Abstract
Cortactin (CTTN), først identifisert som et viktig substrat for Src tyrosin kinase, deltar aktivt i forgrening F-aktin montering og i cellemotilitet og invasjon.
CTTN
gen forsterkes og dens protein er overuttrykt i flere typer kreft. Den fosforylerte form av cortactin (pTyr
421) er nødvendig for kreftcelle motilitet og invasjon. I denne studien, viser vi at et flertall av de testede primære kolorektal kreftprøver viser kraftig forbedret uttrykk for pTyr
421-CTTN, men ingen endring i mRNA nivå sammenlignet med friske personer, og dermed tyder post-translasjonell aktivering i stedet genamplifisering i disse svulstene. Curcumin (diferulolylmethane), en naturlig forbindelse med lovende chemopreventive og kjemosensibiliserende effekter, reduserte indirekte sammenslutning av cortactin med plasmamembranen proteinfraksjon i tykktarm adenokarcinomceller målt ved overflaten biotinylering, massespektrometri, og Western blotting. Curcumin signifikant redusert pTyr
421-CTTN i HCT116-celler og SW480-celler, men var ineffektiv i HT-29-celler. Curcumin fysisk interaksjon med PTPN1 tyrosin fosfataser å øke sin aktivitet og føre til defosforylering av pTyr
421-CTTN. PTPN1 hemming eliminert effekten av curcumin på pTyr
421-CTTN. Transduksjon med adenovirally-kodet CTTN økt migrasjon av HCT116, SW480, og HT-29. Curcumin redusert migrasjon av HCT116 og SW480 celler som svært uttrykkelig PTPN1, men ikke fra HT-29 celler med vesentlig nedsatt endogen uttrykk for PTPN1. Curcumin betydelig redusert fysisk interaksjon av CTTN og pTyr
421-CTTN med P120 catenin (CTNND1). Sammen er disse data tyder på at curcumin er en aktivator av PTPN1 og kan redusere cellemotilitet i tykktarmskreft via defosforylering av pTyr
421-CTTN som kan utnyttes for nye terapeutiske tilnærminger i tykktarm kreft terapi basert på tumor pTyr
421 -CTTN uttrykk
Citation. Radhakrishnan VM, Kojs P, Young G, Ramalingam R, Jagadish B, Mash EA, et al. (2014) pTyr
421 Cortactin Er overexpressed i Colon Cancer og Er dephosphorylated av Curcumin: Involvering av Non-reseptor type 1 proteintyrosinfosfatase (PTPN1). PLoS ONE 9 (1): e85796. doi: 10,1371 /journal.pone.0085796
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 22 august 2013; Godkjent: 02.12.2013; Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Radhakrishnan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Institutes Helse [5 R01 DK067286 til PRK og FKG]. NIH stipend, P30 CA 23074 [EAM] NIEHS gi ES006694 til Southwest Environmental Health Sciences Senter (SWEHSC), NIH /NCI tilskuddet CA023074 til Arizona Cancer Center og ved BIO5 Institute ved University of Arizona. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cortactin, kodet av
CTTN /EMS 1
genet, er en v-Src underlaget lokalisert med kortikale aktin på plasmamembranen og er overuttrykt i mange typer kreft [1]. Cortactin overekspresjon resultater fra 11q13.3 kromosomale regionen forsterkning i ulike kreftformer, som hode og nakke plateepitel karsinom, leverkreft, brystkreft og blærekreft, og korrelerer med dårlig pasient prognose og redusert overlevelse [2] – [5]. Cortactin, vanligvis til stede i flere forskjellige celletyper, er anriket på kortikale strukturer som membran ruffles og lamellipodia, og spiller nøkkelroller i filament-membranen interaksjoner såvel i transduse signaler fra celleoverflaten til cytoskjelettet [6], [7 ]. Cortactin deltar aktivt i Arp2 /3-mediert aktin polymerisasjon forbundet med plasmamembranen [7] og virker som en F-aktin modulator i tyrosin-kinase-regulert cytoskjelettet reorganisering [8] som tyder på en mekanisme for sin rolle i motilitet. Dens rolle i celle-migrering og invasjon er godt studert i epitelceller, fibroblaster, endotelceller, og brystkreftceller [8] – [10]. Fosforylering av murine cortactin på Tyr
