Abstract
Bakgrunn
signaltransduksjon nettverk blir stadig studert med matematisk modellering nærmer mens hver av dem er egnet for et bestemt problem. For kontekstualisering og analyse av signale nettverk med steady-state protein data identifiserte vi probabilistisk boolsk nettverk (PBN) som en lovende rammeverk som kan fange kvantitative endringer av molekylære endringer ved steady-state med en minimal parametrisering.
Konklusjon
i vårt case study resultater og, vellykket anvendt vi PBN tilnærming for å modellere og analysere det deregulerte platederivert vekstfaktor (PDGF) signalveien i Gastrointestinal stromal tumor (GIST). Vi eksperimentelt bestemte en rik og nøyaktig datasett av steady-state profiler av utvalgte nedstrøms kinaser av PDGF-reseptor-alfa mutanter i kombinasjon med inhibitor behandlinger. Anvendelse av verktøyet
optPBN
, vi montert en litteratur-avledet kandidat nettverksmodell til trening datasett som består av enkelt perturbasjonsteknikker forhold. Modell analyse foreslått flere viktige crosstalk interaksjoner. Gyldigheten av disse spådommene ble videre undersøkt eksperimentelt peker til relevant pågående crosstalk fra PI3K til MAPK signalering i kreftceller. Den raffinerte modellen ble vurdert med en valideringsdatasettet består av flere perturbasjonsteknikker forhold. Modellen dermed viste utmerket ytelse tillater å kvantitativt forutsi kombinatoriske svarene fra de enkelte behandlingsresultatene i dette kreft innstillingen. Den etablerte
optPBN
rørledningen er også allment gjeldende for å få en bedre forståelse av andre signalnettverk ved steady-state i en kontekst-spesifikk måte
Citation. Trairatphisan P, Wiesinger M, Bahlawane C , Haan S, Sauter T (2016) En Probabilistic boolsk Network tilnærming for analyse av kreftspesifikk Signale: A case Study of deregulert PDGF Signale i GIST. PLoS ONE 11 (5): e0156223. doi: 10,1371 /journal.pone.0156223
Redaktør: Julio Vera, Universitetet i Erlangen-Nürnberg, Tyskland
mottatt: 21 januar 2016; Godkjent: 11 mai 2016; Publisert: May 27, 2016
Copyright: © 2016 Trairatphisan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddene F1R-LSC-PUL-09PDGF og F1R-LSC-PUL-11PDGF ved University of Luxembourg. Panuwat Trairatphisan er en mottaker av stipend tildelt av Fonds National de la Recherche Luxembourg (AFR tilskudd nummer 1233900). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
signaltransduksjon nettverk er en av de viktigste funksjonelle lag i cellene. De formidle intra- og ekstra-cellulære signaler mot regulatorer som modulerer ekspresjonen av cellulære fenotyper som svarer til de typer og konsentrasjoner av de stimuli [1]. Generelt, er et signal transduksjon nettverk en stor og meget komplekst nettverk som omfatter flere intracellulære signalreaksjonsveier slik som mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK), fosfatidyl-inositide-3-kinaser /AKT /pattedyr-target-of-Rapamycin (PI3K /AKT /mTOR), og fosfolipase C-gamma /protein-kinase C (PLCγ /PKC) trasé [2]. Også, det finnes en rekke crosstalk interaksjoner mellom disse signalveier som bidrar til å finjustere signaler og for å bevare hele nettverkenes integritet på forstyrrelsene [3-5]. I en fysiologisk tilstand, blir signaler fra forskjellige stimuli integrert og transdusert til å regulere cellulære funksjoner og for å opprettholde homeostase av cellulære komponenter [6]. Når overføringsprosessene av disse signalene er deregulert, de resulterende avviksignalene ofte føre til forandringer av cellulære funksjoner som ble identifisert som etiologien av mange sykdommer som omfatter nevrodegenerative sykdommer, metabolske sykdommer, så vel som kreft [7-9].
