Abstract
Intravesikal Bacillus Calmette Guérin (BCG) immunterapi regnes som standard vare for behandling av ikke-muskel invasiv blærekreft; men behandlingsparametere ble etablert empirisk. For å vurdere potensiell optimalisering av kliniske parametere av BCG induksjonsbehandling, vi konstruert og spørres en ny matematisk modell. Spesifikt vurdert vi virkningen av (1) varighet mellom reseksjon og den første drypping; (2) BCG dose; (3) inneliggende tid; og (4) behandling intervall på induksjonsbehandling – ved hjelp av kur rate som det primære endepunktet. Basert på tilgjengelige kliniske og
in vitro
eksperimentelle data, har vi konstruert og parametriseres en stokastisk matematisk modell som beskriver vekselvirkninger mellom BCG, immunsystemet, det blære mucosa og tumorceller. Det primære endepunktet av modellen var sannsynligheten for svulst utryddelse etter BCG-induksjonsbehandling hos pasienter med høy risiko for svulst tilbakefall. Vi teoretisk viser at forlenge varigheten mellom reseksjon og den første BCG drypping negativt påvirker behandlingsresultat. Simuleringer av høyere BCG doser og lengre inneliggende ganger både forbedret sannsynligheten for svulst utryddelse. Et bemerkelsesverdig funn var at en inter-instillasjon intervall to ganger lengre enn syv-dagers intervall som brukes i dagens standardbehandling vil vesentlig forbedre behandlingsresultat. Vi gir innsikt i relevante kliniske spørsmål ved hjelp av en ny matematisk modell av BCG immunterapi. Vår modell spår en endret regime som kan redusere bivirkninger av behandlingen mens bedre respons på behandling
Citation. Rentsch CA, Biot C, Gsponer JR, Bachmann A, Albert ML, BREBAN R (2013) BCG-mediert blærekreft Immunterapi: Identifisere Determinanter av behandlingsrespons med en kalibrert matematisk modell. PLoS ONE 8 (2): e56327. doi: 10,1371 /journal.pone.0056327
Redaktør: David J. Klinke, West Virginia University, USA
mottatt: 23 september 2012; Godkjent: 08.01.2013; Publisert: 25 februar 2013
Copyright: © 2013 Rentsch et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte : Dette arbeidet ble støttet av La Ligue Contre le Cancer og Association pour la Recherche sur le Cancer. CAR erkjenner støtte fra den sveitsiske National Foundation. Meninger og uttalelser i denne artikkelen er de av forfatterne og representerer ikke den offisielle politikken, påtegning, eller utsikt over Institute Pasteur. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Adjuvant behandling av ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) med intravesikal Bacillus Calmette-Guérin (BCG) etter transuretral reseksjon ble etablert empirisk nesten 40 år siden [1]. Mens BCG behandlingen fortsatt standarden på omsorg, er kritiske parametere som påvirker behandlingsresultat fortsatt dårlig forstått. I en tidligere studie har vi konstruert en matematisk modell som var kalibrert for å tilgjengelige kliniske data for å evaluere evnen av den medfødte immunsystemet som prinsippet effektor arm ansvarlig for respons på behandling. Vi demonstrerte at effektor funksjon av den medfødte immunrespons er ikke kraftig nok til å gi de herdehastigheter observert i klinisk praksis [2]. Vi konkluderte derfor med at komponentene i det adaptive immunsystemet må spille en avgjørende rolle i tumor eliminering. Adaptive immun effektorceller (for eksempel T-lymfocytter) er forskjellig fra de iboende fylles som de er lang levetid, har egenskaper av antigen spesifisitet og immunologisk hukommelse, med mulighet for å kommunisere med flere mål-celler i løpet av en enkelt runde med aktivering. Beregninger basert på eksperimentelle data antyder at en enkelt cytolytisk T-lymfocytter har potensial til å drepe ti målcellene før den krever re-aktivering ved hjelp av en antigenpresenterende celle [3]. Dessuten muliggjør eksistensen av en minne av antigen-spesifikke T-celler en mer robust adaptive immun effektor-cellerespons på sekundære re-eksponering til BCG.
