG2 inhibitor FTC ikke, men alle tre inhibitorer effektivt forbedre mitoksantron akkumulering i HEK293 /ABCG2 cellelinjer (Fig. 3B). Derfor konkluderer vi at inhibitor-indusert undertrykkelse av ABCG2 uttrykk kan være mer vanlig enn det har vært forventet, og det er muligens to grupper av ABCG2 hemmere.
A, ABCG2 uttrykk. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med 10 pM av hver av de kjente inhibitorene ABCG2 NSC-168201, NSC-120668, eller FTC i forskjellige tidsrom, etterfulgt av Western blot-analyse av ABCG2 uttrykk probet med monoklonale antistoff BXP-21. B, mitoksantron akkumulering. HEK293 /ABCG2-celler ble inkubert med mitoxantron i 30 minutter i nærvær av DMSO (tynn linje), eller 10 uM NSC-168201, NSC-120668, eller FTC (tykk linje), fulgt av FACS-analyse av intracellulær mitoksantron nivå.
Spesifikk effekt av PZ-34 og PZ-38 på ABCG2-mediert mitoxantrone utstrømning
for ytterligere å undersøke om disse nye hemmere undertrykke ABCG2 uttrykk ved å fremkalle ABCG2 nedbrytning i lysosome, valgte vi å fokusere på PZ -34 og PZ-38 og uroppført en detaljert analyse av deres effekt på akkumulering av legemidlet. Som vist på fig. 4A, både PZ-34 og PZ-38 på ~4 mikrometer øke mitoxantrone opphopning til en lignende grad som de veletablerte ABCG2 inhibitor FTC i HEK293 /ABCG2 celler. Disse forbindelser har imidlertid ingen signifikant effekt på mitoksantron akkumulering i kontrollcellene-transfektert med vektor (HEK293 /Vec), hvilket indikerer at effekten av PZ-34 og PZ-38 på mitoksantron opphopning er sannsynlig via inhibering ABCG2. Vi testet deretter doseresponsen PZ-34 og PZ-38 til å inhibere ABCG2-mediert mitoksantron utstrømning i HEK293 /ABCG2 celler ved hjelp av strømningscytometri. Som vist på fig. 4B, er det intracellulære nivå mitoksantron mye mindre i HEK293 /ABCG2-celler sammenlignet med HEK293 /Vec celler på grunn av ABCG2-mediert effluks. Tilsetning av PZ-34 og PZ-38 øker den intracellulære akkumuleringen av mitoxantron i en doseavhengig måte tilsvarende som FTC.
A, mitoksantron akkumulering. HEK293 /vec eller HEK293 /ABCG2-celler ble inkubert med mitoxantron i 30 minutter i nærvær av DMSO kontroll, eller 3 uM PZ-34, PZ-38 eller FTC kontroll. Dataene er midler ± SD fra tre uavhengige forsøk. B, dose respons av PZ-34, PZ-38, og FTC kontroll i å gjenopprette mitoxantrone akkumulering i HEK293 /ABCG2 celler. Den tykke linjen viser nivået av mitoxantron akkumulering i HEK293 /VEC-celler, som fungerer som en maksimal akkumulering kontroll. C, effekt på ABCB1 og ABCC1-mediert Adriamycin utstrømming. HEK293 celler med ABCC1 over-ekspresjon (HEK293 /ABCC1) og BC19 celler med ABCB1 over-ekspresjon ble inkubert med Adriamycin i fravær (grått område) eller nærvær (stiplet linje) av 3,8 uM PZ-34 eller PZ-38 etterfulgt av FACS analyse. Den tykke linjen viser det høyeste nivået av akkumulering i celler transfektert med vektor kontroll. D, effekt på ABCB1 og ABCC1 uttrykk. HEK293 /ABCC1 og BC19 celler med ABCB1 over-uttrykk ble behandlet med 10 mm PZ-34 eller PZ-38 for 3 dager etterfulgt av Western blot analyse av ABCB1 bruker monoklonalt antistoff C219 og ABCC1 bruker monoklonalt antistoff MRPr1. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
For å bestemme spesifisiteten av PZ-34 og PZ-38, testet vi deres effekt på legemiddelutstrømningen formidlet av to andre ABC transportører som er kjent for å forårsake MDR, ABCB1 og ABCC1, bruker MCF7 celler-transfektert med ABCB1 (BC19) [13] og HEK293 celler-transfektert med ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [14], [15]. Men vi fant ingen effekt av disse forbindelsene på aktiviteten av ABCB1 og ABCC1 i synkende Adriamycin akkumulering (fig. 4C). Både PZ-34 og PZ-38 heller ikke påvirke uttrykket av ABCB1 og ABCC1 (fig. 4D). Således kan PZ-34 og PZ-38 er spesifikke for ABCG2 og har ingen innvirkning på legemiddelavgivelsen mediert av to andre viktige ABC-transportører.