gastrointestinal stromal tumor (GIST) er den vanligste primære mesenchymale neoplasi av mage-tarmkanalen. Disse tumorene som vanligvis oppstår fra forsterkningen av funksjonsmutasjoner av type III reseptor-tyrosin-kinaser, dvs. KIT i 78-90% av tilfellene og blodplate-avledet vekstfaktor alfa (PDGFRα) i 5-7% av tilfellene [10]. Som konstitutivt aktive overflatereseptorer, er disse muterte proteinene er de mest oppstrøms komponentene i mobil signaltransduksjon nettverk. Den førstelinjebehandling for GIST er kirurgisk fjerning kombinert med administrasjon av Imatinib mesylate, en tyrosinkinasehemmer med aktiviteter mot ABL, BCR-ABL, KIT, og PDGFRα /β. Den kliniske utfallet av førstelinjebehandling er 35% -49% 9 år overlevelse [11]. Men visse punktmutasjoner i GIST, f.eks en aspartat (D) for valin (V) mutasjon i aminosyreposisjon 842 i
PDGFRA
-genet, ble også vist å være forbundet med legemiddelresistens [12]. Flere hypoteser ble foreslått for å forklare de underliggende molekylære mekanismene for onkogene PDGFRα drevet GIST formasjon som oppbevaring av onkogene PDGFRα i intracellulære [13] eller deregulering av nedstrøms onkogene signalveier, se også [14]. Slike hypoteser fortsatt kreve ytterligere undersøkelser på molekylært nivå for å forstå hvordan signalene omformes og bearbeides mekanistisk i denne kreftformen innstillingen.
I de senere årene, nærmer ulike modellering i Systems Biology ble brukt til å modellere og analysere egenskapene til signal overføringsnettverk i både fysiologiske og patologiske tilstander. Dette inkluderer Bayesianske nettverk [15], boolske nettverk (BNS) [16], fuzzy logiske modeller [17], ordinære differensialligningen (ODE) -baserte modeller [18], partielle differensialligninger (PDE) -baserte modeller [19] og også stokastiske modeller [20], for å nevne bare noen få eksempler. Noen modellering har også demonstrert sammenhenger mellom deregulering av signaltransduksjon nettverk til patofysiologien av sykdommer, f.eks i metabolsk sykdom [21] og i kreft [22]. Valget av en egnet modellering rammeverk er avhengig av de problemstillinger og de tilhørende applikasjoner.
I vår studie har vi som mål å vurdere relevansen av foreslåtte crosstalk interaksjoner fra litteratur i sammenheng med deregulert plate avledet vekstfaktor ( PDGF) signalering i gastrointestinal stromal tumor (GIST) basert på steady-state protein data. På den eksperimentelle del, undersøkte vi en kombinasjon av forskjellige PDGFRα mutanter og signal lavmolekylære inhibitorer for å dissekere den molekylære strukturen av deregulerte PDGF signalveien, og til å generere et utstrakt tilsvarende sett av steady-state protein data. På modellering del, søkte vi probabilistisk boolsk nettverk (PBN) modellering, opprinnelig introdusert av Shmulevich et al. å modellere gennettverk i sammenheng med usikkerhet [23], for å vurdere crosstalk relevans i PDGF-signalering. Med tildelingen av sannsynligheter på boolske interaksjoner, er en binarised-state PBN i stand til å skildre enkelte regulatoriske effekter kodet som boolske regler i en stokastisk måte og er dermed egnet for å bestemme den usikre relevansen av crosstalk interaksjoner. I tillegg kan de molekylære virksomheten ved steady-state også være representert ved steady-state fordeling i PBN rammeverk, som tillater dem å være direkte i forhold til den normaliserte (ikke-diskretisert) steady-state protein data. For en fersk gjennomgang se [24].