Ved hjelp av en raffinert matematisk modell som omfatter den adaptive effektorfunksjoner av immunsystemet, tar vi flere kliniske parametre for å lære om deres innvirkning for en optimal protokoll vellykket BCG immunterapi. Vi har nærmere bestemt integrert tilgjengelige kliniske og
in vitro
eksperimentelle data for å konstruere og parameter en ny stokastisk matematisk modell som beskriver vekselvirkninger mellom BCG, immunsystemet og tumorceller med det primære endepunktet blir sannsynligheten for tumor utryddelse. Vi har ikke som mål for nøyaktige kvantitative resultater, men heller for en robust kvalitativ forståelse som vil være gyldig for fremtidige modeller som kunne integrere økende nivåer av detaljer. Heri, vurderte vi virkningen av: (1) å variere tiden fra reseksjon til BCG drypping, (2) å modulere BCG dosen som brukes under intravesical instillation, (3) den iboende tids av BCG, og (4) den inter-instillasjon intervall .
Selv om alle parametere påvirket behandlingsresultat, det mest overraskende resultatet gjaldt virkningen av inter-instillasjon intervall hvor simuleringer foreslått at et intervall to ganger lengre enn syv-dagers intervall som brukes i dagens standardbehandling, vil vesentlig forbedre behandlingsresultat. Vår studie gir nyttig innsikt og testbare hypoteser som kan føre til bedre styring i NMIBC.
Materialer og metoder
Vår matematisk modell gjør antagelser om samspillet utløst av BCG instillasjoner og simulerer dynamikken i populasjoner av celler. Før oppstart av BCG behandling, tre cellepopulasjoner er til stede: sunn urothelial vev, tumor og medfødte immunceller. Samspillet mellom disse cellepopulasjoner er ubetydelig. De prosesser som foregår for hver av disse cellepopulasjoner før behandlingen er cellemigrasjon og /eller lokale spredning og død (figur 1 og S1 for skjematisk og figur S2 for simulering av tumorvekst). Av notatet, aktiverte adaptive immunceller (for eksempel antigen-spesifikke T-celler) ikke er til stede pre-BCG terapi, som deres inntreden krever grunning. Under BCG instillasjoner, leve BCG er i stand til aktivt samspill med celler mens døde BCG kan internalisert av celler; vi refererer til BCG som å bli «celleassosiert,» for å betegne en av disse to muligheter. Som et resultat av foreningen med BCG, dukker fire nye cellepopulasjoner som er forbundet med dynamiske vekselvirkninger med de tidligere foreliggende cellepopulasjoner i blæren: (1) BCG-assosierte urotelialceller, (2) BCG-assosierte tumorceller, (3) aktiverte medfødte immunceller og (4) aktivert adaptive immunceller. BCG-tilknyttede til friske urotelialceller og tumorceller, som i sin tur utløser økte migrering og aktivering av medfødte immunceller inn i blæren. Medfødte immun effektorceller målrette BCG forbundet uroteliale og kreftceller, ødelegge dem, samt deres nabo sunn slimhinnen og ikke-infiserte tumorceller [2]. Den gjentatte og økt betennelse utløser priming og eventuell rekruttering av adaptive immuneffektorceller. Celler av det adaptive immunsystemet kan være spesifikke for BCG antigen, således rettet mot BCG forbundet urothelial og tumorceller; men de kan også omfatte tumor antigenspesifikke effektorceller, og således tillate direkte målretting av uinfiserte tumorceller.
dynamisk modell representerer interaksjonen mellom friskt vev urothelial, tumorceller, og deres tilknytning til BCG (interaksjon avbildet ved grønn linje), som igjen resulterer i generering av BCG-forbundet friske vevet og tumorceller. De sistnevnte cellepopulasjoner har evnen til å utløse aktivering av medfødte immun effektorceller og i sin tur den grunning av adaptive immuneffektorceller. Røde linjer som slutter i sirkler indikerer inngangs stimuli som påvirker rekrutteringen av de angitte immuncellepopulasjoner. Svarte piler indikerer enten øke (f.eks rekruttering eller spredning) eller reduser (f.eks død eller celle turn-over) av de respektive cellepopulasjon. Linjer med butte ender indikerer direkte drap av målet celle populasjoner (heltrukne linjer) eller tilskuer død (stiplede linjer). Modellen ble parametriseres ved hjelp av tilgjengelige kliniske og
in vivo
data og innstilt for å oppnå 50% sannsynlighet for svulst utryddelse etter seks ukentlige intravesikal instillations av BCG. En mer detaljert versjon av dette tallet er gitt av Figur S1 av supplerende materiale.
