Abstract
Bakgrunn
Det var godt kjent at den kliniske bruken av cellegifter er begrenset av alvorlige bivirkninger og narkotika motstander. Derfor er det nødvendig å finne en strategi for å øke den spesifikke anti-tumoreffektiviteten av kjemoterapeutiske medikamenter. Apigenin, en slags flavonoider, har blitt rapportert å ha kreft aktiviteter med svært lav cytotoksisitet til normalt vev.
metodikk /hovedfunnene
Våre resultater fra celleviabilitet analysen, western-blotter og TdT -mediert dUTP-biotin nick ende merking (TUNEL) analyse viste de synergistiske pro-apoptotiske virkninger av en lav dose av apigenin og paclitaxel i humane kreftcellelinjer. For å analysere den underliggende mekanisme, undersøkte vi reaktive oksygenarter (ROS) farging etter at cellene ble behandlet med en kombinasjon av apigenin og paclitaxel, eller hver av dem alene. Data fra flow-cytometri viste at superoksyder, men ikke reduksjon av peroksyder akkumulert i HeLa-celler behandlet med apigenin eller en kombinasjon av apigenin og paclitaxel. Apigenin og paclitaxel-induserte HeLa-celle apoptose var relatert til nivået av ROS i celler. Vi evaluerte videre aktivitet og proteinnivå superoksid dismutase (SOD). Apigenin hemmet betydelig SOD aktivitet, men endret ikke det SOD proteinnivået som tyder på at apigenin fremmet ROS akkumulering gjennom å undertrykke enzymaktivitet av SOD. Tilsetting av Zn
2 +, Cu
2 + og Mn
2+ til cellelysatene hemmet Apigenin effekter på SOD aktivitet. Samtidig, data fra caspase-2 over-uttrykk og banket ned eksperimenter vist at caspase-2 deltok i apigenin og paclitaxel-indusert HeLa celle apoptose.
Konklusjon /Betydning
Tatt sammen, vår studie viste at apigenin kan sensitivisere cancerceller til paclitaxel-indusert apoptose ved å undertrykke SOD-aktivitet, noe som førte til opphopning av ROS og spaltning av caspase-2, noe som tyder på at den kombinerte bruk av apigenin og paclitaxel var en effektiv måte å redusere dose av paclitaxel tatt
Citation. Xu Y, Xin Y, Diao Y, Lu C, Fu J, Luo L, et al. (2011) synergieffekter av Apigenin og Paclitaxel på apoptose av kreftceller. PLoS ONE 6 (12): e29169. doi: 10,1371 /journal.pone.0029169
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 27 juli 2011; Godkjent: 22 november 2011; Publisert: 21.12.2011
Copyright: © 2011 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Nature Science Foundation National of China (nr. 81072433 og 31071000), Science Foundation Jiangsu Major Nature of høy utdanning (nr 07KJA18026) og et prosjekt finansiert av Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høyere utdanningsinstitusjoner. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kjemoterapi er en av de mest vidt anvendte behandlinger for kreft. Men mange cellegifter kan gi ubehagelige bivirkninger, spesielt når det tas i høye doser. En av cellegiftene, paclitaxel, en mitotisk inhibitor, kan føre til overfølsomhetsreaksjoner [1], nøytropeni [2], nevro [3], hjerteforstyrrelse [4] og andre diverse toksiske effekter [5], som alvorlig forverrer livskvalitet for kreftpasienter og resultater i dosereduksjon og seponering av behandlingen. Det er derfor viktig å redusere de negative bivirkningene av kjemoterapeutiske midler ved klinisk kreftbehandling. I tillegg medikamentresistens i klinisk terapi forstyrrer ofte med effektiviteten av kjemoterapeutiske midler.