Bortsett fra PBNs, det finnes også mange andre modellering rammeverk for studiet av signaltransduksjon nettverk. Imidlertid har hver av dem noen ulemper når de anvendes på dette spesielle tilfelle studien. Beskrive sammenhenger mellom signalmolekyler med betingede sannsynligheter i en bayesiansk nettverk rammeverk uttrykke sine relasjoner kvantitativt, men slike verdier ikke fange opp de underliggende reguleringsmekanismer mellom molekyler som kan forenkles og kodet som boolske regler. Boolske nettverk kan skildre reguleringsmekanismer av biokjemiske interaksjoner med logiske operatører. Men ikke resultatene fange finere skala kvantitative opplysninger om molekylære kinetikk. Varianten mange vurdert logiske nettverk gir mulighet for en mer finjustert beskrivelse av molekylære stater, men fortsatt lider av den iboende deterministisk natur og tillater ikke å fange usikkerheten nettverks interaksjoner. Utvidelser av boolske nettverk, f.eks ved tilsetning av usikkerhet i nettverkstilstander (for eksempel ved å tilordne tilfeldig startbetingelser og /eller tilfeldige sekvenser av innganger) og akkumulere de stokastiske resultater fra flere kjøringer kan også bli brukt til å utlede kvantitative mål fra samme system [6,25]. Imidlertid må man eksplisitt pålegge disse ekstra hensyn på toppen av den konvensjonelle boolsk nettverket rammeverket mens sannsynlighets funksjonen er allerede integrert i den opprinnelige PBN tilnærming. Flere kvantitative tilnærminger som fuzzy logikk eller ODE-baserte modeller gi ytterligere mekanistiske detaljer om nettverk på en kontinuerlig skala. De krever imidlertid en omfattende mengde forkunnskaper for å definere en passende matematisk formel og krever et omfattende sett av eksperimentelle data for å antyde kinetiske parametre.
Med hensyn til PBN som tilhører gruppen av sannsynlighets logiske modeller , andre relaterte modellering rammer i samme gruppe som Dynamic Bayesianske nettverk (DBNs) og Markov Logg nettverk (MLNer) ble også beskrevet. Det ble vist at analyseresultatene fra DBNs vanligvis gi lignende resultater som PBN når staten overgangs diagrammet er etablert [26]. Men ikke-lineær oppførsel i biologisk nettverk, for eksempel kompleks formasjon kunne ikke være direkte representert av betingede sannsynligheter i dynamisk Bayesiansk nettverk mens en slik interaksjon kan rett og slett være kodet med logiske operatører i PBN rammeverket. I tillegg ble det vist at PBNs kan også være representert i en mer generell form som Markov logikknettverk (MLNer) [27]. Denne tilnærmingen er ofte brukt i genetiske studier hvor nettverksstrukturen er stort sett ukjent, og tilkoblingen mellom nettverkskomponenter kan være svært tett [28]. Likevel MLNer er kanskje ikke egnet for studier av signaloverføringsnett i vårt tilfelle som forbindelsene mellom molekylene ofte forekommer i en en-til-en eller en-til-flere måte og retningsbestemt forhold mellom signalmolekyler er for det meste godt dokumentert. Vi valgte derfor og anvendt PBN i vår casestudie hvor vi kunne vise at PBN modellen er anvendelig for å analysere relevansen av crosstalk interaksjon. I tillegg viste vi at PBN modellen kan også forutsi kombinatoriske behandlingsresultater fra enkeltstimulerings målinger med høy nøyaktighet.
Materialer og metoder
Biologisk materiale
PDGFRα-mutant proteinene ble generert basert på pLNCX2-PDGFRα villtype uttrykk plasmid sjenerøst gitt av professor Andrius Kazlauskas (Boston). Denne sekvensen ble klonet til pcDNA5 /FRT /TO-vektor (Invitrogen ™) og konstitutivt aktive onkogene PDGFRα mutant som forekommer i GIST ble generert ved å innføre D842V punktmutasjon (PDGFRα-D842V-villtype,
«DV-WT»
). Basert på PDGFRα-D842V mutant, to PDGFRα-D842V-
«knock-out»
mutanter ble konstruert ved å innføre tyrosin (Y) til fenylalanin (F) punktmutasjoner, dvs. Y720F (PDGFRα-D842V-Y720F,
«DV-dMAPK»
) og YY731 /742FF (PDGFRα-D842V-YY731 /742FF,
«DV-dPI3K»
) som har vist seg å oppheve rekruttering av signalmolekyler som SHP2 og PI3K i PDGFRα-villtype-reseptoren, respektive. Alle punktmutasjoner ble introdusert med QuikChange kit (Stratagene) etter produsentens anbefalinger.
