Abstract
kreft stamceller (cscs) er antatt å være ansvarlig for startfasen og tilbakefall etter kjemoterapi. Målrette cscs og ikke-cscs med spesifikke forbindelser kan være en effektiv måte å redusere kreft vekst og metastasering lunge. Målet med denne studien var å undersøke effekten av salinomycin, en selektiv hemmer av cscs, med eller uten kombinasjon med paclitaxel, i en metastatisk modell. For å evaluere effekten av disse stoffene i metastase og svulstens mikromiljø vi tok fordel av immunkompetente og svært metastatisk LLC musemodell. Aldefluor analyser ble brukt til å analysere ALDH +/- populasjoner i murine LLC og menneskelig H460 og H1299 lungekreft celler. Salinomycin reduksjon av andelen av ALDH + cscs i LLC celler, mens paclitaxel øket slik befolkning. Den samme effekt ble observert for de H460 og H1299 cellelinjer. Salinomycin redusert tumorsphere dannelsen kapasiteten LLC med mer enn 7 ganger, men paclitaxel viste ingen virkning. I
in vivo eksperimenter
, paclitaxel reduserte primærtumorvolum, men økte antallet metastatiske noduler (p 0,05), mens salinomycin hadde ingen effekt på primære tumorer, men redusert lungemetastaser (p 0,05). Kombinasjonen av begge legemidlene ikke forbedre virkningen av enkeltterapier. ALDH1A1, SOX2, CXCR4 og SDF-1 mRNA nivåene var høyere i metastatiske lesjoner enn i primærsvulster, og ble betydelig forhøyet i begge steder ved paclitaxel behandling. Tvert imot ble slike nivåer redusert (eller i noen tilfeller ble ikke endret) når mus ble administrert med salinomycin. Antallet F4 /80 + og CD11b + celler ble også redusert ved administrering av både narkotika, men særlig i metastasering. Disse resultatene viser at salinomycin rettet ALDH + lunge cscs, som har viktige terapeutiske effekter
in vivo
ved å redusere metastatiske lesjoner. I motsetning til paclitaxel (selv redusere primærtumorvekst) fremmer utvalget av ALDH + celler som sannsynligvis endre lunge mikromiljøet for å fremme metastase
Citation. Larzabal L, El-Nikhely N, Redrado M, Seeger W, Savai R, Calvo A (2013) ulike effekter av narkotika målretting Cancer Stem Cell (CSC) og ikke-CSC Bestander på Lung primære svulster og metastasering. PLoS ONE 8 (11): e79798. doi: 10,1371 /journal.pone.0079798
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 27 mars 2013; Godkjent: 25 september 2013; Publisert: 20.11.2013
Copyright: © 2013 Larzabal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært finansiert av «UTE prosjekt CIMA», ISCIII-RTICC RD06 /0020/0066 stipend, PIUNA (ref. 12028402) og Gobierno de Navarra (ref. 2179) (til AC). LL ble støttet av en Gobierno Vasco fellesskap. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til dødelighet over hele verden og den vanligste dødsårsaken av kreft hos menn og kvinner [1]. Mesteparten av lungekreft tilfeller hører til den ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) type (85% av dem). Prognosen for mer enn 60% av pasienter med NSCLC er dårlig, blant annet fordi avansert stadium ved diagnose utelukker kurativ kirurgi, og dels fordi medisinsk behandling er ineffektiv. I 2007, 5-års overlevelse for menn og kvinner diagnostisert med lungekreft var 16%. Dessverre har disse prosentsatsene ikke endret seg vesentlig i løpet av flere tiår til tross for betydelige fremskritt i diagnostikk og terapeutiske muligheter [2]. Selv om bruken av målrettet terapi for lungekreft har vært et gjennombrudd i kreftforskning, bare en liten andel av pasienter ha nytte av dem. Det er derfor et klart behov for nye terapeutiske alternativer for en mer effektiv behandling av denne tumortype. En ny terapeutisk vei som testes i prekliniske forsøk for en rekke solide svulster er rettet mot kreftstamceller (cscs). Den cscs hypotesen sier at cscs er ansvarlig for startfasen, celle overlevelse etter behandling, metastatisk spredning og tumorresidiv [3]. Selv om nyere bevis tyder på at menneskelige lungekreft, som andre svulster kan også havn CSC populasjoner, identifisering av menneskelige lunge cscs har vært hemmet av mangel på pålitelige stamcellemarkører. Uttrykk og aktivitet av aldehyd dehydrogenase (ALDH) tjene som CSC markører i bryst [4] og lunge [5] svulster. Videre har økt ALDH-aktivitet er funnet i stamcellepopulasjoner i forskjellige tumortyper, inkludert human multippel myelom, akutt myeloid leukemi, hjerne, bryst, lever, tykktarm, bukspyttkjertel [6], [7] og, mer nylig, i lunge, der ALDH1A1 ekspresjon er assosiert med dårlig overlevelse i en kohort av fase i NSCLC [8]. Den ALDH + fraksjonen er beriket i tumor initiere celler med økt migrasjon, heft evne og metastatiske potensial [9]. Sammen utgjør disse funnene tyder på at måling av ALDH nivåer eller enzymatisk aktivitet kan tjene som en lunge CSC markør.