421, Tyr
466 (Tyr
470 hos mennesker) og Tyr
482 (Tyr
486 hos mennesker) er nødvendig for effektiv cellemotilitet i flere celletyper Dette indikerer at cortactin tyrosinfosforylering spiller en viktig rolle i celle migrasjon [8], [11], [12]. Vanligvis tyrosinfosforylering av cortactin utløser rekruttering av SH2-domene proteiner, inkludert flere kinaser og NCK adapter protein NCK1, som knytter cortactin med Wiskott-Aldrich syndrom-lignende protein (Wasl, N-WASP) og var /Wasl samspill protein familiemedlem 1 (WIF1, WIP). Dette fører til økt aktivering av Arp2 /3-kompleks (aktin-relatert protein 2 homolog /3-homolog) og fører til aktin filament forgrening [13] -. [16]
En rekke epidemiologiske studier har vist at plantebasert fenoliske forbindelser i kosten agenter spiller viktige roller i chemoprevention av tykktarmskreft [17], den nest vanligste kreftformen hos menn og den tredje mest vanlig hos kvinner. Regelmessig inntak av frukt og grønnsaker som inneholder disse forbindelsene har vært forbundet med en redusert forekomst av tykktarmskreft [18]. Blant de naturlige bi-fenoliske forbindelser, curcumin, en curcuminoid fra rotstokk
curcuma longa
, er godt kjent for sin anti-kreft, og anti-inflammatorisk, antioksidant-aktivitet in vivo og in vitro [19] – [ ,,,0],21], og er godt tolerert i store doser. I en fase II studie med avansert kreft i bukspyttkjertelen pasienter ble en dose på 8 g administrert i 2 måneder med observert toksisitet [22]. En annen fase I klinisk studie evaluerte toleranse av curcumin på 25 individer med høy risiko forstadier til kreft. Histologiske forbedringer ble observert i syv av de 25 fagene, uten behandlingsrelatert toksisitet opptil 8 g /dag [23]. Anticancer effektene av curcumin og dets derivater har typisk blitt tilskrevet hemming av celleproliferasjon, cellesyklus-stans og /eller induksjon av apoptose [21], [24], [25]. En klinisk undersøkelse viste at administrering av doser på opp til 2,2 g
Curcuma
ekstrakt (som inneholder 180 mg curcumin) per dag i inntil fire måneder viste kliniske fordeler hos pasienter med avansert ildfast kolorektal kreft [26].
i denne studien, viser vi at pTyr
421 cortactin er overuttrykt i endetarmskreft uten samtidig endringer i mRNA nivåer. Curcumin redusert nivåene av pTyr
421 cortactin i tykktarm kreft celler
in vitro
av fysisk samspill med den ikke-reseptor type 1 protein tyrosin fosfatase (PTPN1; PTP1b) for å øke sin aktivitet, og dephosphorylate cortactin, og dermed redusere kreft celle migrasjon. Våre data tyder på potensiell nytte pTyr
421 cortactin farging som en biomarkør for invasiv kreft i tykktarmen og gi ytterligere innsikt i mekanismen for chemopreventive effektene av curcumin og dens potensielle rolle i å forebygge metastatisk kreft i tykktarmen.
Materialer og metoder
Reagenser
curcumin med 98,05% renhet og fri for forurensende curcuminoids (demetoksy-curcumin og bis-demetoksy curcumin), ble spesial renset ved ChromaDex (Irvine, California). PTPN1 inhibitor XXII (3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethyl-benzofuran-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-ylsulfamyl)-phenyl)-amide), en celle-permeabel, selektiv, reversibel, og en ikke-konkurrerende allosterisk inhibitor av PTPN1 [27] ble oppnådd fra EMD Millipore (Billerica, Massachusetts). Rekombinant adenovirus cortactin ble innhentet fra Vector Biolabs (Philadelphia, Pennsylvania).