For å analysere signal oppførselen til mutant PDGFRα protein, en isogen Flp-In ™ cellelinjen ble konstruert basert på HEK293 cellelinjen som er naturlig blottet for endogen uttrykk for PDGFRα /p-proteiner. Som sådan, HEK293-celler ble ko-transfektert med FLP-In ™ målstedet vektor (pFRT /lacZeo, Invitrogen ™) og den regulatoriske vektoren (som koder for tetracyklin repressor protein, pcDNA ™ 6 /TR /Invitrogen) ved hjelp av TransIT®-LT1 transfeksjon reagens (Mirus) i henhold til produsentens anbefalinger. Celle kloner ble valgt ved dyrking i nærvær av 10 ug /ml Blasticidin og 100 ug /ml Zeocin ™ (både InvivoGen). Basert på denne isogene opphavelige cellelinje ( «293FR»), ble stabile cellelinjer ble generert ved seterettet rekombinasjon ved ko-transfeksjon av transgenet ekspresjonsplasmid (pcDNA5 /FRT /TO basert) i kombinasjon med FLP rekombinase ekspresjonsplasmid (pOG44, Invitogen). Stabilt transfekterte celler ble valgt og dyrket i nærvær av 100 ug /ml Hygromycin og 10 ug /ml Blasticidin [13].
Cell behandling og Western blot analyse
Forsøk ble utført av seeding 250.000 celler /brønn (12 brønns plate) i DMEM inneholdende 10% FBS, 2% L-glutamin og 25 mM HEPES i 12-brønners plater i 24-30 timer. Deretter ble vekstmediet skiftet ut og protein-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av 5 ng /ml doksycyklin (Sigma) under redusert serum (1% FBS) betingelser i 14 timer og i ytterligere 3 timer under serumfritt (0% FBS) betingelser. Farmakologisk inhibering ble utført ved tilsetning av enten 1 uM av PI3K inhibitor Wortmannin, 10 uM av MEK1,2 inhibitor U0126, 1 uM av pan-PKC-inhibitor GF109203X, eller 500nM for den PKC-α og PKC-β1 spesifikk hemmer Gö6976. Wortmannin og Gö6976 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich mens GF109203X og U0126 ble kjøpt fra Calbiochem.
Celler ble lysert på fatet med 300 ul 1x Lämmli buffer. Cellulære proteiner ble underkastet SDS-PAGE, overført til en nylonmembran (Amersham Hybond ™ -N /GE Healthcare ved ThermoFisher Scientific), blokkert med 10% BSA og probet med de respektive antistoffer. Alpha-tubulin ble også undersøkt som lasting kontroll. Fosfor-spesifikke antistoffer mot ERK1 /2 (pThr202 /pTyr204), PDGFRα (pTyr849) /β (pTyr857), AKT (pSer473) og PKC underlag (pSER) ble kjøpt fra Cell Signaling. Fosfor-spesifikke antistoffer for STAT5 (pTyr694) og PLCγ1 (pTyr783) ble kjøpt fra BD Biosciences. Antistoffer mot PDGFRα (C-20) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology®. Hver gel ble undersøkt samtidig mot alfa-tubulin å tillate kompensasjon for lasting variasjoner (ved hjelp av enten antistoff DM1A /Santa Cruz Biotechnology® eller PA1-38814 /Pierce ™). De sekundære antistoffer ble kombinert med IRdye, slik bildebehandling med LI-COR Odyssey system. De relative intensiteter av Western blot bildene ble kvantifisert med bilde Studio Lite versjon 4.0 ved hjelp av venstre-høyre og topp-bunn bakgrunn subtraksjon. Forsøkene ble gjort i 3 biologiske replikat med 3 tekniske replikater på hver Western blot. Kalibratoren prøve ble fremstilt fra en tidlig passasje av DV-WT cellelinje som induseres av 5 ng /ml doksycyklin.