cscs er resistente mot mange av dagens kreft behandlinger, inkludert kjemoterapi og strålebehandling [10], [11]. Dette tyder på at mange kreftterapier, mens drepe mesteparten av tumoren, kan til slutt svikte fordi de ikke eliminerer cscs, som klarer å overleve og for å regenerere nye tumorer. Nyere eksperimentelle bevis antyder også en stor plastisitet av både CSC og ikke-CSC populasjoner [12]. Dette har ført til at noen forfattere til hypoteser som rettet mot både CSC og ikke-CSC populasjoner vil trolig være nødvendig for en mer effektiv behandling, men dette problemet ikke har blitt eksperimentelt testet ennå.
Salinomycin, en kalium ionofor, var nylig identifisert som en selektiv hemmer av menneskelige brystkreft stamceller
in vitro product: [13]. Selv om virkningsmekanismen av salinomycin er ennå ikke er klar, synes det å opptre som en potent inhibitor av flermedisinresistens P-glykoprotein (P-gp /MDR1 /ABCB1) [14].
tumorcellemigrering og metastaser, som viktige elementer av tumorbiologi deler mange likhetstrekk med leukocytter menneskehandel, som er kritisk regulert av kjemokiner og deres reseptorer. Akkumulerende data tyder på at CXCR4 (CXC kjemokin reseptor-4) og SDF1 (stroma celle-avledet faktor-1, eller CXCL12) kunne regulere migrasjon og metastase i en rekke lunge, bryst og prostata cancerceller [15]. Videre CXCR4 overekspresjon korrelert med dårlig prognose i mange tumortyper [16]. Cscs uttrykker CXCR4 reseptoren og svare på en kjemotaktisk gradient av sin spesielle ligand SDF-1 [17], noe som tyder på at cscs sannsynligvis representerer en undergruppe stand til å initiere metastaser [18]. En bedre forståelse av trekkende mekanisme som involverer kreftceller og cscs ville gi mer hensiktsmessige verktøy for å utvikle nye behandlingsformer for å redusere både lokale og gjentagelse.
cscs samhandle med omkringliggende ikke-maligne celler og begge celletyper er co- regulert innenfor svulsten mikromiljøet [19]. Celler fra svulsten mikromiljøet ikke bare kunne forbedre vekst av primærtumor, men også lette dens metastatisk spredning til fjerntliggende organer. Vellykket metastatisk utvekst er således avhengig av evnen til kreftcellene for å dra nytte av den omgivende mikromiljøet ved hvert trinn av den metastatiske prosess. Tumor mikromiljøet omfatter flere celler, inkludert endotelceller, stromale fibroblaster og en rekke av benmargceller avledet (BMDCs) slik oss makrofager, myeloide-avledede celler dempere, Tie2-uttrykkende monocytter og stamceller [20]. Når tumorceller kommer til området for metastasering de har til å bli tilpasset til en ny mikromiljø som er forskjellig fra den i den primære svulsten [21]. De nøyaktige tumor-stroma interaksjoner i primærtumor og metastaser området er i stor grad ukjent.