Antistoffer, cellelinjer og menneskelig vev
T-84 celler (human kolorektal kreft) opprinnelig beskrevet av Murakami og Masui [28 ] ble gitt av Dr. Declan McCole, University of California San Diego, CA. HCT116, ble HT29 og SW480-celler oppnådd fra ATCC og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), 10% føtalt bovint serum (Cellgro, Manassas, VA), og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Grand Island, New York). Cellene ble dyrket i en 10 cm tallerken eller i seks brønners plater (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Mus monoklonalt anti-GAPDH, kanin polyklonalt fosfo-spesifikke (pTyr
421) cortactin antistoff, og anti-PTPN1 antistoff ble kjøpt fra EMD Millipore. Anti-mus-monoklonalt cortactin og anti-cortactin kanin polyklonale antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Bioteknologi, (Santa Cruz, CA). Mus monoklonalt anti-P120 catenin antistoff ble kjøpt fra BD Biosciences, (San Jose, California). Frosne menneskelige kolon vevsprøver og ikke-maligne vev ble hentet fra Cooperative menneskelig vev Network, Vanderbilt University Medical Center (Nashville, Tennessee). 44 prøver ble valgt på grunnlag av tumortype og prosentandelen av tumorcelleinnhold (mer enn 80%) sammen med 37 normale vev. Disse studiene ble evaluert ved University of Arizona mennesker Protection Program og dømt til å bli fritatt som prøvene ble avidentifisert.
QRT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp TRIZOL henhold til produsentens protokoll (Life Sciences). 500 ng av total RNA ble revers-transkribert ved anvendelse av en cDNA-syntesesett (Bio-Rad, Hercules, CA). QPCR ble utført med Taqman qPCR mix (Quanta biovitenskap, Gaithersburg, MD) og ferdige TAQMAN primere og prober (alt fra Applied Biosystems /Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll med iCycler CFX96 (Bio-Rad). QPCR målingen ble vurdert basert på den relative kvantifisering av CTTN genet normalisert til uttrykk av GAPDH. Dataene ble uttrykt som ΔCt verdier og Student t test ble brukt til å analysere dataene.
Immunohistochemistry
Kolorektalkreft vev rekke parafin innebygd prøvekjerner ble hentet fra USA Biomaks Inc (Rockville, MD). Phosphospecific anti-pTyr
421 cortactin og total cortactin antistoffer ble brukt til farging. Glassene ble deparaffinized, skylt med fosfatbufret saltvann (PBS; pH 7,4) og blokkert med geiteserum (Santa Cruz). De ble deretter inkubert med primære antistoffer i 4 timer ved 4 ° C. Platene ble vasket og deretter inkubert med geite-anti-kanin HRP-konjugert antistoff (Santa Cruz) ved romtemperatur i 1 time. Glassene ble utviklet med en DAB substrat kit (Vector Labs) og kontra med hematoksylin.
Celleoverflate- biotinylering
Apical celleoverflaten biotinylering ble utført som beskrevet tidligere [29]. Kort fortalt ble 2 × 10
5 T84 tykktarm kreft celler sådd på Transwell filtre (Corning Incorporated) og dyrket i 5 -7 dager til monolaget motstand kommet opp i minst 600 Ω
.CM
2. Cellene ble deretter behandlet med curcumin (50 uM) eller dimetylsulfoksyd (DMSO, kjøretøyet) ved den apikale side i 1 time. Overflateproteinene ble biotinylert ved å bruke 0,5 ml av NHS-S-S-biotin (Pierce; Rockford, IL) i PBS i 30 minutter ved 4 ° C ved den apikale side. Etter bråkjøling, ble filtrene skåret ut, og cellene ble lysert med 0,5 ml RIPA-lyseringsbuffer som inneholdt protease-inhibitorer og fosfatase (Halt-protease /fosfatase-inhibitor cocktail, Pierce). Lyserte prøver ble kort sonikert, sentrifugert ved 13.000 rpm i 10 min ved 4 ° C, og supernatanten ble samlet og anvendt for proteinanalyse og pull-down eksperimenter. Biotinylerte proteiner ble trukket ned med streptavidin-agarose-kuler (Pierce). Bundede proteiner ble eluert ved inkubering av perlene i radioimmunopresipitasjonsanalyse analysebuffer (RIPA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,42, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% Na-deoksykolat, protease og fosfatase-inhibitor cocktail, og fenylmetylsulfonylfluorid) ved 98 ° C i 5 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 10000 rpm i 5 minutter, og supernatanten ble fraskilt og blandet med 0,125 ml trikloreddiksyre (TCA), inkubert i 10 min på is og sentrifugert ved 14000 rpm i 5 min. Supernatantene ble kastet og pelletene ble vasket tre ganger med iskald aceton. Pelletene ble lufttørket og kvantifisert protein før den ble behandlet for MS-analyse. For immunoblotting ble proteinene separert ved SDS-PAGE, etterfulgt av immunblotting med anti-cortactin antistoff. Selv lasting av biotinylerte overflateproteiner ble bekreftet med geitepolyklonalt anti-transferrin reseptor-antistoff (Santa Cruz).