Effekt av PZ-34 og PZ-38 på ABCG2-mediert multiresistens
for å finne ut om både PZ-34 og PZ-38 har evnen til å bevisstgjøre ABCG2-mediert legemiddelresistens, vi utførte analyser av effekten av disse forbindelsene på overlevelse av HEK293 /ABCG2 celler i fravær eller nærvær av mitoxantrone . Som vist på fig. 5A, både PZ-34 og PZ-38 alene har ingen effekt på overlevelsen av HEK293 /ABCG2 celler ved konsentrasjoner mindre enn 10 ug /ml. Deres IC
50 ble anslått til å være ~12.9 og ved 20 uM, henholdsvis (tabell 1). Således, både PZ-34 og PZ-38 har liten cytotoksisitet til HEK293 /ABCG2 celler ved konsentrasjoner mindre enn 10 uM, noe som tyder på at de ikke kan virke på andre essensielle molekyler med høy affinitet for celleoverlevelse.
, styrken på PZ-34 og PZ-38 i rygging mitoxantrone motstand. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med eller uten 0,1 mM (IC
10) mitoxantron i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PZ-34 eller PZ-38 etterfulgt av SRB-analysen. B, allergi indeks over PZ-34 og PZ-38 i HEK293 /ABCG2 celler. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av mitoxantron i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PZ-34 eller PZ-38 etterfulgt av SRB-analysen. C og D, allergi indeks over PZ-34 og PZ-38 i narkotika valgt MCF7- /AdVp3000 celler. MCF7 /AdVp3000-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av mitoxantron (C), eller Adriamycin (D) i nærvær av DMSO (kjøretøy) eller 500 nM av PZ-34 og PZ-38 etterfulgt av MTT-analyse. Sensibilisering indeksen ble beregnet ved hjelp av IC
50 av anticancermedikamenter i fravær eller nærvær av PZ-34, PZ-38, eller FTC. Dataene som vises, er gjennomsnittet ± SD for tre uavhengige eksperimenter.
bestemmes ved virkningen av PZ-34 og PZ-38 på sensibiliserende cellulær respons til 0,1 uM mitoxantron som alene produserer mindre enn 10% hemning av vekst av HEK293 /ABCG2 celler. Som vist på fig. 5A, både PZ-34 og PZ-38 ved et lavt konsentrasjonsområde sensibilisere disse cellene til mitoxantron. Ved omtrent 1,2 uM, både PZ-34 og PZ-38 hjelpe til 0,1 uM mitoksantron for fullstendig å hemme cellevekst. IC
50 av PZ-34 og PZ-38 i sensibiliserende mitoksantron resistens ble beregnet til å være 71 og 45 nM (tabell 1). Vi har også testet PZ-8 og PZ-16 og funnet at de IC
50 av disse forbindelsene alene er -20 uM og deres IC
50 i sensibiliserende mitoksantron motstand fra MCF7 /AdVp3000 celler er ~80 og ~70 nM hhv. IC
50 av FTC i sensibiliserende mitoksantron motstand, på den annen side er mye høyere ved 326 nM (tabell 1).
Deretter undersøkte vi doseresponsen PZ-34 og PZ-38 i sensibiliserende ABCG2-mediert mitoxantrone motstand ved hjelp av HEK293 /ABCG2 celler. Som vist på fig. 5B, IC
50 av mitoxantron reduseres dramatisk i nærvær av PZ-34 og PZ-38. Ved 50 nM, PZ-34 og PZ-38 betydelig grad redusere IC
50 av mitoxantron med en sensibilisering indeks på 1,6 og 2,2, henholdsvis (tabell 2). Ved 500 nm, sensibilisering indeks av PZ-34 og PZ-38 er 8,7 og 14,3, henholdsvis (tabell 2). På den annen side er det sensibilisering indeks av FTC på 500 nM bare 3,9 (tabell 2). Disse resultatene viser at PZ-34 og PZ-38 er svært potente nye ABCG2 hemmere.