Normalisering rørledning og datasett for modellering
starte fra forbindelsen erholdt rå eksperimentelle data, en kvalitets kontroll trinn ble påført ved å forkaste 1) datapunkter som overlapper med uspesifikke flekker og 2) datapunktene med lave signaler som skyldes trekkproblemer. Videre ble datapunkter med en tilsvarende tubulin signal på mindre enn 20 prosent i forhold til den maksimale signal i samme blot fjernet fra analysen på grunn av lav signal til støyforhold.
De resterende datapunktene var først normalisert til tubulin (lasting kontroll) og deretter til en kalibrator prøve for å korrigere for forskjellene på tvers av flere blotter. Den normaliserte midlere tekniske triplikater fra hver biologisk replikat ble oppsamlet og re-normalisert til den maksimale verdi for å generere den endelige gjennomsnitt og standardavvik for den modelleringsoppgave.
delt første sett av eksperimentelle data i to deler . Treningen datasettet består av 6 eksperimentelle forhold, inkludert negativ kontroll (alle signaler antas å være null), positiv kontroll (DV-WT) og 4 eksperimentelle forhold med enkle forstyrrelser av YF punktmutasjoner (DV-dMAPK og DV-dPI3K) eller signal hemmere ( DV-WT-Wortmannin og DV-WT-U0126). Valideringsdatasettet består av de 4 gjenværende forsøksbetingelser med kombinerte forstyrrelser.
Litteratur-avledet PDGF signalnettverk
Vi har bygget en mutant PDGF signalnettverk inkludert de store nedstrøms signalveier inkludert MAPK, PI3K /AKT /mTOR, PLCγ /PKC-reaksjonsveier, samt STAT5 som en annen fremtredende signale mål nedstrøms av den oncogene mutant (men ikke nedstrøms av villtype-reseptor) [13]. Interaksjoner og reguleringsmekanismer ble modellert i henhold til veletablert kunnskap [29,30]. Rekruttering områder av oppstrøms signalmolekyler til PDGFRα ble tidligere beskrevet [31,32]. Blant de tre store nedstrømssignalveier i PDGF-signalering, er det også finnes en rekke krysstalevekselvirkninger er foreslått i litteraturen som er oppført i tabell 1. I tillegg, bortsett fra som viser virkningene av inhibitorer på deres viktigste mål, vi også inkludert informasjon om en off-target virkning av Wortmannin på konvensjonell PKC [33] som kan være avgjørende for å forklare de oppnådde signale profilene i sammenheng med GIST.
PBN beskrivelse av PDGF signaleringsnett
basert på topologien til litteratur-avledede PDGF signaleringsnett, vi bygget et tilsvarende PBN modell som består av 27 knutepunkter (molekyler) og 40 kanter (interaksjoner). Flere interaksjoner regi på en node ble modellert som separerte boolske regler med tilsvarende valgsannsynligheter. Vi søkte på boolsk logikk gate «OR» for å kombinere ikke-eksklusive innganger i samme klasse mens hemninger var representert ved den kombinerte «AND» og «ikke» porter. I tillegg ble seleksjons sannsynlighetene for de boolske regler som representerer hovedveier er tilordnet til å være høy med flagget «H», som samtidig er festet til lav med flagget «L» for alle krysstale interaksjoner. Dette oppdraget sikrer at de optimaliserte valgsannsynligheter for samhandlingen (e) med flagget «H» vil alltid være høyere i forhold til samhandling (e) med flagget «L». For eksempel, hvis det er to aktive interaksjoner kobler mot et enkelt mål node mens en blir fra hovedbanen og en annen er fra de krysstale interaksjonen grense for optimalt valg sannsynligheten for hoved interaksjon (med flagg «H») vil bli 0,5 til 1,0, mens det vil være mellom 0 og 0,5 ved krysstale interaksjon (med flagg «L»). Denne implementeringen er integrert i den nyeste versjonen av
optPBN
verktøykasse (versjon 2.2.3) tilgjengelig på https://sourceforge.net/projects/optpbn. Hele settet av modellbeskrivelser og implementering av de boolske regler, inkludert tildeling av «H» og «L» flagg kan bli funnet i S1 File og beregnings skript av PBN modeller, samt eksempel på resultater inngår i S2 File.