Den kvalitative modellen er presentert ovenfor ble realisert som en kontinuerlig-tid markovkjede hvor cellepopulasjoner er gitt av heltall stokastiske variabler (tabell S1). Hver interaksjon ble definert av dens innvirkning på cellepopulasjoner og tildelt en hastighet på forekomst (tabell S2). Når den matematiske modellen ble definert, vi integrert den numerisk ved hjelp av
effektiv tau-hoppe algoritme product: [4] at vi implementert i C /C ++. Parameterverdien for modellen (tabell S3) ble etablert ved en av de tre metodene. Først ble de oppnådd fra litteraturen hvor de var direkte beregnet fra data [2], [5]. For det andre, de ble valgt slik at simuleringer av cellen populasjonsdynamikk de er i samsvar med tilgjengelig klinisk og
in vivo
data [5]; se Figur S3 for en prøve simulering. For det tredje ble de ekstrahert fra å kalibrere modellen slik at sannsynligheten for tumor eliminasjon er ~ 50%, i overensstemmelse til kliniske data. Derfor, for første gang, har vi oppnådd en matematisk modell som kombinerer immunologiske og kliniske data på BCG immunterapi. En fullstendig beskrivelse av den matematiske modellen og dens parametrisering er inkludert i supplerende materiale
Modellen ble brukt til å simulere ulike BCG regimer for å vurdere hvordan svulsten utryddelse påvirkes av:. (1) varierer tiden fra reseksjon til BCG instillasjon, (2) å modulere BCG dosen som brukes under intravesical instillation, (3) den iboende tids av BCG, og (4) den inter-instillasjon intervall. Hver sannsynligheten for tumor utryddelse ble beregnet ved å kjøre 1.000 stokastiske simuleringer, slik at det resulterende 95% konfidensintervall ble rimelig liten. Datamaskinen koden ble også ansatt i usikkerhet og sensitivitetsanalyser for å vurdere robustheten resultatene våre (figur S4).
Resultater
Bruke parametriseres matematiske modellen, vi evaluert behandlingsparametere som antas å påvirke klinisk respons. Først bestemmes vi påvirkning av tidsintervallet mellom kirurgi og initiering av BCG behandling. Modellen beregnede sannsynligheten for tumor utryddelse etter seks ukentlige instillasjoner som en funksjon av tiden etter reseksjon tid (figur 2A). Jo kortere intervallet fra kirurgi til BCG behandling, jo større er sjansen for å oppnå klinisk respons.
(A) Sannsynlighet for svulst utryddelse med varierende tid fra kirurgi til starten av BCG behandling. Det grå skraverte området representerer tiden fra kirurgi til den typiske initiering av BCG behandling (dvs. 2 uker). Kreften vekst brukt er basert på klinisk observasjon at høygradige lesjoner blir synlige etter 3 måneder i fravær av behandling (detaljert definisjon av tumor dynamikk er gitt i tilleggsinformasjon og figur S2). Sannsynligheten for svulst utryddelse etter seks ukentlige BCG instillasjoner ble modellert som en funksjon av (B) BCG dose, og (C) BCG holdetid.
Modellen ble videre spørres å fastslå effekten av BCG dose og holdetid i blæren. Vi merket en klar positiv sammenheng mellom BCG dose og sannsynligheten for svulst utryddelse (figur 2B). Påfallende er små endringer i dosen av BCG spådd å ha en betydelig innvirkning på terapeutisk suksess. BCG er ofte levert på et område mellom 10
8-10
9 CFU /hetteglass. I henhold til den prediktive modellen, kan for eksempel en 10 gangers forskjell i klinisk påført dose utgjøre ~40% differensial respons på behandling. Som en konsekvens, undersøkte vi oppholdstiden (det vil si varigheten av BCG instillasjon). Igjen finner vi at større eksponering av blæren slimhinnene til BCG resulterer i en økt sannsynlighet for svulst utryddelse (figur 2C).