Protein identifikasjon ved kvadrupol tidspunktet for flyturen tandem massespektrometri (QTOF MS /MS)
Fire hundre nano g cellemembran-assosierte proteiner, oppnådd som beskrevet ovenfor, ble bearbeidet for tryptisk fordøyelse og analysert ved væskekromatografi-massespektrometri av Arizona Proteomics Consortium felles anlegg. QTOF MS /MS analyse av trypsin fordøyd proteiner ble utført ved hjelp av en kvadrupol time-of-flight massespektrometer (QTOF; Waters Q-TOF Premier, 2008). Peptidene ble eluert ved bruk av Vydac C18 (Hesperia, CA), ved bruk av en gradient av 0-65% oppløsningsmiddel (98% metanol /2% vann /0,5% maursyre /0,01% trifluoreddiksyre) i løpet av en 60-minutters periode ved en strømningshastighet på 350 nl /min. Peptidet Oppløsningen ble sprayet på et potensial på 1,6 kV, og den kapillære temperaturen ved 200 ° C. Avhengige data scanning ble utført ved Xcalibur v 2,0 SR2 programvare [30] med en standard kostnad på 2, en isolasjons bredde på 1,5 amu, en aktiverings amplitude på 35%, aktiveringstid på 30 msek, og et minimalt signal på 10,000 ion tellinger . Globale avhengige datainnstillinger var som følger: avviser masse bredde på 1,5 amu, dynamisk eksklusjon aktivert, antall gjentakelser av en, gjenta varighet på 1 min, og utelukkelse varighet på 5 min. Scan event serien inkluderte en full skanning med masse utvalg 350 – 2000 Da, etterfulgt av 3 avhengige MS /MS-skanninger av de mest intense ion. Dynamisk utelukkelse ble slått på for en periode på 60 sek. Tandem MS spektra av peptider ble analysert med Turbo SEQUEST ™ v 3.1, et program som gjør at korrelasjonen av eksperimentelle tandem MS-data med teoretiske spektra generert fra kjente proteinsekvenser. Søkekriteriene som ble brukt for en foreløpig positiv peptid identifikasjon er de samme som tidligere beskrevet, nemlig peptid forløperionene med en kostnad å ha en Xcorr 1,8, 2 Xcorr 2,5 og 3 Xcorr 3,5. En DCN poengsum 0,08 og et fragment ion forholdet mellom eksperimentell /theorical 50% ble også brukt som filtrering kriterier for pålitelig matchet peptid identifikasjon [31]. Alle passet peptidene ble bekreftet ved visuell undersøkelse av de spektra. Alle spektra ble søkt mot ipiHuman 3.72 protein database som har deri sekvensen til
Rhodobacter
og bovint serumalbumin. Vanligvis er bovint serumalbumin tilsatt som et referanse-protein, men siden bovint og humant serum albumin er lik, vi brukte T33V muterte sekvensen av
Rhodobacter
. Stillas (versjon Scaffold_3.1.2, Proteome Software Inc., Portland, OR) ble brukt til å validere MS /MS basert peptid og protein identifikasjoner. Peptide identifikasjoner ble akseptert hvis de kunne bli etablert på mer enn 90,0% sannsynlighet som angitt av Peptide profeten algoritme [30]. Protein identifikasjoner ble akseptert dersom de kunne bli etablert på mer enn 90,0% sannsynlighet og inneholdt minst ett peptid identifisert. Protein sannsynlig ble tildelt av Protein profeten algoritme [32]. Proteiner som inneholdt lignende peptider og kunne ikke bli differensiert basert på MS /MS-analyse alene ble gruppert for å tilfredsstille prinsippene for parsimoni.