Reaktive oksygenarter (ROS) inkludert superoksidradikalet, hydrogenperoksid (H
2o
2), hydroksyl-radikal, nitrogenoksid, og forskjellige nitrogenoksid-avledede reaktive nitro arter (RNS) er utformet som naturlige biprodukter av normal metabolisme av oksygen i humane celler og vev. På grunn av sin svært reaktive karakter, har de en tendens til å bli involvert i uønskede reaksjoner som forårsaker skader på celler og til slutt føre til sykdommer. Kreftceller utviser øket glykolyse i kombinasjon med en redusert hastighet av respirasjon og disse endringene i metabolismen har vist seg å være assosiert med økt oksidativt stress [6] – [8]. En høy celle redoks-status kunne stimulere svulstdannelse gjennom å skape en forbedret celle-proliferative miljø, indusere DNA-skade, og å slå av tumor undertrykkingsfunksjoner [9], [10]. Tumorvekst og migrasjon kunne inhiberes
in vitro
ved endring av miljøet rundt tumorceller til en mer reduserende ett. I opposisjon til dette, ville en høy celle redoks staten også støtte økt apoptose, noe som ville hemme svulstdannelse. Derfor, i kreftceller, kan den høye redoks staten øke sin toleranse for miljømessige påkjenninger og cellegifter. Tumorceller uttrykte et høyere nivå av MnSOD indikere en dårlig prognose [11], [12]. Det har vist seg at ROS har potensielle evne til å behandle kaspase-2 [13], [14], som er en initiator caspase ført til mitokondriemembranen permeabilization [15] og er også en viktig medlem i apoptose signalforsterkning sløyfe [16]. Dessuten har tidligere undersøkelser i caspase-2 banket ut mus vist at caspase-2-aktivering var knyttet sammen med ROS opphopning [17]. Redusert apoptose hastighet ble også påvist i
caspase-2
– /-.
Eggceller [18]
Apigenin (4 «, 5, 7-Trihydroxyflavone) er viden finnes i mange frukter og grønnsaker. Nylig ble det rapportert at apigenin hadde en potensiell anti-tumor effekt på flere humane kreftcellelinjer med lav cytotoksisitet og ingen mutagen aktivitet. [19] – [21]. Apigenin kunne forbedre den intracellulære akkumuleringen av ROS og hadde den pro-oksidanter potensiell [22], [23] og redusere SOD aktivitet i lungekreftceller [24].
I dette arbeidet har vi vist at apigenin kunne sensibilisere kreftceller til paclitaxel indusert apoptose gjennom å undertrykke SOD aktivitet og fører til opphopning av ROS og kløyving av caspase-2, noe som tyder på kombinert bruk av apigenin og paclitaxel ble effektivt for kreftbehandling.
Materialer og Metoder
Cell kultur og transfeksjon
menneskelig cervical epithelial karsinom cellelinje HeLa, human lunge epithelial karsinom cellelinje A549, menneskelig negroid hepatocytter carcinoma cellelinje Hep3B, og humane embryonale nyre 293a fremstilte (HEK293A) celler hentet fra institutt for biokjemi og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (Invitrogen) inneholder 10% føtalt kalveserum (Hyclone) og antibiotika (100 mikrogram /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin) med 5% CO
2 ved 37 ° C. Forbigående transfeksjon ble utført med en modifisert kalsiumfosfatmetode eller ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. I alle tilfeller ble den totale mengden av DNA normalisert ved de tomme kontroll plasmider.
Antistoffer, regenter og DNA-konstruksjonene
Mus monoklonalt antistoff mot Flag-tag ble kjøpt fra Sigma. Kanin polyklonale antistoffer mot poly ADP-ribose polymerase (PARP), ble caspase-3 og β-aktin hentet fra Cell Signaling Technology. Musepolyklonalt antistoff mot caspase-2 kom fra Santa Cruz Biotechnology. Kanin polyklonale antistoffer mot kløyvde caspase-3 kom fra BioWorld Technology, Inc. Mouse monoklonalt antistoff mot SOD1 og kanin polyklonale antistoffer mot SOD2, ble Endo G og AIF hentet fra Abcam. Caspase-2 inhibitor benzyloksykarbonyl-Val-Asp (OMe) -Val-Ala-Asp (OMe) -fluorom ethylketone (z-VDVAD-FMK) ble erholdt fra Calbiochem. ROS gjenkjenning reagenser (CM-H
2DCFDA og dihydroethidium (DHE)) og apoptotisk oppdage regent (FITC-Annexin V og propidiumjodid- buffer) var fra Molecular Probes ™ (Invirogen). Dimetylsulfoksyd var fra Amresco. Apigenin, paclitaxel og DETC ble kjøpt fra Sigma.