For ytterligere å undersøke om PZ-34 og PZ-38 kan reversere ABCG2-mediert MDR i en narkotika-resistente kreftcelle linjen, vi brukt stoffet valgte brystkreft cellelinje MCF7 /AdVp3000 som over-uttrykker ABCG2 og testet en ekstra kreft narkotika substrat av ABCG2, Adriamycin. Som vist på fig. 5C, både PZ-34 og PZ-38 på 500 Nm drastisk redusere motstanden MCF7- /AdVp3000 både Adriamycin og mitoxantrone.
PZ-34 og PZ-38 påvirker ikke ABCG2 oligomeriseringsprosessen
Tidligere har det vist seg at ABCG2 kan eksistere og funksjon som en homo-oligomer [4], [6]. For å undersøke om PZ-34 og PZ-38 muligens hemme ABCG2 oligomerisering, co-immunutfelling av to differensielt kodet ABCG2 ble utført som tidligere beskrevet [4] etter en 6-timers behandling med PZ-34 og PZ-38 ved 3,3 pM. Imidlertid ble ingen effekt av PZ-34 og PZ-38 på ABCG2 co-immunutfelling funnet (se supplerende fig. S1), noe som tyder på at PZ-34 og PZ-38, i likhet med PZ-39 [7], ikke kan påvirke ABCG2 oligomeriseringsprosessen. Imidlertid, på grunn av begrensningen av ko-immunoutfelling, kan disse inhibitorer påvirke dimerisering som ikke kan avdekkes ved ko-immunutfelling på grunn av eksistensen av minst 3 forskjellige interaksjons områder av den oligomere ABCG2 [4], [6].
Effekt av PZ-34 og PZ-38 på halveringstiden til ABCG2
Som diskutert ovenfor, både PZ-34 og PZ-38 trykkes ABCG2 ekspresjon (fig. 2). For å utelukke muligheten for at dette undertrykkelse skyldes hemming av genekspresjon, utførte vi real time RT-PCR-analyse. Som vist på fig. S2, på steady state nivåer av ABCG2 mRNA er den samme mellom kontroll- og sammensatte behandlingsgrupper, og dermed eliminere muligheten for at disse forbindelsene påvirker transkripsjon eller stabiliteten til ABCG2 mRNA.
For å finne ut om den undertrykte uttrykk for ABCG2 er på grunn av inhibitor-indusert degradering som vi tidligere er observert med PZ-39 [7], undersøkte vi effekten av PZ-34 og PZ-38 på halveringstiden til ABCG2 i HEK293 /ABCG2 celler ved forbehandling av cellene med sykloheksimid, som hindrer forlengelse i løpet av proteinsyntese, fulgt av behandling med PZ-34 og PZ-38 i forskjellige tidsrom. Som vist på fig. 6A, tap av ABCG2 i celler behandlet med en kombinasjon av cykloheksimid og PZ-34 eller PZ-38 er mye raskere enn den for kontrollbehandling med DMSO kjøretøy eller FTC kontroll. Halveringstiden av ABCG2 i nærvær av PZ-34 og PZ-38 er beregnet til å være ~8 timer, mens det er stabilt med en beregnet halveringstid mer enn 60 timer i kontroll behandling med FTC eller DMSO (Fig. 6B ). Således PZ-34 og PZ-38 akselererer sannsynligvis nedbrytning av ABCG2 protein på samme måte som PZ-39 [7].
A, Western blot-analyse. HEK293 /ABCG2 celler ble først behandlet med 5 pg /ml cykloheksimid (CHX), etterfulgt av tilsetning av 3 uM av PZ-34, PZ-38, FTC, eller DMSO kontroll i forskjellige tidsrom. Cellene ble deretter høstet for Western blot-analyse av ABCG2 probet med monoklonale antistoff BXP-21. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. B, halveringstid på ABCG2. ABCG2 nivåer på Western blot som vist i panel A ble bestemt ved hjelp av Scion Bilde og plottet mot tiden for behandling. Viste data er gjennomsnitt ± SD av tre forsøk.