Nyere data vedrørende forsinket timing av T-celle priming følgende mykobakterieinfeksjon [6], eller BCG intravesikal instillasjon [7], foreslo at dagens behandlingsregimet ikke kan være riktig innstilt til kinetikken av adaptive immunresponser. Derfor ble effekten av varierende inter-instillering timing vurdert. Vi opprettholdt de første tre ukentlige doser, da dette er nødvendig for priming adaptive immunresponser og initiere blærebetennelse [5]; og vi modellert den optimale tidsintervallet mellom den tredje til sjette behandlingsdose, betegnet med
N
i figur 3A. Som følge av parametriseringen forhold, seks ukentlige instillasjoner resulterte i den forventede kur rate på 50%. Kortere inter-instillasjon varighet negativt påvirket klinisk respons (figur 3B). Bemerkelsesverdig, viser modellen en optimal behandling intervall som er dobbelt lengre enn dagens standardbehandling, uten negative konsekvenser om utvidet til inntil 30 dager (Figur 3B).
(A) Skjematisk fremstilling av modellert kirurgi tidspunkt etterfulgt av intravesikal behandling tidspunkter (piler). Symbolet * angir klokkeslett transuretral reseksjon (TUR) etterfulgt av 2 uker intervall før BCG behandling starter. Tre ukentlige instillations er gitt for å initiere medfødte og ervervede immunresponser. Tidsintervallet mellom den tredje gjennom sjette behandlingsdose var variert og utpekt av
N plakater (målt i uker). (B) Sannsynlighet for svulst utryddelse som en funksjon av
N
, inter-instillasjon intervall i løpet av 3
rd – 6
th behandlingsdoser. Den stiplede linjen markerer resultatet etter det anbefalte intervallet
N
= en uke.
Vi utførte usikkerhet og sensitivitetsanalyser for å vurdere robustheten våre numeriske resultater. Vi fant ut at de kvalitative trekk ved figur 2B 2C er bevart med liten variasjon av parametere. Resultatene presentert i figurene 2A og 3 ble også undersøkt. Vi fant ut at, etter modell rekalibrering, varierende tellingen av kreftceller ved starten av behandlingen eller tast modellparametere påvirker litt på våre spådommer. Detaljer om disse analysene inngår i supplerende materiale (figur S4).
Diskusjoner
Ved hjelp av en matematisk modell vi evaluert klinisk relevante spørsmål av BCG behandling i NMIBC. Modellen viser at terapeutisk suksess avhenger sterkt av tidspunktet for BCG regime. En tidlig start av BCG behandling etter TUR, kombinert med en optimal holdetid og behandling inter-drypping intervall, gjør, faktisk, har stor innflytelse på behandlingsresultat, ifølge vår modell.
Det er ingen gjeldende retningslinjer rådgivning når man skal starte BCG behandling etter operasjonen. Delay er ansett som viktig for helbredelse av blæreveggen, og forebygging av systemiske komplikasjoner på grunn av BCG behandling. Derfor er de fleste urologer vente 2-6 uker før du starter BCG terapi; Men i noen studier intravesikal behandling er igangsatt så tidlig som en uke etter transuretral reseksjon [8], [9]. Til dags dato, ingen potensielle sammenligninger av ulike forsinkelser starte av BCG behandling er gjennomført. Vår modell viser at en langvarig forsinkelse i oppstart av BCG terapi kan ha en negativ innvirkning tilbakefall (Figur 2A). Analyse av produktet antydet at den økte risikoen for tilbakefall var relatert til utvekst av gjenværende tumorceller. Dette resultatet skyldes den fortsatte utvidelsen av gjenværende kreftceller etter reseksjon, øker sykdomsbyrden og utfordre den begrensede drepe kapasiteten til immunsystemet.