pcDNA3.1-flagg-caspase2 (WT) og pRNAU6-caspase2 ble bygget ved hjelp av standard teknikker. pcDNA3.1 ble spaltet med Xhol og KpnI. Primerne (forstand: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sense: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG) ble utviklet for å generere pcDNA3.1-flagg-caspase2 (WT).
caspase-2 product: (NM_032982.2) genet ble syntetisert av Invitrogen. pRNAU6 ble spaltet med Bam HI og Hind III, og glødet som målretter oligonukleotider ACAGCTGTTGTTGAGCGAA for
caspase-2
ble ligert inn i vektor [25].
Cellenes levedyktighet og TUNEL assay
for å evaluere paclitaxel-indusert cytotoksisitet, ble Colorimetric cytotoksiske 96 ikke-radioaktivt cytotoksisitet analyse (Promega) utført i henhold til produsentens protokoll. Cellelevedyktigheten ble påvist ved måling av endogent laktatdehydrogenase kvantitativt.
TdT-mediert dUTP-biotin nick ende merking (TUNEL) assay ble utført i HeLa-celler ved hjelp av Guava® TUNEL Kit som tidligere beskrevet [26]. Cellene ble oppdaget på en Guava EasyCyte ™ System, og data ble analysert ved hjelp av Guava TUNEL programvare (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Alle analyser ble utført i tre paralleller.
Annexin V /PI analyse
Annexin V /PI analyse, ved hjelp annexin V /PI dobbel farging av ufestede celler, skiller mellom tidlige apoptotiske celler og sent apoptotiske /nekrotiske celler. Både fløt og festede celler ble suspendert i 500 ul bindingsbuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl-
2, 0.1% BSA). Annexin V-FITC (5 ul) og PI (5 ul) ble deretter tilsatt til hver prøve. Etter 15 minutters inkubering i mørke ble det flowcytometrisk analyse utført ved anvendelse av Guava EasyCyte ™ -system. For hver prøve 5000-celler ble analysert. Data ble analysert ved hjelp av Guava TUNEL programvare (Guava Technologies, Hayward, CA, USA).
ROS deteksjon
HeLa-celler ble sådd i 6-brønners plater, og etter 24 timer ble cellene inkubert med ROS spesifikke fargestoffer, dihydroethidium (Dhe, 5 mm) eller CM-H
2DCFDA (5 mm), i 30 minutter. Celler ble deretter behandlet med apigenin (15 uM), paclitaxel (4 nM) eller begge av dem i ytterligere 30 minutter. ROS ble påvist ved hjelp av en Guava EasyCyte ™ og analysert med Guava Express Pro programvare (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). DHE ble oppdaget under en emisjon i løpet av 580-583 nm (PM1) og CM-H
2DCFDA ble oppdaget under en emisjon av 525 nm (PM3).
Isolering av mitokondrie og måling av mitokondriemembranen potensial ( MMP)
Intakt mitokondrie ble skilt fra cytosolic komponent av HeLa-celler for videre protein analyse, med Mitokondrier Isolation Kit fra Thermo-Pierce Dounce homogenisering og differensialsentrifugering ble utført i henhold til produsentens protokoll.
mitokondriemembranen potensial (MMP) av HeLa-celler ble målt ved hjelp av Guava EasyCyte ™ MitoPotential Kit (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescens-baserte fargestoff 5, 5 «, 6, 6′-tetraklor-1, 1», 3, 3 «-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine jodid (JC-1) ble anvendt for å evaluere MMP-endringer. Cellen impermeant fargestoff 7-AAD ble anvendt for samtidig å overvåke cellemembran endringer permeabilitet. Fargede celler ble analysert på en Guava EasyCyte ™ System.
Analyse av superoksid dismutase aktivitet
enzymaktivitet av SOD i HeLa-celler ble målt ved hjelp av kommersielle kits i henhold til produsentens protokoll. I denne analysen var tetrazoliumsaltet anvendes for påvisning av superoksidradikaler som genereres av xantinoksidase og hypoxantin. For å måle MnSOD-aktivitet, ble cellelysater sentrifugert ved 10 000 x g for å skille MnSOD fra CuZn SOD, og CuZn SOD ble hemmet i nærvær av kaliumcyanid.