PZ-34 og PZ-38 indusere ABCG2 nedbrytning i lysosome
Det har blitt rapportert tidligere at villtype og riktig-brettet ABCG2 proteiner nedbrytes i lysosomet, mens den muterte og misfoldede proteiner er involvert i ubiquitin-formidlet nedbrytning i proteasomet [16]. I tillegg fant vi tidligere at PZ-39 fører ABCG2 degradering via lysosome-mediert degradering [7]. For å finne ut om PZ-34 og PZ-38 årsaken ABCG2 degradering via lysosome eller proteasome, brukte vi bafilomycin A
1, en hemmer av protein nedbrytning i lysosome, og MG-132, en proteasominhibitor som tidligere beskrevet [7]. Som vist på fig. 7A, forbehandling av celler med bafilomycin A
1 inhiberer PZ-34 og PZ-38-induserte ABCG2 nedbrytning mens forbehandling med MG-132 ikke. Dermed sannsynlig PZ-34 og PZ-38 også indusere ABCG2 nedbrytning i lysosome, samme som PZ-39 [7].
A, ABCG2 degradering i lysosomer. HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med 3 uM av PZ-34 eller PZ-38 i fravær eller nærvær av 10 nM bafilomycin A
1 (BMA1) eller 2 uM MG-132 i forskjellige tidsrom. Cellene ble deretter høstet for Western blot-analyse av ABCG2 uttrykk probet med monoklonale antistoff BXP-21. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. B, ABCG2 konformasjonsendringer. HEK293 /ABCG2 og MCF7 /AdVp3000-celler ble behandlet med 10 pM av PZ-34, PZ-38 eller DMSO bærerkontroll, etterfulgt av farging med monoklonalt antistoff 5D3 og FACS-analyse. Arrowhead indikere PZ-34 og PZ-38 behandlede grupper.
PZ-34 og PZ-38 bind til ABCG2
Det har blitt rapportert tidligere at monoklonalt antistoff 5D3 binder seg til ABCG2 på celleoverflaten lettere ved bindingen av inhibitorer til ABCG2 muligens på grunn av inhibitor-induserte konformasjonsendringer av ABCG2 [7], [12], [17]. For å bestemme om PZ-34 og PZ-38 potensielt bindes til ABCG2, utførte vi farging analyser av ABCG2 ved hjelp 5D3 i nærvær eller fravær av PZ-34 og PZ-38. Som vist på fig. 7B, både PZ-34 og PZ-38 føre til en økning i 5D3 farging i begge MCF7 /AdVp3000 og HEK293 /ABCG2 celler, noe som indikerer at både PZ-34 og PZ-38 kan bindes til ABCG2 og bindings fører til konformasjonsendring av ABCG2.
Diskusjoner
i denne studien, viser vi at det er muligens to grupper av ABCG2 hemmere og-hemmerindusert ABCG2 nedbrytning i lysosome kan være mer vanlig enn tidligere antatt. Vi viser også at PZ-34 og PZ-38 er potente inhibitorer ABCG2. Selv om PZ-34 og PZ-38 er strukturelt forskjellige fra tidligere identifisert ABCG2 inhibitor, PZ-39, de synes å ha lignende virkningsmekanisme ved å hemme ABCG2 funksjon og ved å akselerere ABCG2 nedbrytning i lysosome.
Blant mange ABCG2 hemmere tidligere identifisert, noen er kjent for å være spesifikke for ABCG2 og ingen har blitt undersøkt for å vise om de kunne akselerere ABCG2 nedbrytning i lysosome. I denne og våre tidligere studier [7], fant vi at FTC ikke påvirker ABCG2 uttrykk mens både NSC-168201 og NSC-120668 gjorde. I de fire nye ABCG2 inhibitorer (PZ-8, 16, 34, og 38) ble testet i denne undersøkelsen, tre undertrykkes ABCG2 uttrykk, mens den andre ikke gjorde. Til sammen mener vi at det er to grupper av ABCG2 hemmere med en hemmende bare ABCG2 aktivitet og den andre også undertrykke ABCG2 degradering i tillegg til å hemme ABCG2 funksjon. Vi kaller disse hemmere som statiske og dynamiske hemmere, henholdsvis.