Forrige banebrytende arbeid har vist at salinomycin og paclitaxel utstilt forskjellige moduser av handlingen i en musemodell for brystkreft, med salinomycin inneha CSC-spesifikke inhiberende aktivitet [13]. Tatt i betraktning at cscs kan være viktige mediatorer av metastaser, hypotese vi at spesielt rettet mot cscs med salinomycin vil redusere metastatisk potensial av gjenværende tumorceller. For å løse denne hypotesen, undersøkte vi effekten av den antatte CSC-spesifikke medikament salinomycin på veksten og metastatisk spredning av NSCLC. Vi rapporterer her at salinomycin differensielt påvirker NSCLC primær tumor vekst og metastatisk potensial i forhold til de i den konvensjonelle kjemoterapeutiske middel paclitaxel, biologisk aktivitet korrelerer med målinger av CSC trekk. Også ved bruk av Lewis lungekarsinom (LLC) musemodell, rapporterer vi hvordan disse stoffene påvirker svulsten mikromiljøet i både primære og metastatiske kreft nettsider.
Materialer og metoder
Cell Kultur og forbindelser
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP som brukes i denne studien inkluderte mus Lewis lungekarsinom (LLC) og menneskelig H460 og H1299. Alle cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og ble holdt i RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA) med 10% føtalt bovint serum (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og 1% penicillin-streptomycin (Lonza, Basel, Sveits), ved 37 ° C og 5% CO
2 atmosfære. Salinomycin og paclitaxel ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO, USA) og ble oppløst i 20% DMSO i PBS (kjøretøy). De endelige konsentrasjoner av salinomycin og paclitaxel brukes i alle
in vitro
analyser var 1 mikrogram /ml for salinomycin og 40 ng /ml for paclitaxel. Celler ble behandlet med vehikkel ble anvendt som kontroller. Disse dosene ble brukt basert på tidligere publikasjoner [13].
Sphere Formation analysen
For sfære formasjon, ble cellene dyrket i serumfritt dyrkningsmedium DMEM /F12 + GlutMAX ™ (Gibco, Paisley, UK ) supplert med vekstfaktorer (MEGM SingleQuots, Lonza, Basel, Sveits) og B27 (Gibco, Paisley, UK). Celler ble sådd ut i 6-brønns ultralave festeplater (Corning, Lowell, MA, USA) ved en tetthet på 1000-5000 celler per brønn, avhengig av cellelinjen og dyrket i 7-10 dager. For å vurdere den selvfornyelse potensialet av disse cellene, ble den første generasjonen av sfærer oppsamlet ved mild sentrifugering, dissosiert til enkeltcellesuspensjon, og dyrket under de betingelser som er beskrevet ovenfor i ytterligere 7 til 10 dager. For å teste virkningen av narkotika i sfæren formasjonen evnen til ble cellene sådd ut i nærvær av 20% DMSO (kjøretøy), salinomycin (1 pg /ml) eller paclitaxel (40 ng /mL) i begynnelsen av eksperimentet, uten ytterligere Tilsetningen av stoffet. Etter 7 dager ble platene analysert for lunge tumorspheres dannelse og antallet kuler pr brønn ble kvantifisert ved bruk av et invertert mikroskop (Olympus, Hamburg, Tyskland). For å evaluere effekten av medikamentbehandling i ALDH + populasjonen i LLC-avledede sfærer ble de formede sfærer ble behandlet med paclitaxel (40 ng /ml) eller vehikkel i 72 timer. Etter inkubasjon ble Aldefluor analyser utført av flowcytometri.