RT-PCR-analyse
Totalt RNA ble ekstrahert ved hjelp av høy Pure RNA Isolation Kit (Roche) i henhold til protokollen beskrevet av produsenten. RT-PCR ble utført ved hjelp av M-MLV revers transkriptase (Invitrogen) med angitte primere (
caspase-2
, fornuft: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sense: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG; GAPDH, fornuft: CATATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC, anti-sense: GAATTCTTACTCCTTGGAGGCCATGTGG). PCR ble utført ved Tm på 58 ° C i 30 sykluser i reaksjons blanding av 25 ml individuelt av hvert protein. PCR produktene ble deretter løst på en% agarosegel og farget med etidiumbromid. Huset holder genet GAPDH ble anvendt som en kontroll.
Western-blot-analyse
Cellelysater ble sentrifugert (15 000 g) ved 4 ° C i 15 min. Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [27]. De antistoff-antigen kompleksene ble visualisert ved LI-COR Odyssey Infrared Imaging System i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp IRDye800 flurophore antistoff (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE).
Fastsettelse av Synergi
legemiddelkombinasjonen ble bestemt av Chou-Talalay metode. CI ble beregnet ved Chou-Talalay ligningen, som tar hensyn til både styrken (IC
50 eller D
m) og den skarpe av dosen-effekt kurven (m-verdi) [28], [29 ]. Den klassiske isobolgram (CI = 1) er gitt ved: (A)
I nevnerne, (D
x)
1 og (D
x)
2 er konsentrasjoner for D
1 (apigenin) og D
2 (paclitaxel) brukes alene som gir x% hemming, mens i numerators, (D)
1 og (D)
2 er dosene av apigenin og paclitaxel anvendt i kombinasjon som isoeffectively hemme x%. CI 1, CI = 1, og CI . 1 foreslår synergisme, additiv og antagonisme, henholdsvis
Fra median-effekten ligningen for Chou og Chou et al. [29], [30], (D
x)
1 og (D
x)
2 kan lett beregnes. (B)
Her D
m er median-effekt dosen som oppnådd fra anti-log av x-aksen av median-effekt plottet, x-log (D) versus y = log [f
a /(1-f
a)] eller D
m = 10
– (Y-aksen) /m, og m er helningen av median-effekt plottet. Automatisert beregning av m, D
m, D
x, og CI-verdier er også tillatt med programvare.
Statistisk analyse
Data ble representert som gjennomsnitt ± SD. Student t-test ble anvendt for å analysere den statistiske signifikans av varians parvis sammenligning. I alle analysene, P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Kombinasjonsbehandling av apigenin med paclitaxel vesentlig bedre cytotoksisitet til humane kreftceller
Siden toksisitet av paclitaxel er. koplet til sin antitumoraktivitet og apigenin har blitt rapportert å ha antitumor-aktivitet med lav toksisitet, vi først observeres ko-effekter av comcination paclitaxel med apigenin. HeLa-celler ble behandlet med forskjellige doser av apigenin, paclitaxel eller begge og deretter celle viabilities ble detektert. Som vist på fig. 1A og B, som begge apigenin og paclitaxel doseavhengig måte induserte cytotoksisitet med ca. 29% reduksjon av cellelevedyktigheten indusert av apigenin ved en dose på 25 uM (fig. 1A), og 24% reduksjon av indusert av paclitaxel i en dose på 10 nM (fig. 1B) hhv. Når vi behandlede HeLa-celler med 15 pM apigenin og 4 nM paclitaxel, ble over 50% reduksjon av cellelevedyktighet detektert, ikke desto mindre, ble mindre enn 20% reduksjon av cellelevedyktighet observeres i celler behandlet med henholdsvis apigenin eller paclitaxel (figur 1C.). Vi gjennomførte Chou-Talalay beregning for å bekrefte synergieffekter av apigenin og paclitaxel på HeLa celler. Kombinasjonen indeks (CI) var 0,3918 ± 0,0436 ved en dose på 15 uM apigenin og 4 nM paclitaxel som angir synergistiske effekter av apigenin