Endringer i dose og holdetid har tidligere blitt diskutert i litteratur på basis av å redusere bivirkninger. Dosereduksjon er vurdert i flere kliniske studier [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Reduksjon av BCG dose til en tredjedel ble betraktet som en strategi for å senke bivirkninger. Denne lavere dosen forble signifikant bedre enn mitomycin; mens en seksdel av BCG dosen var ikke bedre enn bruken av mitomycin alene [13], [14]. Disse funnene underbygge våre modelleringsresultater vedrørende påvirkning av dosen på vaksinen (figur 2B). Vår modell viser også at en økning av dosen øker terapeutisk suksess. Men dette vil trolig skje på bekostning av forbedrede bivirkninger.
Reduksjon av oppholdstiden har blitt rapportert som en mulighet for bedre behandling og som et alternativ til dosereduksjon hos pasienter med alvorlige bivirkninger [16], men ingen prospektiv studie har sammenlignet BCG holdetid som en variabel. Vår modell viser at økt oppholdstid kan også påvirke behandlingsresultat (figur 2C). Dette kan være spesielt viktig hos pasienter med minimale symptomer som kan ha nytte av forbedret BCG-mediert aktivering av immunsystemet. Disse resultatene gir en sterk påminnelse om viktigheten av å følge i det minste, de gjeldende retningslinjer for BCG immunterapi.
Kanskje det mest slående funnet er observasjonen at den optimale behandlingsintervallet kan være dobbelt så lang som den nåværende tidsplan for å administrere pasienter (figur 3). Disse funnene er sannsynligvis relatert til kinetikken av T og B-celleaktivering, og utholdenhet av disse relativt langlivede effektorceller i blæren. Ved å utvide behandlingsintervallet under effektorfasen, har vi lykkes i å forbedre den tidsperioden hvor immunsystemet kan utøve negativ press på gjenværende tumorbyrde. Kun begrenset informasjon er tilgjengelig fra kliniske studier hvor behandlingsintervallet ble endret under BCG induksjonsbehandling. Studier i mus viste at antallet av og tidspunktet for instillasjoner er viktig for å bestemme forskjellige lokale cytokin-profiler, som i sin tur kan påvirke den kvalitative og kvantitative rekruttering av adaptive effektorceller [17]. Slike funn i kombinasjon med resultatet av vår modell støtter behovet for ytterligere undersøkelser for å bestemme det optimale tidspunkt for BCG instillasjoner. Endelig oppmerksomhet bør rettes mot brå tapet av behandlingseffekten etter et visst intervall (figur 3), et funn som kan ha betydning for tidspunktet for vedlikeholdsbehandling.
Disse dataene er spennende som den modifiserte behandling diett engasjerer afferent immunrespons i en tidlig fase av behandlingen og maksimalt ytelser fra langlivede effektor potensialet i efferent adaptiv respons. Et slikt regime med utvidet kurs av behandling kan bli bedre tolerert av pasienter [18]. Dessuten er det spennende å tenke på at forlengelse av de første seks doser av BCG kan unngå behovet for vedlikeholdsbehandling. Åpenbart disse funnene krever validering i prekliniske eksperimentelle modeller og kliniske studier før de blir vedtatt for pasientbehandling. Likevel er vi oppmuntret av funnene og støtter bruk av matematiske modeller for å etablere et rammeverk for optimalisering av behandlingspraksis.
innen matematisk modellering i BCG immunterapi av blærekreft har dukket opp nylig [19], [20], [21], [22]. Emner som tas hittil har vært: BCG dose og antall instillasjoner nødvendig for å oppnå herding, og den kombinerte effekten av IL-2 og BCG. Tidligere modeller [19], [20], [21], [22] har en rekke begrensninger, som har blitt omgås i dette arbeidet. Først, i stedet for ordinære differensialligninger, der antall celler er gitt av reelle tall, har vi valgt en stokastisk modell der antall celler tar heltallsverdier. Derfor er vår modell bedre egnet til å beskrive svulst eliminering. For det andre, i motsetning til tidligere modeller [19], [20], [21], [22], omfatter vårt dynamikken i BCG-assosierte friske urotelialceller, som er mer tallrik enn BCG-assosierte tumorceller – både tjener som initiatorer av medfødt og adaptiv immunitet. For det tredje, er vi den første for å modellere de viktigste boost responsen av immunsystemet, et fenomen antas å være av avgjørende betydning for BCG immunoterapi [5]. Disse metodiske fremskritt, i tillegg til de resultatene som presenteres her, vil bidra til å fremme bruk av matematiske modeller for optimalisering av immunbaserte behandlingsstrategier.