ALDH Farging og Cell Sorting
Aldefluor kit (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) ble brukt til å profilere og separate celler med høy og lav ALDH enzymatisk aktivitet. Forsøkene ble gjennomført i henhold til produsentens anvisninger. I korthet, en x 10
6-celler ble inkubert i Aldefluor buffer inneholdende den ALDH proteinsubstrat (BAAA, BODIPY-aminoacetaldehyd, 1 mmol /L) i 30 minutter ved 37 ° C. Celler som kan katalyserer BAAA til sin fluoriserende produkt (BAA) ble vurdert ALDH +. Sortering porter for FACS ble trukket i forhold til celle baseline fluorescens, som ble bestemt ved tilsetning av ALDH-spesifikk hemmer diethylaminobenzaldehyde (DEAB) under inkuberingen. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD; Sigma-Aldrich) ble anvendt for å telle levedyktige, apoptotiske og døde celler (figur S1A). Celler ble sortert i en FACSAria Ilu (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og renheten av sorterte cellene ble analysert etter at prosessen var fullført (fig S1B). Dataene ble analysert ved Cell quest Pro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og FlowJo programvare (Ashland, USA).
CXCR4 flowcytometrisystemer
Etter inkubasjon av LLC celler med kjøretøy, salinomycin (1 pg /ml) eller paclitaxel (40 ng /ml) i 72 timer ble cellene vasket en gang med PBS og deretter høstet med 0,05% trypsin /0,025% EDTA. Frigjorte celler ble vasket med PBS /EDTA /BSA (vaskebuffer) og resuspendert i vaskebuffer (10
6 celler /100 ul). CXCR4 antistoff (Sigma) eller dets respektive isotype kontroll ble tilsatt til cellesuspensjonen ved 1:50 konsentrasjon og inkubert ved 4 ° C i 30 minutter. De merkede cellene ble vasket igjen, og det sekundære antistoff konjugert til FITC (BD Bioscience) ble tilsatt og inkubert ved 4 ° C i mørke i 30 minutter. Cellene ble vasket og analysert på en FACSCalibur (BD Biosciences).
klonogene analysen
For å evaluere klonogene potensialet i ALDH positive og negative populasjoner av LLC celler etter sortering, ble 500 celler per brønn belagt inn i 6-brønners plater i adherente betingelser. Etter 10 dager i kultur, ble kolonier fiksert med 4% bufret formalin (Panreac, Barcelona, Spania) og farget med 2% krystallfiolett. Antallet kolonier per brønn ble bestemt.
Cell Proliferation og Cvtotoksisitetsmålinq
Celleproliferering ble bestemt ved MTT-analyse (Roche, Palo Alto, USA). Sortert ALDH positive og negative populasjoner av LLC celler eller usorterte LLC celler ble sådd i 96-brønners kulturplater (1000 celler per brønn) i 100 ul medium. 24, 48, 72 og 96 timer senere 10 ul MTT ble tilsatt. Spektrofotometrisk absorbans ble målt ved 570 nm.
For cytotoksisitet assay, LLC celler dyrket i vedheftende eller i anoikis-resistent (kule-dannende betingelser) ble sådd ut i 96-brønners plater (1000 celler per brønn) og behandlet med serielt fortynnet paclitaxel (0-100 nM). Sytti-to timer etter inkubasjon ble MTT analyser utført etter produsentens protokoll. Prosentandelen av celleoverlevelse ble normalisert ved å dividere den endelige absorpsjon av behandlede prøver med den for den ubehandlede kontroll, og IC
50 ble beregnet.
RNA ekstraksjon og kvantitative Real Time PCR (QRT-PCR)
Totalt RNA ble isolert fra celler, kule-inneholdende pelleter, eller prøver frosset vev ved hjelp av QIAamp RNeasy MINIKIT (Qiagen, Chatsworth, CA). Etter DNase I-behandling, revers transkripsjon ble utført med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) for å generere komplementært DNA (cDNA). QRT-PCR ble kjørt i en Applied Biosystems 7900 Real-time PCR maskin. QRT-PCR-reaksjoner ble utført med SYBR grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) og GAPDH-nivåer ble anvendt som kontroller. Den midlere syklusterskelverdi (Ct) for genet av interesse, normalisert til Ct-verdien av husholdningsgenet (GAPDH) ble brukt for å beregne genekspresjon verdier. Analysene ble utført for å kvantifisere mRNA nivåer av mus og /eller menneskelig ALDH1A1, SOX2, CXCR4, SDF-1, CD11b, VEGF og VEGFR1 gener. Primersekvensene er vist i tabell S1. Data er gitt som 2
-ΔΔCt eller 2
-ΔCt.