og paclitaxel. Disse resultatene indikerte en signifikant øket cytotoksisitet når apigenin og paclitaxel ble administrert i HeLa-celler samtidig. Også vist i fig. 1C, kombinasjon av apigenin med paclitaxel indusert lignende resultater i andre enn Hela celler inkludert Hep3B og A549 cellene kreftceller. Imidlertid har 15 uM apigenin, 4 nM paclitaxel eller kombinasjoner av dem ikke resultere i cytotoksisitet til HEK293A celler henholdsvis (fig. 1C). Disse data antyder at det var synergistiske effekter av apigenin og paclitaxel for spesifikt å drepe kreftceller
A, ble HeLa-celler behandlet med økt konsentrasjon av apigenin (0-100 uM) i 24 timer. Cell vitalitet ble målt. Forsøket ble gjentatt uavhengig av hverandre for tre ganger og dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD. B, HeLa-celler ble behandlet med høyere konsentrasjoner av paklitaxel (0-50 nM) i 24 timer. Celle vitalitet ble påvist og analysert som beskrevet under A. C, HeLa, A549, Hep3B og HEK293A celler ble underkastet behandling med apigenin (15 uM) kombinasjon med paklitaxel (4 nM) i 24 timer. Celle vitalitet ble detektert som beskrevet i A. D, ble HeLa-celler behandlet med apigenin eller paclitaxel henholdsvis, i tillegg, i andre grupper, ble apigenin tilsatt til HeLa-celler i 2 timer før eller etter paclitaxel behandling, eller apigenin og paclitaxel ble tilsatt til HeLa-cellene samtidig. TUNEL farging ble utført, og oppdaget med en Guava® TUNEL Kit. Nummer avbildet prosentandelen av TUNEL-positive celler. E, Celler var enten ubehandlet eller behandlet som tidligere beskrevet i D. På det angitte tidspunkt ble cellene farget med annexin V /PI fargestoff. Analysene ble utført på 5.000 celler i hver løype. F, HeLa-celler ble behandlet med økt konsentrasjon av apigenin eller paclitaxel henholdsvis, eller begge av dem i 24 timer. Deretter ble cellelysatene ble underkastet Western blot for å bestemme proteinnivået av kaspase-3 og PARP. V representerer kjøretøy (dimetylsulfoksyd). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet gruppe; ** P. 0,01 sammenlignet med ubehandlet gruppe
Det har blitt rapportert at både paclitaxel [31], [32] og apigenin [21] kan indusere celle apoptose. Vi neste verifisere om kombinasjonsbruk av apigenin og paclitaxel kan indusere mer akutt apoptose i HeLa celler. Sammenlignet med de gruppene som ble behandlet med apigenin eller paclitaxel individuelt, Apigenin og paclitaxel co-behandlede gruppene viste flere tunel positiv farging celler. Satsene for tunel positiv farging celler ble særlig økt fra 17,95% i paclitacel behandlede gruppen og 19,65% av apigenin behandlede gruppen til rundt 40% i gruppene behandlet med kombinasjon (Fig. 1 D). For å kvantifisere apoptose, ble FACS analyse utført etter farging celler med FITC-annexin-V plus propidiumjodid (PI). Data som vises i fig. 1E indikerte at antall overlevende celler reduseres gradvis etter samtidig behandling med apigenin og paclitaxel og bare mindre enn 60% ble overlevde 24 timer etter apigenin og paclitaxel behandling.
Siden aktivering av caspases er en viktig årsak til apoptose , vi videre oppdaget de splittelsene av caspase-3 og PARP bruker western blot analyse. Som vist på fig. 1F, både de splittelsene av caspase-3 og PARP ble betydelig forbedret av apigenin /paclitaxel co-behandling sammenlignet med apigenin eller paclitaxel behandling alene. Disse resultatene bekrefter at apigenin /paclitaxel ko-behandling induserte en signifikant apoptotisk død av HeLa-celler tyder på at kombinasjonen bruk av apigenin og paclitaxel vil gi en bedre anti-tumor effekt enn anvendelse av apigenin eller paclitaxel alene.