Konklusjoner
Selv om per definisjon ufullkommen, matematiske modeller er nyttige verktøy for administrasjon av empirisk kunnskap å hente ut både kvalitativ og kvantitativ informasjon. De nye innsikter fått inn BCG behandling gjenstår å bli klinisk testet og validert for å bekrefte sammenhengen i modellen og dets forutsetninger. En modell som den presenteres her, kan derfor anses for design av nye terapeutiske strategier og kliniske studier.
I sum, impliserer vår modell som en streng tidsstyring av blærekreftpasienter kan være avgjørende for en vellykket BCG behandling og at pasienter kan dra stor nytte av en drypping plan med lengre behandlingsintervaller. Våre resultater tilsier videre studier som tar sikte på å optimalisere BCG behandling hos pasienter med NMIBC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
flytdiagram av modellen av interaksjoner mellom det medfødte immunsystemet og blære tumor i løpet av BCG instillasjon.
doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s001 plakater (TIFF)
Figur S2.
Simulering av logistikk tumorvekst, reseksjon og tumorettervekst. Den horisontale stiplede linjen representerer den omtrentlige størrelsen på svulsten når svulsten er synlig på blæreveggen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056327.s002 plakater (TIFF)
Figur S3.
Simulering av populasjonsdynamikk av celler under og etter en seks-ukers kurs av intravesikal BCG behandling. BCG (panel A), tumor-celler (panel B), BCG-assosierte tumorceller (panel C), vevceller BCG-assosiert (panel D), medfødt effektor-celler (panel E), adaptive effektor-celler (panel F). Merk modellering av prime /boost respons av det medfødte og tilpasset immunsystem som skjer etter den tredje drypping (særlig notat paneler E og F)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056327.s003 product: ( TIFF)
Figur S4.
Sensitivitetsanalyser for fig. 2A og 3 i den løpende teksten. A. Sensitivitetsanalyse på fig. 3 med å endre frekvensen av tap av tilpasset effektorer,
μ
Ea
. Den blå, sort (også vist i fig. 3) og røde kurver tilsvare
μ
Ea
= 0,4, 0,8 og 1,6 dag
-1, respektivt. For hver parameter sett, modellen har blitt re-kalibrert slik at seks ukentlig instillasjon av BCG behandling utbytte -50% sjanse for helbredelse. B. Sensitivitetsanalyse på fig. 3 med varierende antall tumorceller som finnes i blæren før initiering av BCG behandling,
T plakater (0). Den svarte (også vist i fig. 3), blå, magenta og røde kurver tilsvare
T plakater (0) = 10
6, 10
5, 10
4 og 10
3 tumorceller. Modellen har blitt re-kalibrert for hver verdi av
T product: (0), tilsvarende. Disse tallverdier tyder på at vår prediksjon av forbedret terapeutisk utfall av en to-ukers inter-instillasjon intervall er robust. C. Sensitivitetsanalyse på fig. 2A med endring av antall tumorceller før initiering av BCG behandling, T (0). Den svarte (. Også vist i figur 2A) og røde kurver tilsvare
T plakater (0) = 10 6
og 10
3 tumorceller, henholdsvis
doi:. 10,1371 /journal .pone.0056327.s004 product: (TIFF)
Tabell S1.
statlige variabler i modellen sammen med sine biologiske beskrivelse. Tilstandsvariablene representerer tellinger av ulike celletyper som er involvert i samspillet mellom immunsystem, kreftceller og BCG
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056327.s005 plakater (TIFF)
Tabell S2.
Stokastiske prosesser og deres tilsvarende priser.
doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s006 plakater (TIFF)
tabell S3.
Parametere av modellen.
doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s007 plakater (TIFF)
Tekst S1.
Detaljert beskrivelse og numerisk analyse av stokastiske matematiske modellen.
doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s008 product: (PDF)