Western blotting og immunoprecipitation
Proteinlysatene hentet fra tykktarm tumorvev og tykktarmskreft cellelinjer ble forberedt med RIPA buffer. De preklarede proteinprøver ble kvantifisert [DC (Detergent-kompatibel) kolo protein assay kit; Bio-Rad], og prøvene ble separert ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting. Blottene ble visualisert med SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Pierce). For immunoutfelling ble celler lysert med RIPA-buffer, og protein ble kvantifisert med en DC-proteinanalysesett (Bio-Rad). 5 ug av anti-pTyr
421 cortactin antistoff ble tilsatt til 1 mg av HCT-116 cellelysater ved 4 ° C og inkubert over natten. Prøvene ble deretter inkubert med A /G-protein-agarosekuler (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 1 time ved 4 ° C. Immunoblotting ble utført fra vasket og denaturert komplekser.
immunfluorescens
Celler ble dyrket i EZ-kameraer (Millipore), og behandlet med curcumin på 50 mikrometer konsentrasjon i 15 minutter og ble fikset med to % paraformaldehyd i 0,2 M fosfatbuffer, pH 7,4 (45 min), permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i PBS (10 min), og inkubert sekvensielt med anti-fosfo cortactin (Millipore) eller anti-cortactin antistoff (Santa Cruz) . Alexa Fluor 647 geit-anti-kanin-IgG, (Life Technologies) ble anvendt som sekundært antistoff. Platene ble montert med fluoresens montering medium (Dako, Carpinteria, CA) og ble undersøkt med et Zeiss konfokalmikroskop utstyrt med ZEN-programvare (Carl Zeiss Mikros, GmbH)
PTPB1B /PTPN1 aktivitetsanalyse
HCT 116-celler ble dyrket til konfluens og behandlet med curcumin eller DMSO (kjøretøy) i medier i 30 minutter. Cellene ble vasket med PBS og lysert med RIPA-buffer, behandlet med ultralyd i 5 sekunder, sentrifugert og analysert for proteinkonsentrasjon. En PTPB1B Assay kit ble hentet fra Millipore og brukes i henhold til produsentens instruksjoner.
Sekvensering av PTPN1 koding omegn
Total RNA ble ekstrahert fra HCT116, HT29, og SW480 celler ved hjelp TRIZOL (Life Technologies ) i henhold til produsentens instruksjoner, revers transkribert ved anvendelse av en cDNA-syntesesett (Quanta), og amplifisert ved hjelp av forover-primer, 5′-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCG-3 «og revers primer, 5′-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGA-3» (basert på Gene adkomstnr NM_002827.2 ) og
PFU
Taq DNA polymerase (Life Technologies). PCR-produktene ble renset på gel, subklonet inn pGEM-T Easy (Promega, CA), og sekvensert fra 5 «og 3» ender ved hjelp av T7 og SP6 sekvenseringsprimere.
Cell migrasjon analysen
transwell migrering assayet ble utført som tidligere rapportert [33] med mindre modifikasjoner. I korthet Transwell membran (24-brønns innsats, porestørrelse 8 pm, polykarbonat, Corning Inc, New York) ble benyttet for å bestemme virkningen av curcumin på tykktarmskreft cellemigrering
in vitro
. Cellene ble trypsinert, vasket, og holdt suspendert i medium uten FBS. Til de nedre brønnene i kamrene, migrering-induserende medium (med 10% FBS) ble tilsatt. De øvre brønner ble fylt med serumfritt medium med celler (20.000 celler per brønn), i noen tilfeller, også inneholdende 25 uM av curcumin. Deretter ble kammer anbragt i en fuktet CO
2 inkubator. Etter 12 timer, ble analyser stoppet ved fjerning av mediet fra de øvre brønnene og forsiktig fjerning av filtrene. Filteret ble fiksert med metanol ved kort neddykking og celler fra oversiden ble fjernet ved vasking med PBS. Filtrene ble farget med krystallfiolett farging (0,2%, vekt /volum med etanol 2%, volum /volum, i 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8) i 10 minutter ved romtemperatur. Den farget celle laget ble skyllet grundig med 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) tre ganger, Filtrene ble lufttørket, inkubert med 500 pl SDS-løsning (0,5% i 50% etanol, 50% 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8 ) i 60 minutter ved 37 ° C og avlest ved 586 nm ved anvendelse av et spektrofotometer (Molecular Devices, CA). For Ad-CTTN transduserte celler, 24 timer etter infeksjon med Ad-CTTN (10 MOI), ble cellene trypsinert, vasket med PBS, og tilsatt til oversiden av Transwell kammeret, og analysene ble utført som beskrevet ovenfor.