ros produsert av apigenin er avgjørende for apigenin /paclitaxel-indusert HeLa celle apoptose
i mellomtiden flavonoider inkludert apigenin ble anerkjent som antioksidanter, deres pro-oksiderende egenskaper har også blitt rapportert [33]. Vi spekulerte de kreft effekter av kombinasjonen apigenin /paclitaxel kan være relatert til produksjon av ROS i HeLa celler indusert av apigenin. Derfor observerte vi nivåene i HeLa-celler behandlet med med apigenin, paklitaxel eller begge av dem. To ROS-spesifikke fargestoffer, Dhe og CM-H
2DCFDA vises superoksyddannende arter og H
2o
2 i målceller henholdsvis [24]. CM-H
2DCFDA er hovedsakelig oksidert av hydrogen peroksid (H
2o
2) og hydroksyl radikal, er DHE oksidert av superoksyddannende anioner (O
2
-). HeLa-celler ble farget med DHE og CM-H
2DCFDA fulgt av strømningscytometri. Som vist på fig. 2, øket DHE-spesifikke ROS (fig. 2A), mens CM-H
2DCFDA-spesifikk ROS redusert (fig. 2B) i HeLa-celler behandlet med apigenin i løpet av 30 minutter. Ingen forandring ble påvist i cellene behandlet med paclitaxel alene. Det ble observert En lignende trend, og en mer signifikant endring i ROS «status i disse celler behandlet med kombinasjonen av apigenin og paclitaxel sammenlignet med celler behandlet med apigenin alene (Fig. 2). DHE farging observert i disse forsøkene var et resultat av oksydasjon av superoksid arter tyder på at apigenin øket superoksyd specie relatert ROS i HeLa-celler.
A, HeLa-celler ble behandlet med apigenin (15 uM) alene eller sammen med paclitaxel (4- nM), for angitte perioder. DHE (5 uM) ble tilsatt til cellekulturer 30 minutter før behandling. DHE farging i celler ble oppdaget og analysert av Guava EasyCyte ™ System. DHE farging i ubehandlede celler ble anvendt som den negative kontroll. B, CM-H
2DCFDA (5 mm) farging ble utført og analysert som beskrevet i A.
Neste vi vurdert om apigenin /paclitaxel-indusert apoptose var avhengig av ROS opphopning. N-acetyl-L-cystein (NAC), et godt godkjent ROS-passiveringsmidlet, har vært brukt for å motvirke effekten av ROS. Forbehandling av HeLa-celler med 100 uM NAC effektivt undertrykkes dannelsen av superoksid arter (fig. 3A) og inhiberte signifikant celle apoptose indusert ved apigenin og paclitaxel ko-behandling (fig. 3B). De ovenfor angitte data antydet at ROS var avgjørende for apigenin /paclitaxel-induserte HeLa-celle-apoptose.
Cellene ble så samlet og detektert av Guava EasyCyte ™ -system som er beskrevet i fig. 2A. B, HeLa-celler ble behandlet med NAC (100 uM) i 2 timer og deretter inkubert med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer. Celle apoptose ble målt ved TUNEL-analyse som beskrevet i fig. 1.
Apigenin induserer ROS akkumulering gjennom å undertrykke aktiviteten til SOD
Vi har observert at etter HeLa-celler ble behandlet med apigenin, overflod av superoksyddannende arter økt, mens H
2o
2 redusert. Tatt i betraktning SOD var et cellulært enzym som kan omdanne superoksyd i H
2o
2, spekulert vi som apigenin kan redusere aktiviteten av SOD og dermed ført til opphopning av superoksid arter. Vi undersøkte deretter effekten av apigenin på proteinnivå, så vel som enzymaktiviteten av SOD. En betydelig undertrykkelse av både CuZn SOD (SOD1) og MnSOD (SOD2) aktivitet ble observert i HeLa-celler i løpet av 30 minutter etter apigenin eller apigenin /paclitaxel paclitaxel men ikke behandling (Fig. 4A). Imidlertid var det ingen tilsynelatende forandring observert i proteinnivået av CuZn SOD og MnSOD etter apigenin administrering (fig. 4B). Det var følgelig bevis som apigenin trykkes SOD-aktivitet og således induserte akkumulering av ROS.