Det er foreløpig ukjent hva grunnleggende forskjeller mellom disse to gruppene av hemmere føre til en forskjell i deres virkningsmekanisme. Det er, imidlertid, fristende å spekulere i at de binder seg til to forskjellige steder på ABCG2. Binding til enten området vil føre til konformasjonsforandringer endringer av ABCG2 som fører til hemming av ABCG2 aktivitet. Men binding til et av nettstedene vil også legge til rette ABCG2 endocytose og degradering i lysosome. Endringen av ABCG2 konformasjon av PZ-34 og PZ-38 påvises ved hjelp av monoklonalt antistoff 5D3 antyder at PZ-34 og PZ-38 direkte bindes til ABCG2 selv om deres bindingssteder er foreløpig ukjent. Siden FTC fører også konformasjonsendring men ikke akselerere ABCG2 degradering, PZ-34 og PZ-38 trolig ikke binde til lignende nettsted som FTC. Tidligere har det vist seg at agonist-binding akselerert endocytose og degradering av β
2-adrenerg reseptor i lysosomet [18], støtter hypotesen ovenfor. Selv usannsynlig, er det også mulig at de dynamiske ABCG2 hemmere kan ha off-target effekt som aktiverer oppstrøms trasé som er involvert i ABCG2 degradering. Uansett, disse mulighetene må testes i fremtidige fordypning.
Tidligere har det vist seg at ABCG2 nedbrytning skjer hovedsakelig via to ulike mekanismer. Selv om korrekt foldet villtype ABCG2 er hovedsakelig nedbrutt via lysosomet [16] blir de mutante proteinene brytes ned av proteasomet via en kvalitetskontroll mekanisme [16], [19], [20]. Det ser ut til at kvaliteten styremekanismen skjer på ER rett etter syntesen av ABCG2 og normal nedbrytning av vill-type proteinene kan skje gjennom endocytose av ABCG2 fra plasmamembraner. Foreløpig er det ennå ikke kjent om den dynamiske-hemmerindusert nedbrytning av ABCG2 skjer ved menneskehandel til lysosome fra plasmamembraner via endocytose og /eller fra ER membraner umiddelbart etter deres syntese.
Selv om det er foreløpig ukjent om PZ -34 og PZ-38 er spesifikke for ABCG2, viser våre resultater at de ikke påvirker ABCB1 og ABCC1 funksjon og uttrykk. Således PZ-34 og PZ-38 er mer spesifikke for ABCG2 enn noen av de tidligere identifiserte ABCG2-inhibitorer, for eksempel den kjente ABCG2 inhibitor GF120918 som ser ut til å hemme ABCB1 og /eller ABCC1 like godt [2], [21]. Vi har også funnet at både PZ-34 og PZ-38 ikke er cytotoksisk med en konsentrasjon opp til 10 ug /ml, noe som tyder på at disse ABCG2 inhibitorene sannsynligvis ikke binde seg til og inhibere andre cellulære proteiner med høy affinitet som er avgjørende for cellulær overlevelse. Men flere studier for å undersøke spesifisiteten av PZ-34 og PZ-38 og for å avgjøre om de binder seg til og hemme andre medlemmer av den menneskelige ABC transporter familie.
Det faktum at PZ-34 og PZ -38 har ingen cytotoksisitet til HEK293-celler ved konsentrasjoner mindre enn 10 um og kan effektivt reversere MDR antyder at vinduet av terapeutiske indeks av disse forbindelsene er store. En ideell chemo-sensitive er at det ikke skal være giftig i seg selv. Åpenbart PZ-34 og PZ-38 tilfredsstille dette kravet i in-vitro studier. Det er imidlertid ikke kjent om disse forbindelsene er giftige og effektive for å snu MDR in vivo, som må vurderes i fremtidige studier med dyremodeller.
Materialer og metoder
Material
monoklonalt antistoff BXP-21 mot ABCG2, anti-mYC og anti-HA-antistoffer var fra ID Labs, Cell Signaling og Roche, henholdsvis. Monoklonalt antistoff C219 og MRPr1 ble kjøpt fra Kamiya Biomedical Company. Biotin-konjugert 5D3 antistoff og Phycoerythrin-Streptavidin konjugater var fra eBiosciences. Alle elektroforese reagenser, proteinkonsentrasjon analysesett, og polyvinylidendifluorid-membraner ble anskaffet fra Bio-Rad. FTC, Adriamycin, mitoksantron, kamptotecin, ditiotreitol, sulforodamin B (SRB), og Triton X-100 var fra Sigma. Forbindelser PZ-8, PZ-16, PZ-34, PZ-38, og PZ-39 ble kjøpt fra spesifikasjoner. NSC-168201 og NSC-120668 var gaver fra National Cancer Institute. Protein-G PLUS-Agarose og SYBR Grønn PCR Master Mix var fra Santa Cruz Biotechnology og Applied Biosystems, henholdsvis. LipofectAMINE Plus og G418 var fra Invitrogen. Cellekulturmedium IMEM og DMEM var fra Biosource International og Media Tech, henholdsvis. Alle andre kjemikalier var av molekylærbiologiske karakterer fra Sigma eller Fisher Scientific.