Kjemisk syntese av biotinylert curcumin
Reaksjonene ble utført ved bruk av flammetørket glass under et positivt trykk av argon. Hydroscopic løsemidler ble overført
via
en ovn-tørket sprøyte eller kanyle. Alle reagenser og oppløsningsmidler var kommersielt tilgjengelige og ble anvendt som mottatt. Løsninger ble konsentrert
i vakuum
ved anvendelse av en rotasjonsfordamper. Analytisk tynnsjiktkromatografi (TLC) ble utført på pre-belagte silikagel 60 F-254 glassplater. TLC-visualisering er nødvendig ved hjelp av en jod kammer, UV-lys, og /eller PMA-oppløsning (5 g fosformolybdensyre, 100 ml 95% EtOH) for farging. Flash-kromatografi og tyngdekraft ble utført ved bruk av silikagel 60 (230-400 mesh). Smeltepunkter er ukorrigerte. Kjernemagnetisk resonans (NMR) ble utført på et 500 MHz spektrometer. NMR spektra ble referert til CD
3OD (3,31 ppm, 49,0 ppm). Massespektrometri ble utført med ESI på en Bruker Daltonics MALDI TOF instrument.
N- (13-amino-4,7,10-trioxatridecanyl) biotinamide (2).
Til en varm løsning av biotin (0,24 g, 1,0 mmol) og
N
-hydroxysuccinamide (0,12 g, 1,0 mmol) i DMF (8 ml) ble det tilsatt DCC (0,26 g, 1,3 mmol), og reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved værelses temperatur. De faste stoffene ble fjernet ved filtrering, vasket med DMF (2 ml), og filtratet (-10 ml) tilsatt dråpevis til en omrørt oppløsning av 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanediamine (2,20 g, 10,0 mmol, 2,2 ml) i DMF (20 ml). Etter 3 timer ble løsningsmidlet fjernet under redusert trykk. Den resulterende olje ble utgnidd med eter (50 ml), og blandingen ble omrørt i 30 min. Det faste stoffet ble oppsamlet ved filtrering og underkastet flash-kolonnekromatografi på silikagel (50 g). Eluering med metanol /EtOAc (04:01) ga 2 (0,38 g, 0,85 mmol, 85% over to trinn) som et fargeløst, fast stoff, smp 104-106 ° C, R
f
0,36 ( MeOH /EtOAc /vandig. NH
4OH 08:02:01). Den
1 H og
13C NMR-spektrene var i samsvar med publiserte data [34].
5,21-Dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oic Syre (3).
Til en løsning av 2 (0,38 g, 0,85 mmol) i metanol (4 ml) ble det tilsatt glutarsyreanhydrid (0,12 g, 1,02 mmol) og blandingen ble omrørt over natten. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og residuet ble underkastet flash-kolonnekromatografi på silikagel (50 g). Eluering med CH
2 Cl
2 (200 ml) fulgt av CH
2 Cl
2 /MeOH (05:01) ga 3 (0,40 g, 0,71 mmol, 84%) som et hvitt, fast stoff, mp 124-126 ° C, R
f
0,42 (CH
2 Cl
2 /MeOH 1:01).
1 H NMR (500 MHz, CD
3OD) δ 1,44 (2, m), 1,56 til 1,70 (4, m), 1,70 til 1,78 (6, m), 1,88 (2, kvintett,
J
= 7,5 Hz), 2,18 til 2,25 (4, m), 2,32 (2, m), 2,70 (2, m), 2,93 (2, dd,
J
= 8 Hz, 5 Hz), 3,19 til 3,21 (2, m), 3,25 (4, t,
J
= 7 Hz), 3,52 (4, m), 3,59 (5, m), 3,64 (5, m) , 4,30 (1, m), 4,49 (1, m);
13C NMR (125 MHz, CD
3OD) δ 22,3, 26,8, 29,5, 29,7, 30,4, 34,2, 36,1, 36,8, 37,8, 41,0, 56,9, 61,26, 63,3, 69,9 (2), 71,2, 71,5 , 166,1, 175,2, 175,9, 176,8; HRMS (MALDI TOF) beregnet for C
25H
45N
4O
8S 561,2952, observert 561.2930.
4-((1E,6E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,5-dioxohepata-1,6-dien-1-yl)-2-methoxyphenyl-5,21-dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oate (4).