A, HeLa-celler ble behandlet med apigenin (15 uM), paclitaxel (4 nM), eller begge av dem i 30 minutter . SOD aktivitet ble målt med Cayman SOD deteksjon kit. Forsøket ble gjentatt uavhengig av hverandre for tre ganger og data ble vist med gjennomsnitt ± S.D. * P 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen; ** P 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. B, HeLa-celler ble behandlet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 30 minutter. Cellelysater ble utsatt til Vest-blot Protein å bestemme nivåer av SOD1 og SOD2. C, HeLa-celler ble behandlet med apigenin (15 uM) i 30 minutter og lysert ved sonikering. Cellelysatene ble deretter inkubert med CuCl
2 (8 mm), ZnCl
2 (8 mm) og MnCl
2 (8 pM) i 30 minutter på is. SOD-aktivitet ble målt og analysert som beskrevet i A. D, ble HeLa-celler lysert ved sonikering og cellelysatene ble så inkubert med ovennevnte metallioner i 30 minutter på is. SOD-aktivitet ble målt som nevnt ovenfor. * P 0,05 sammenlignet med apigenin-behandlede gruppe; ** P. 0,01 sammenlignet med apigenin-behandlede gruppen
Som ovenfor Resultatene viste at apigenin trykt SOD aktivitet, og det hadde blitt rapportert at apigenin kan danne stabile kompleks med metallioner
in vitro product: [34], vi således bestemt om apigenin kunne danne kompleks med metallioner og undertrykke SOD aktivitet ved å forhindre SOD fra montere med sine kofaktorer. HeLa-celler ble behandlet med 15 uM apigenin i 30 minutter, og lysatene av cellene ble inkubert med 8 pM av ZnCl
2 (aq), CuCl
2 (aq) eller MnCl
2 (aq) henholdsvis på is i ytterligere 30 minutter. Aktiviteten av SOD ble målt ved bruk av Cayman Superoxide Dismutase Assay Kit som beskrevet i Materialer og Metoder. Som forventet, apigenin undertrykte betydelig aktivitetene til både CuZn SOD og MnSOD, men aktiviteten CuZn SOD økt etter Cu
2+, Zn
2+, og Mn
2+ eksponering og aktiviteten til MnSOD økte også åpenbart etter Mn
2 + eksponering (fig. 4C). I tillegg ble ingen signifikant endring av SOD aktivitet funnet når cellelysatene ble direkte utsatt for Cu
2 +, Zn
2 + eller Mn
2 + uten apigenin behandling (fig. 4D), som indikerer at disse metall ioner ikke forbedre basale SOD activity.These resultater antydet at apigenin trykkes SOD-aktivitet sannsynligvis ved å danne en stabil kompleksdannelse med de metaller i celler [34], og apigenin kan ha høyere bindingsaffinitet til Mn
2 +.
SOD-aktivitet reduksjon er kritisk i apigenin /paclitaxel-indusert apoptose
apigenin hemmet aktiviteten til SOD og kombinasjoner av apigenin /paclitaxel var mer effektive i indusering av apoptose av kreftceller enn hver av dem alene. For å bekrefte at apigenin-indusert reduksjon av aktiviteten av SOD var kritisk i apoptose utløses av apigenin /paclitaxel ko-behandling, observerte vi paclitaxel-indusert apoptose etter blokkering SOD-enzymaktivitet. DETC (diethylthiocarbamate), et godt godkjent hemmer av både CuZn SOD og MnSOD ble brukt i vår nåværende studie [35]. Så likt som apigenin, DETC trykkes aktiviteten av SOD og forbedret paclitaxel indusert apoptose i tillegg (figur 5A.). Disse data sterkt antydet at reduksjon av SOD-aktivitet ved apigenin er kritisk i forbedring av paclitaxel-indusert apoptose.