Migrasjon analysen (Boyden Chamber)
Migrasjon analyser ble utført i en Boyden kammer. 20000 celler per brønn i serumfritt medium ble podet i den øvre transwell av 24-brønners plater (Costar) i nærvær av bærer, salinomycin (1 pg /ml) eller paclitaxel (40 ng /ml). Medium med 10% serum, anvendt som en kjemoattraktant, ble plassert i det nedre kammeret. Etter 48 timer ble cellene i øverste kammer tørkes av med en bomullspinne, og cellene i det nedre kammeret ble fiksert med 4% formalin og farget med krystallfiolett. Antall trekkende celler ble evaluert med en Leica DMIL LED mikroskop bruker LAS EZ-programvare (Leica Microsystems).
dyreforsøk
Dyrestudier ble utført i henhold til de etiske retningslinjene som er fastsatt av vår institusjoner (Universitetet i Navarra), under en godkjent dyr protokollen av komité for etikk av dyreforsøk ved Universitetet i Navarra (069/11). Alle dyr ble huset i mikroisolatorbur og i SPF forhold. Alle kirurgi prosedyrer ble utført under bedøvelse og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse for dyrene.
For evalueringen av svulsten initiere evnen til CSC, seks uker gamle NSG (NOD SCID IL2Rg mus fra The Jackson Laboratory, USA) ble anvendt. Ett tusen eller fem tusen ALDH positive eller negative sortert LLC celler ble injisert subkutant i flankene av mus i PBS. Tumorvolumet ble målt etter 3 uker med en elektronisk skyvelære. Ved slutten av forsøket ble dyrene avlivet ved CO
2 innånding. Fire mus per gruppe ble brukt.
For å teste effekten av salinomycin og paclitaxel
in vivo, etter 5 × 10
5 LLC celler ble injisert subkutant i flanken av 8 uker gamle C57BL /6-mus. Medikamentbehandling ble startet 6 dager etter tumorcelle-injeksjon, tidspunkt ved hvilket den primære tumoren nådde omtrent 50 mm
3. Dyrene ble administrert enten med 20% DMSO i PBS (kjøretøy), salinomycin (5 mg /kg), paclitaxel (5 mg /kg), eller en kombinasjon av begge medikamenter etter 2 dager, ved intraperitoneal injeksjon, i 5 uker. Disse dosene og behandlingsplaner ble valgt basert på tidligere publikasjoner [13]. Svulster ble målt etter 2 dager med en elektronisk caliper. Når primærsvulster nådd ca 300 mm
3, svulster ble fjernet kirurgisk og snittene ble sydd. Operasjonen ble utført med bedøvede mus ved hjelp av isofluran (Esteve, Barcelona, Spania) og i aseptiske forhold. For å redusere lidelsene til dyrene ble de gitt sammen med ketoprofen (5 mg /kg) hver 24. time i 3 dager etter operasjonen. Tre uker senere ble dyrene avlivet av CO
2 innånding og lunger ble fjernet for videre analyse av metastatiske knuter. Hver gruppe består 5 mus og forsøket ble gjentatt to ganger, for å bekrefte resultatene.
Farging og bildeanalyse
Tissue seksjoner ble fiksert i 4% bufret formalin, innstøpt i parafin, og seksjonert (5 mikrometer tykkelse). Lysbilder ble farget med H E. For lungemetastase kvantifisering, digitale bilder fra lunge seksjoner fra hvert av dyrene (n = 5 per gruppe) ble kjøpt med en Axioplan 2 mikroskop (Zeiss, Tyskland) ved hjelp av en in-house Metamorph makro (Molecular Devices, USA), som gjør det mulig å komponere mosaikk bilder tatt på 2.5x, med automatisk fokus og skygge korreksjon. Bilder ble automatisk analysert med ImageJ og området okkupert av tumornoduler med hensyn til ikke-ondartet lungeområdet ble kvantifisert.