Til en oppløsning av 3 (100 mg, 0,18 mmol) i DMF (2 ml) ble det tilsatt
N
-hydroxysuccinamide (21 mg, 0,18 mmol) fulgt av DCC ( 48 mg, 0,23 mmol), og reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Faststoffene ble fjernet ved filtrering, vasket med DMF (2 ml), og filtratet (~4 ml) tilsatt dråpevis til en omrørt oppløsning av curcumin (330 mg, 0,89 mmol) og trietylamin (45 mg, 0,44 mmol, 62 ul) i DMF (10 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur, og flyktige forbindelser ble fjernet under redusert trykk. Resten ble underkastet flash kolonne kromatografi på silikagel (75 g). Eluering med CH
2 Cl
2 (200 ml) og CH
2 Cl
2 /MeOH (50:1, 200 ml) ga curcumin. Ytterligere eluering med CH
2 Cl
2 /MeOH (20:01), etterfulgt av fjerning av oppløsningsmidlene, ga 4 som en mørk gul gummi som ble oppløst i 20% acetonitril i vann og oppløsningen frysetørkes det. Biotinylert curcumin derivat 4 (78 mg, 0,085 mmol, 48% utbytte over to trinn) ble oppnådd som et fluffy mørkegult, fast stoff, R «em>
f
0,68 (CH
2 Cl
2 /MeOH 5:01). ESI-MS: 911,2 (M + H
+). Den
1 H NMR spekteret var i overensstemmelse med publiserte data [35].
Statistisk analyse
Uparet t-test ble brukt for statistisk analyse gjennom.
Resultater
pTyr
421cortactin uttrykk økes i primær tykktarm kreft vev
Overuttrykte cortactin er funnet i invasiv kreft, inkludert glioblastom, melanom, brystkreft, og hode og nakke plateepitel karsinom, som et resultat av genamplifisering EMS1 [36]. I denne studien undersøkte vi cortactin uttrykk i tykktarmskreft. Vi først analysert cortactin mRNA uttrykk i 81 frosne tykktarm vevsprøver, som omfattet 37 friske vev, 5 godartet, og 39 ondartede svulster, etter kvantitativ RT-PCR. Colontumorer og tilstøtende normale vev viste ingen forskjell i cortactin mRNA-ekspresjon (Fig 1 A). Vi observerte ingen signifikant forskjell mellom CTTN mRNA-ekspresjon i normalt vev og colon tumorprøver (figur 1B). Deretter undersøkte vi 19 matchet par av kolon vevsprøver for cortactin protein uttrykk ved western blot. 14/19 (73%) viste forhøyede nivåer av pTyr
421 cortactin og total cortactin (fig. 1C, venstre panel), 2/19 prøvene viste redusert ekspresjon av begge former (pTyr
421 og total) av cortactin og 3/19 viste ingen endring (data ikke vist). Immunhistokjemisk analyse av vev matriser med 6 normal seksjoner og 18 kolon tumorsnitt viste intens membranfarging av pTyr
421 cortactin og total cortactin i 13/18 tumorprøver analysert sammenlignet med normale vev seksjoner, som eksemplifisert i fig. 1D. Vi har også undersøkt cortactin fosforylering ved Tyr
482 og Tyr
470 i kolon tumorprøver. Vi fant at i 50% av de analyserte ondartet vev, det var en økt uttrykk for pTyr
482 sammenlignet med matchede kontroller (data ikke vist). Men fosforylering på dette området ble ikke påvirket av curcumin i HCT116-celler (ikke vist), og siden Oser et al [37]. viste at pTyr
482 ikke bidrar til regulering av antall gratis piggtråd ender i invadopodia, hadde vi ikke forfølge dette nettstedet videre. Vi klarte ikke å pålitelig analysere uttrykk for pTyr
470 i vevsprøver med noen kommersielt tilgjengelige antistoffer.
(A) Total RNA ble ekstrahert fra frosne prøver av normal og tumorvev og cortactin mRNA ble bestemt ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Boksplottene viser relative mengder cortactin normalisert til GAPDH i normale og tumorvev (n = 37 for normale prøver, n = 44 for tumorprøver). (B) DNA gel analyse av PCR-produkter som kommer fra qPCR analyse (på vegne av 37 normale vev, 5 godartede svulster, og 39 ondartede svulster). (C) Et vev lysater av tilpassede par (N-normal, M-maligne) av kolon prøver fremstilt fra de samme tumorprøver som i (A) ble analysert for ekspresjon av pTyr
421-cortactin (pTyr
421 -CTTN) og total cortactin ved Western blotting. Representative resultater er vist fra tre tilpassede par. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (D) Representant pTyr
421-cortactin og total cortactin farging av tykktarmskreftprøver. Tissue array som inneholder en serie av kolon karsinom ble farget for pTyr
421-CTTN og total cortactin. Farging var for det meste cytoplasma for total cortactin, mens pTyr
421-CTTN viser økt fargeintensitet på plasmamembranen.