optimalisering
Vi søkte rutenettet-baserte versjonen av
optPBN
verktøykasse (versjon 2.2.3) for å utføre optimalisering og analyse [39]. Modellen beskrivelse av PDGF signaleringsnett i det PBN-format ble kombinert med steady-state måledata fra 6 signalmolekyler inkludert fosforylerte former av PDGFRα, av PLCγ, av STAT5, av PKC-substrater, av ERK1,2, og av AKT , for å generere et optimaliseringsproblem. Målet for optimalisering er å identifisere de valg sannsynlighetene for hver boolske interaksjon i det PBN modellen som returnerer steady-state-egenskaper, dvs. de stasjonære fordelinger av molekylære tilstander, som svarer til måledataene. I
optPBN
rammeverk, representerer vi dynamikken i en PBN som ergodic Markov kjede hvor vi sikre ergodicity ved å innføre en liten forstyrrelse parameter «p» tilfeldig forurolige statene [40]. Den resulterende ergodic Markov-kjeden er derfor
irreducible plakater (alle stater kan nås med noen andre stater) og
periodisk plakater (alle stater kan være revisited i et ikke-periodisk måte) således inneha en unik stasjonær fordeling uansett til startbetingelsene. De to-stats Markov kjede tilnærming ble senere brukt til å bestemme antall nødvendige tidssteg til steady-state og til tilnærmet marginalisert steady-state distribusjon av hver utgang stat med en viss nøyaktighet [41] (se også rørledningen i fig 1). Alle parameterverdier ble valgt i henhold til forrige undersøkelse [39] dvs. forstyrrelse parameteren «p» = 0,001, utvalget av nøyaktighet parameter «r» = 0,025, og sannsynligheten for å skaffe resultater på definerte nøyaktighet «s» = 0,95, for å sikre etableringen av ergodic Markov kjeder basert på tilfeldige forstyrrelser mens steady-state distribusjon av hver node var minimal opprørt og tilnærming av steady-state distribusjons er relativt nøyaktig. I det siste trinnet, ble summen av kvadrerte feil (SSE) å sammenligne de simulerte molekylære stater og måledataene beregnes som indikator for godhet-of-fit.
Den dynamiske oppførselen til PBN modellen ble representert som en Markov kjede. En liten forstyrrelse parameter «p» ble innført for å sikre ergodicity av den respektive Markov kjede som er gjengitt
irreducible
(alle stater kan nås med noen andre stater) og
periodisk plakater (alle stater kan revideres i et ikke-periodisk måte) således besitter en unik steady-state fordeling uavhengig av startbetingelsene. De to-tilstand Markov-kjede tilnærming ble deretter anvendt for å bestemme antall nødvendige tidstrinn for å nå stabil tilstand (innbrenning periode), og å samle tilstrekkelig stort antall prøver for å tilnærme de utstøtte steady-state fordeling av utgang statene for en definert (justerbar) nøyaktighet. Legg merke til at flere evalueringer av innkjøringsperiode og innsamlede prøvene kan være nødvendig. Den rundet steady-state distribusjons tilsvarer sannsynligheten for utgangsnoden (e) være på, det vil si å være en, som bestemmes av de innsamlede prøvene.
I den undersøkte PBN modell av PDGF signalering, opp til 27 valgsannsynlig ble optimalisert på Grid’5000 infrastruktur ved hjelp av 160 parallelle kjerner (Intel CPU @ 2.50Ghz, 16 GB ram). 5000 prøver av parametersett ble evaluert ved to optimaliseringsalgoritmer, nemlig forskjells evolusjon (DE) og evolusjonære algoritme (EA). Tre runder med optimalisering ble utført der vi observert at optimalisering resultater generert av DE algoritmen ble konvergerte allerede etter 1500 iterasjoner (resultat ikke vist). Den best tilpassede kostnaden fra DE algoritmen ble valgt for sammenligning av passende kvalitet mellom modellvarianter sammen med Akaike informasjons Criterion (AIC) [42,43] og F-test for regresjonsmodell. Gjennomsnittlig og distribusjon av de optimaliserte valgsannsynligheter basert på de beste 500 parametersett ble deretter analysert.