Immunohistochemistry og immunfluorescens
For å flekke mastceller, en løsning av toluidinblått ( 0,1%) ble påført på vevssnittene etter deparaffinization og rehydratisering.
for CD31 immunhistokjemi, antigen gjenfinning ble utført ved oppvarming av lysbilder i en mikrobølgeovn i 20 min i 10 mM citratbuffer ved pH 6. Vevene ble deretter inkubert i 1 time ved RT med primær anti-CD31-antistoff (Dianova, Hamburg, Tyskland) ved 1:20 fortynning. Deretter ble objektglassene inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med en sekundær kanin anti-rotte-antistoff (Dako) ved 1:50 fortynning i Dako Fast antistoff-fortynningsmiddel (Dako). Platene ble deretter inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med EnVision ™ anti-kanin-deteksjonssystem (Dako). Peroksydase-aktivitet ble utviklet med DAB som tidligere beskrevet. Prøvene ble kontra med haematoxylin, dehydrert og montert med DPX (VWR, Leicestershire, UK). For kvantifisering, ble 150 tilfeldige bilder (200x) per forsøksgruppen (30 per dyr) tatt med en Leica mikroskop (Wetzlar, Tyskland) utstyrt med Analysis ™ -programvaren. Positiv farging ble filtrert fra ikke-farget vev og kvantifisert med bilde J (NIH Image, Bethesda, USA).
For immunfluorescens, ble vevssnitt hydrert og inkubert med trypsin i 10 min for antigen gjenfinning. Deretter vev ble neddykket i 5% BSA med 0,1% Triton-X i PBS i 1 time ved romtemperatur, for å unngå uspesifikk binding av antistoffer. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt for immunfluorescens merking: anti-F4 /80 (1:200, ABD Serotec, Raleigh, North Carolina, USA) og anti-CD11b (1:100; Abcam, Cambridge, UK). Etter inkubasjon med de primære antistoffer ved 4 ° C over natten, ble objektglassene inkubert med AlexaFluor 488-merket sekundært antistoff (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, UK), motfarget med atom 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og farging montert med Dako fluorescerende montering media (Dako). Kvantifisering av CD11b, F4 /80 og toluidinblått positive celler ble utført av dataassistert bildeanalyse, ved hjelp av Leica DMLA og QWin 500IW systemer (Leica Instruments). I primære tumorer, ble hver prøve analysert på 5-10 tilfeldig valgte optiske felt og prosentandelen av positive celler i forhold til det totale antall celler farvet med DAPI ble beregnet. I lunge knuter, ble positive celler tellet manuelt fordi vi har funnet det mer pålitelig i slike små lesjoner, og data ble uttrykt som en prosentdel av tumorområdet (mm
2).
For ALDH1A1 immunofarging, H460-celler ble dyrket i kammers objektglass (BD Biosciences) og, når sammenflytende, ble objektglassene fast /permeabilisert i aceton /metanol 01:01 i 5 min. Endogen peroksidase ble stanset med en 3% -ig hydrogenperoksyd-oppløsning og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert i 30 minutter med 5% geite normalt serum. Cellene ble deretter inkubert med anti ALDH1A1 antistoff (BD), at 1:100 fortynning, i 2 timer ved RT og skyllet i TBS. Påvisning av primært antistoff ble utført med Envision anti-mus-system (Dako, Glostrup, Danmark). Peroxydaseaktivitet ble utviklet med DAB (3,3′-diaminobenzidin, Dako) og cellene ble kontra med haematoxylin. Til slutt, lysbilder var cover-gled med glyserol monteringsmedium.