Cell kultur, behandlinger og lysat forberedelser
Menneskelig brystkreft cellelinje MCF7 og dens avledede linjer BC19 (en gave fra Julie Horton ved National Institute of Environmental Health Sciences) og MCF7- /AdVp3000 (en gave fra Susan Bates ved National Cancer Institute), HEK293 /ABCC1 [14], HEK293 /vektor [14], HEK293 /ABCG2 [4] ble dyrket som beskrevet tidligere [ ,,,0],4], [13], [14], [22]. For analyse av ABCG2 degradering, ble HEK293 /ABCG2 celler først behandlet med 10 nM bafilomycin A
1 eller 2 uM MG132 i 24 timer, etterfulgt av behandling med 3 uM PZ-34 eller PZ-38 i forskjellige tidsrom og samling av cellelysater . For bestemmelse av ABCG2 halveringstid, ble HEK293 /ABCG2-celler ble behandlet med 5 pg /ml sykloheksimid, 3 uM PZ-34 eller PZ-38 i forskjellige tidsrom, etterfulgt av samling av celler. Lysat fremstillingen ble utført som beskrevet tidligere [22].
Western blot, immunopresipitering, og FACS-analyser
Western blot, immunopresipitering, og FACS analyse av medikament akkumulering ble utført nøyaktig som vi tidligere beskrevet [ ,,,0],4], [6]. For å bestemme konformasjonsendring av ABCG2 etter behandling med ABCG2 inhibitorer, ble HEK293 /ABCG2 celler inkubert med 10 pM PZ-34 eller PZ-38 ved 37 ° C i 30 minutter før inkubering med biotin-konjugert antistoff 5D3 (1:100 fortynning) i 2 timer. Cellene ble deretter vasket 3 ganger og inkubert med Phycoerythrin-streptavidin i 30 minutter etterfulgt av vasking og analyse ved hjelp av FACS.
Cytotoksisitet assay
Cytotoksisitet ble bestemt ved anvendelse av SRB og MTT-analyser som beskrevet tidligere [ ,,,0],6], [22], [23]. Effekten av ABCG2 inhibitorer på legemiddelresistens ble bestemt ved å eksponere cellene til en rekke konsentrasjoner av anticancer legemidler i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner av ABCG2 inhibitorer. Styrken og allergi indeks over ABCG2 hemmere ble beregnet som følger:
Real time RT-PCR
RNA ekstraksjon og real-time RT-PCR ble utført som vi beskrev tidligere [22]. Sekvensene til primerne er ABCG2 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 «(fremover) og 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (revers). Sekvensene til primerne er GAPDH 5»-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 «(fremover) og 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3» (revers). Den relative ABCG2 RNA-nivå (2
ΔCT) ble behandlet med inhibitorer ble uttrykt som prosent av kontrollen (i nærvær av 0,1% DMSO) hvor ΔCT (terskelsyklus) = (CT
ABCG2-CT
GAPDH ).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekt av PZ-34 og PZ-38 på ABCG2 dimerization /oligomeriseringsprosessen. HEK293-celler ko-transfektert med Myc- og HA-merket ABCG2 ble eksponert for 3,3 uM PZ-34, PZ-38 eller DMSO kontroll i 6 timer og cellelysatene ble underkastet immunoutfelling med anti-myc eller anti-HA-monoklonalt antistoff etterfulgt av western blot analyse undersøkt ved hjelp av anti-HA og anti-myc antistoffer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0015276.s001 plakater (JPG)
Figur S2.
Effekt av PZ-34 og PZ-38 på ABCG2 mRNA nivå. HEK293 /ABCG2 cellene behandlet med DMSO kjøretøy, PZ-34, eller PZ-38 i forskjellige tidsrom og innhøstet for RNA-fremstilling og sanntids RT-PCR-analyse. Viste data er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0015276.s002 plakater (JPG)
Takk
Vi takker Therapeutics Program Developmental på NCI for NSC forbindelser som brukes i denne studien.