Modellering av det deregulerte PDGF signal i BN og ODE-basert rammeverk
Vi søkte
BN /PBN verktøykasse product: [44] og
Systems Biology verktøykasse 2 (SBTB2)
revisjon 72 [45] for å modellere og analysere deregulert PDGF signalering i GIST også i BN og ODE rammer, henholdsvis. Når det gjelder modellering i BN rammeverk, fjernet vi alle negative tilbakemeldinger på noden PDGFR, fjernet de basale aktiviteter PTEN og PDK, samt antatt at Wortmannin ikke hemmer PKC effektivt, for å oppnå best mulig montering i BN rammeverket . For ODE modellering, vi brukt den massevirkningsloven å konvertere samspillet grafen til deregulert PDGF signaliserer til et sett av ordinære differensialligninger, se et eksempel på [20]. Vi har også lagt deaktivering /nedbrytningsreaksjoner og deres tilsvarende parametre for hvert molekyl for å balansere aktivering /syntese. 20 uavhengige optimaliserings kjøringer av ODE modell ble utført ved anvendelse av 50.000 parametersett som gjelder partikkel sverm-algoritmen (global optimizeren) etterfulgt av testing av ytterligere 50.000 parametersett som gjelder simpleksmetoden (lokal optimiser) med et parameterområde fra 0 til 100. Den best tilpassede kostnaden fra ODE modellen ble sammenlignet med de fra BN og PBN nærmer mens fordelingen av optimaliserte parametere fra alle 20 optimalisering går ble sammenlignet med de av PBN modell. Det komplette sett av beregnings skript og modelleringsresultater er tilgjengelig på https://sourceforge.net/projects/optpbn.
Resultater
ble observert
Ufullstendig hemming og mulig påvirkning av crosstalk interaksjoner fra eksperimentelle data
Vi undersøkte signal profiler av tre PDGFRα mutanter, dvs. DV-WT, DV-dMAPK og DV-dPI3K i kombinatorisk behandling med to signal hemmere, dvs. Wortmannin og U0126. I henhold til resultatene fra Western blot undersøkelsen (figur 2), cellesystemet og signallerings inhibitorer fungert riktig. Vi har observert at PDGFRα transgener ble uttrykt utelukkende ved doksycyklin induksjon og at basal fosforylering av signalmolekyler var meget lav. Dessuten ble fosforylerte signaler PDGFRα (pPDGFRα) funnet å være sammenlignbar mellom de ulike mutantene (fig 2). Denne observasjonen gjelder også fosforylert STAT5 (pSTAT5) signaler. De fosforylerte signaler PLCγ (pPLCγ) falt i DV-dMAPK mutant, noe som indikerer at SHP-2 rekruttering motiv Y720 påvirker også PLCγ aktivering (se figur 2). Parallelt redusert aktivitetene til nedstrøms signalmolekyler, dvs. fosforylert ERK1,2 (pERK1,2) og fosforylert AKT (pakt) ble observert i henhold til de inhiberende virkninger av YF mutanter og signallerings inhibitorer. Disse resultatene tyder på at oppheving av rekrutteringssider ved punktmutasjoner og signal hemmere jobbet effektivt på deres primære mål. I tillegg har vi funnet at hverken konstruksjonen av vårt cellesystem eller de inhibitor behandlingene benyttet i studien påvirke ekspresjonsnivået av de undersøkte signaleringskomponentene (se [13] og S1 figur).