statistiske metoder
statistiske forskjeller mellom gruppene ble undersøkt med studentens
t
test eller ANOVA for uparede para variabler , og Mann-Whitney
U
test eller Kruskal-Wallis for uparede ikke-parametriske variabler. Normalitet ble analysert med Shapiro-Wilk test. Data ble analysert med SPSS statistisk programvare (versjon 17.0 for Windows SPSS) og GraphPad Prism 5-programvaren (GraphPad). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM eller SD, og statistisk signifikans ble definert som P 0,05 (*), P 0,01 (**), og P . 0,001 (***)
Resultater
Identifikasjon av ALDH + CSC-lignende Befolkning i LLC Cells
Vi og andre har tidligere vist at måling av ALDH aktivitet er en egnet metode for identifisering av lungekreft stamceller (cscs) [22] , [23], men om dette da kan brukes til å isolere og karakterisere LLC CSC populasjonen var ukjent. For å vurdere tilstedeværelsen av denne populasjonen i den LLC-cellelinjen basert på deres ALDH enzymatisk aktivitet, ble Aldefluor assay fulgt av FACS-analyse utført. Som vist i figur 1A, LLC-cellelinjen hadde et gjennomsnitt på 11,43 ± 0,38% ALDH-positive celler, som er i samsvar med tidligere publiserte resultater for andre humane cellelinjer og primære celler fra pasienter [5]. Bruken av DEAB (en bestemt ALDH hemmer) tjente som negativ kontroll.
A. Den ALDH + cellefraksjon (målt ved Aldefluor assays) representerer ~11% av totale celler i LLC-cellelinjen. B. Isolert LLC ALDH + celler besitter selvfornyelse evne som vist ved deres evne til å generere både ALDH +/- populasjoner etter 8 dager i kultur, mens ALDH- celler bare gi opphav til negative celler. C. Antall kloner generert av LLC ALDH + og ALDH- celler etter sortering. Den ALDH + befolkningen viser høyere klonogene kapasitet enn sin negative motstykke. D. Antall kuler generert av LLC ALDH +/- celler. E. QRT-PCR analyse av ALDH1A1 mRNA nivåer i LLC celler dyrket i tilhenger forhold, primære kuler (S1) og kuler av andre generasjon (S2). F. Chemoresistance til paclitaxel fra LLC dyrket i enten adherente betingelser eller i kuler (S1) ble målt med et MTT-assay. IC
50 for heft LLC celler: 35,8 nM; IC
50 for Advisor S1 sfærer: 93,6 nM. Data- og feilfelt: gjennomsnitt ± SD. * P 0,05. ** P 0,01. *** P 0,001. Alle forsøkene ble gjentatt minst 3 uavhengige ganger (hver av dem i tre paralleller).
Typiske egenskaper for CSC inkludere sine kapasiteter for selvfornyelse og differensiering,
in vivo
tumorigent potensiale og motstandsdyktighet overfor kjemoterapi [24]. Hvis du vil kontrollere disse funksjonene i LLC celler, må vi først undersøkte selvfornyelse evne ALDH + befolkningen. Etter ALDH celle sortering, ble både positive og negative cellefraksjoner belagt separat. Etter 8 dager i kultur, ble Aldefluor analyse utført for å analysere fenotypen av den resulterende cellepopulasjon. Cultured ALDH + celler var i stand til å regenerere både ALDH positive og negative cellepopulasjoner. Tvert imot, dyrkede ALDH- celler var ikke i stand til å generere den ALDH + populasjonen (figur 1B). Dette resultat viser at bare ALDH + celler er i stand til å rekonstituere hele cellepopulasjon, en typisk egenskap ved cscs. MTT-analyser viste at det var ingen forskjeller i veksttakt mellom ALDH + og ALDH- cellepopulasjoner (Figur S1C). Ingen forskjeller ble funnet mellom usortert befolkningen foreldre og ALDH + eller ALDH- populasjoner (data ikke vist).
Å sammenligne tumorigent potensialet ALDH + og ALDH- LLC celler, ble NSG mus injisert subkutant med 1 × 10
3 eller 5 × 10
3 celler. Som vist i tabell 1, ble tumorvekst observert hos 3 av 4 mus etter inokulasjon med 1 x 10
3 ALDH + celler, mens ingen tumorvekst ble observert i ALDH- cellene. Etter injeksjon av 5 x 10
3 ALDH + -celler, 3/4 mus presentert en tumormasse med et gjennomsnittlig tumorvolum på 235,3 ± 64,6 mm
3, mens bare 2/4 mus som utviklet en liten tumor etter injeksjon av ALDH- befolkningen (med en svulst volum på 27,45 ± 5,47 mm
3).