A, HeLa-celler ble inkubert med apigenin (15 uM) /paclitaxel (4 nM), eller paclitaxel ( 4 nM) sammen med eller uten 1 mM DETC (en inhibitor av SOD) i 24 timer og deretter celler ble utsatt for TUNEL-analyse som beskrevet tidligere. B, HeLa-celler ble forbehandlet med NAC (100 uM) i 2 timer, etterfulgt av behandling med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer. Spalting av caspase-2 ble påvist ved Western-blot-analyse med kontroll av β-aktin. C, HeLa-celler ble forbehandlet med z-VDVAD-FMK (25 pM), en spesifikk inhibitor av kaspase-2, og deretter ble behandlet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer. Proteinnivåer av spaltede PARP og procaspase-3 ble påvist ved Western-blot-analyse. D, HeLa-celler ble forbehandlet med z-VDVAD-FMK (25 uM) i 30 minutter og deretter ble behandlet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 8 timer. Cellene ble deretter høstet og mitokondriemembranpotensiale ble oppdaget ved hjelp av en Guava EasyCyte ™ MitoPotential Kit og analysert av Guava EasyCyte ™ System. MMP ble vist som greven av depolariserte celler. Forsøket ble gjentatt uavhengig av hverandre for tre ganger og dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 sammenlignet med ubehandlet gruppe. E, HeLa-celler ble inkubert med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer, og deretter ble cellene underkastet RT-PCR-analyse. GAPDH mRNA ble brukt som vaktmester-genet.
Aktivering av caspase-2 er viktig for apigenin /paclitaxel-utløst HeLa celle apoptose
Mitokondrie pathway spiller en viktig rolle i ROS utløst apoptose [36], [37] og caspase-2 er blitt betraktet som den apikale caspase i mitokondriell død signalforsterkning sløyfe [38], [39]. ROS-indusert caspase-2 cleavage og tilbakemelding forsterkning av apoptotiske signal har også blitt undersøkt [40]. For å undersøke effekten av apigenin på mitokondrie vei av apoptose, ble caspase-2 forløper spaltning detektert i apigenin-behandlede HeLa-celler ved hjelp av western-blot-analyse. Samtidig behandling av HeLa-celler med apigenin og paclitaxel viste svært lavt nivå av caspase-2 forløper. Da HeLa-celler ble forbehandlet med NAC, caspase-2 forløper nivå gjenvunnet (Fig. 5B). Caspase-2 inhibitor z-VDVAD-FMK betydelig redusert spaltingen av caspase-3 og PARP i HeLa-celler behandlet med apigenin i kombinasjon med paclitaxel (fig. 5C). MMP kan være en årsaks hendelse i utløsende apoptose. Dataene i fig. 5D indikerte at apigenin, men ikke paclitaxel induserte en økning på depolarisering av MMP antyder viktigheten av apigenin i apigenin /paclitaxel indusert kreft celle apoptose. Som forventet, z-VDVAD-FMK hemmet økning av MMP i apigenin og apigenin /paclitaxel-behandlede grupper (fig. 5D). Fig. 5E viste at behandling av apigenin, paclitaxel eller apigenin /paclitaxel endret ikke mRNA nivået av caspase-2 indikerer apigenin /paclitaxel co-behandling bare økt aktivering av caspase-2.
For å bekrefte betydningen av caspase- 2 i apigenin /paclitaxel-utløst mitokondriemembranen permeabilization og apoptose, utfører vi caspase-2 over utfoldelse og knock-down eksperimenter og målte AIF, Endo G og cytokrom c slippe fra mitokondrie i HeLa celler. Over-uttrykk for caspase-2 betydelig forbedret apigenin eller apigenin /paclitaxel-indusert økning av AIF, Endo G og cytokrom c i cytoplasma brøkdel og reduksjon av AIF, Endo G og cytokrom c i mitokondrie fraksjonen (fig. 6A). Som forventet, caspase-2 knock-down resulterte i motsatt på apigenin eller apigenin /paclitaxel-induserte forandringer av AIF, Endo G og cytokrom c i HeLa-celler (Fig. 6A). Videre, som vist i fig. 6B, over-uttrykk for caspase-2 tilsynelatende økt apigenin /paclitaxel-indusert kløyving av caspase-3 og PARP og banke ned av caspase-2 hemmet slik effekt av apigenin /paclitaxel. Vi har oppdaget at neste celle vitalitet å evaluere mediert effekt av caspase-2 på apigenin /paclitaxel utløst HeLa celle apoptose. Over-uttrykk for caspase-2 forårsaket ca 10% reduksjon av celle vitalitet både i Apigenin og co-behandlingsgruppene, og caspase-2 stillhet betydelig økt celle vitalitet.