[A] En eksempel sett av rå data fra Western blot eksperimenter er vist i figur 2A. Tre PDGFRα mutanter som inneholder D842V punktmutasjon ble undersøkt. En mutant inneholder ingen tilleggs YF punktmutasjon, dvs. villtype (DV-WT), mens de to andre inneholder enten Y720F (DV-dMAPK) eller YY731 /742FF (DV-dPI3K) punktmutasjoner som oppheve rekrutterings områder av oppstrøms signalmolekyl for MAPK og PI3K /AKT /mTOR veier henholdsvis. Disse forsøksbetingelser ble kombinert med behandling med to signalerings inhibitorer, dvs. Wortmannin (W) [1 uM], som i hovedsak hemmer PI3K, og U0126 (U) [10 uM], som i hovedsak hemmer MEK1,2. Doksycyklin anvendes for å indusere transkripsjon av konstitutivt fosforylerte PDGFRα mutanter. Eksperimentet ble utført i 3 biologiske replikat med 3 tekniske replikater. Signalene fra kalibratoren prøven (C) avledet fra den induserte DV-WT-cellelinje i et tidlig passasje ble brukt til å kalibrere relative intensitetene mellom Western blot. [B] De oppsummerte kvantifiserte Western blot-dataene er vist i figur 2B. Signalene ble normalisert mot tubulin og deretter kalibrert ved kalibratorbruksanvinsningen signaler. Den normaliserte midlere tekniske triplikater fra hver biologisk replikat ble oppsamlet og re-normalisert til den maksimale verdi for å generere den endelige gjennomsnitt og standardavvik verdier for modelleringsoppgave. De betydninger mellom to datapunkter ble vurdert med t-test; p-verdi 0,05 (*) og p-verdi 0,01 (**).
Blant de hemmende effekter som vi undersøkte, observerte vi at både Wortmannin og U0126 redusert fosforylering av sine nedstrøms signal mål nesten helt. I motsetning til dette DV mutanter med ytterligere YF punktmutasjoner leveres bare delvis inhibering, f.eks signalene fra pERK1,2 og pPLCγ i DV-dMAPK mutanter er bare redusert til det halve. Parallelt ble noen beviser på crosstalk interaksjon observert i datasettet. For eksempel kan inhibering av PI3K med Wortmannin reduserte også pERK1,2 signalet i MAPK-reaksjonsveien mens inhibering MEK1,2 med U0126 i tillegg økte pakt signalet i PI3K /AKT /mTOR-reaksjonsveien (figur 2B). Det skal bemerkes at den tverr regulering gjennom Wortmannin hemming er sterkere enn den som via U0126, med opp til 39% redusert pERK1,2 signal versus opp til 25% økning pakt signal i forhold til de ubehandlede betingelser. Dessuten er betydelig i 2 av 3 mutanter kryss-regulering av Wortmannin mens krysset hemmende effekt mediert av U0126 var signifikant bare i DV-WT tilstand (fig 2).
Innledende dataintegrasjon i PBN rammeverk foreslått viktige crosstalk interaksjoner fra kandidatnettverk
Vi integrert denne første datasettet inn i litteratur-avledet PBN modell av PDGF signal ved å bruke verktøyet
optPBN
. Den modellstruktur og en deling av datasettene er vist i figur 3. Til å begynne med vi startet med en modell topologi uten noen krysstale interaksjon for å undersøke om den modellen som inneholder bare de store onkogene trasé vil allerede være tilstrekkelig til å passe til trening datasett. Resultatene viste at den første modellen passet godt til pPDGFR, pSTAT5 og Pakt data, men likevel ikke kunne fange nedgang på pErk1 /2 signaler etter Wortmannin behandling. Dessuten fant vi at en modell variant med alt-eller-ingen hemming ikke kunne passe godt til enten pErk1 /2 eller pPLCγ data (se S2 figur).
[A] Modellen strukturen i litteraturen avledede PDGF signalering er vist i figur 3A. Den konstituerende aktivitet av mutert PDGFRα (mPDGFR) er induserbar av doksycyklin (DOX). Nedstrøms mPDGFR inkluderer 3 kanoniske intracellulære signalveier: MAPK, PI3K /AKT /mTOR og PLCγ /PKC veier samt regulatoriske mekanismer på PDGFRα. I tillegg har vi inkludert, STAT5, som ble vist å være heller aktiveres av onkogene PDGFRα mutanter [13]. SHP2, PI3K og PLCγ, merket med stjerne, er målene for YF mutanter. De basale aktiviteter PTEN og PDK var representert ved bPTEN og bPDK hhv. Fire signal hemmere, dvs. Wortmannin, U0126, GF109231X (GF109), og Gö6976, og deres mål er også avbildet.