Uoverensstemmelse mellom uforandret mRNA uttrykk og forhøyede nivåer av total og fosforylert cortactin utelukket muligheten for genamplifisering og foreslo mulig posttranslational modifikasjon (er) og endringer i proteinstabilitet i kolorektal tumorer.
endringer i celleoverflaten biotinylert proteiner etter curcumin behandling i T84 celler
T84 kolon kreftceller har vært mye brukt for å studere den biogenese av epitelceller polaritet [38] og danner godt polariserte og tette monosjikt når de dyrkes på en semi-permeabel filterstøtten. Vi undersøkte først fordelingen og virkningene av curcumin på de store membranassosierte proteiner i T84 monolag. For å reprodusere den eksponering til oralt administrert (eller kosttilskudd) curcumin ble celler behandlet med forbindelse eller DMSO (kjøretøy) på den apikale side. Den apikale membran og membran-assosierte proteiner ble så biotinylert, trukket ned med streptavidin-konjugert agarose, og analysert ved LC-MS /MS. Resultatene av disse forsøk er oppsummert i fig. 2. 56 proteiner ble identifisert ved LC-MS /MS. 13/56 viste redusert overflate eller overflatetilknyttet uttrykk som varierer fra 20-80% i curcumin-behandlede celler sammenlignet med DMSO kontroll (p 0.0001- p 0,05) (figur 2A). Bare ett protein [isoform en av leucine rik gjenta (i FLII) samspill protein 2, LRRFIP2) viste økt uttrykk (data ikke vist). Selv om funksjonen av LRRFIP2 er ikke helt klarlagt, har en rapport vist at det spiller en viktig rolle som en aktivator av den kanoniske Wnt signalveien, i forbindelse med segment polaritet protein i uorden homolog DVL-3, oppstrøms for β-catenin (CTNNB1) , som fører til stabilisering av sistnevnte forbindelse [39]. For formålet med denne studie fokuserte vi på de reduserte nivåer av cortactin i respons til curcumin behandling, fordi det er ofte overuttrykt i kreftformer, og det har blitt rapportert å forbedre tumorcellemigrering og invasjon [40]. Fig. 2B viser nedregulering av cortactin i membrantilknyttet protein fraksjon fra curcumin-behandlede celler, en observasjon bekreftet ved western-blotting i celler behandlet med 50 uM ved den apikale side i 1-4 timer (fig. 2C). Transferrin-reseptoren (CD71), her brukt som en kontroll, viste ingen endring, lik våre tidligere rapport [29].
(A) Tabell med 13 plasmamembranassosierte proteiner identifisert ved QTOF-MS /MS som betydelig redusert i T84 cellemono behandlet med curcumin. Dataene viser gjennomsnittlig antall unike peptider identifisert fra tre forskjellige eksperimenter ± SD. (B) Kvantitativ analyse av cortactin uttrykk i T84-celler ved M /S. Spektrums verdier ble oppnådd fra tre forskjellige eksperimenter. De kvantifisering data for cortactin protein ble avledet fra M /S med Stillas proteom- programvare (versjon Scaffold_3.1.2). Dataene er midler ± SE, *
p
0,05 sammenlignet med ubehandlede celler, Student t-test. (C) Bekreftelse av CTTN protein ekspresjon ved western blotting med biotinylert celleoverflateproteinfraksjon fremstilt fra T84 celler behandlet med DMSO (CTRL) eller 50 uM curcumin i 1-4 timer. CD71 (transferrin reseptor) ble anvendt som en kontroll lasting. CTRL representerer celler behandlet med DMSO i 4 timer.
Defosforylering av pTyr
421-Cortactin ved Curcumin
En veldefinert mekanisme bestemme avvikende migrering av kreftceller er mediert av GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B). (C). GAPDH fungerte som en lasting kontroll. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. Som vist på fig.