Vi analyserte klonogene potensialet i de LLC ALDH + og ALDH- cellefraksjoner av platekledning 500 celler per brønn i en 6-brønns plate og dyrking av dem ved klonal tetthet i 10 dager. ALDH + celler ga opphav til en betydelig høyere antall kolonier enn ALDH- celler (p 0,05; figur 1C), og viser dermed at ALDH + celler viser økt clonogenicity. Den klonogene evne av foreldrecellelinjen var mellom mellom ALDH + og ALDH- fraksjoner (data ikke vist)
ALDH + celler produseres et høyere antall kuler enn ALDH- celler. (P 0,01; Figur 1D). Vi har også analysert evne av hele LLC populasjonen for å danne kuler og for å fornye seg selv, noe som gir opphav til en sekundær sfære populasjon (S2). Etter 7 dager i serum og tilhenger fri tilstand, LLC celler dannes primære sfærer (S1). Disaggregering av S1 kuler og kultur i samme forhold demonstrerte dannelsen av en sekundær (S2) sfære befolkningen. For å bekrefte at sfærene ble anriket i cscs, vi kvantifisert ALDH mRNA-nivåer i celler dyrket i adherente og ikke-adherente (S1 og S2 kuler) betingelser. Ved QRT-PCR-analyse vi observert at S1 kuler hadde signifikant høyere (p 0,001) ALDH mRNA-nivåer enn celler dyrket i adherente betingelser, og at S2 sfærer var også anriket på ALDH uttrykk (p 0,05) sammenlignet med S1 kuler (figur 1E). Videre Aldeflour analyse viste et høyere antall ALDH + celler i kuler (34,2% ± 6,56%) enn i celler dyrket i adherente betingelser (11,43 ± 0,38%) (Suplemmentary figur 1D og figur 1A). Derfor er disse eksperimentene bekreftet at anoikis-resistente sfærer inneholdt en beriket ALDH + CSC-lignende befolkningen som var i stand til å gjennomgå selvfornyelse.
En annen egenskap ved cscs er deres motstand mot konvensjonelle kjemoterapeutika. Således brukte vi paclitaxel, en vanlig brukt medikament mot NSCLC, for å evaluere chemoresistance av LLC celler dyrket i kuler eller i adherente betingelser. Som vist på figur 1F, LLC celler dyrket som kuler hadde høyere overlevelsesrater når de ble behandlet med forskjellige doser av paclitaxel enn celler dyrket i adherente betingelser. IC
50 verdier for begge cellepopulasjoner var signifikant (p 0,01) forskjellig: IC
50 for heft LLC celler var 38,5 nM og 93,6 nM for Advisor-avledet sfærer (figur 1F). For å møte enten S1-avledet celler samsvarer med ALDH + befolkningen med økt motstand mot paclitaxel, analyserte vi ved Aldefluor andelen ALDH + celler i kuler etter behandling. Uventet, vi ikke observere en betydelig økning i andelen ALDH + celler i respons til paclitaxel i Advisor modellen i sfære kultur forhold. Men som vi skal beskrive nedenfor, var dette fenomenet tydelig i menneske NSCLC modeller, støtter forutsetningen at S1-avledet celler inkluderer paclitaxel-resistente ALDH + celler. Til sammen alle disse resultatene tyder sterkt på at den ALDH + brøkdel av LLC celler tilsvarer en resistent CSC befolkningen.
Differensial Effekt av Salinomycin og Paclitaxel på Targeting CSC vs ikke-CSC Bestander
etter å ha vist at Advisor cellelinje har en ALDH + sub-populasjon med cscs funksjoner, ønsket vi å studere effekten av salinomycin, en nylig identifisert forbindelse som selektivt hemmer menneskelig brystkreft stamceller
in vitro product: [13] . Vi sammenlignet effekten av salinomycin med at av paclitaxel i CSC vs ikke-CSC populasjoner.
For påfølgende
in vitro
eksperimenter, behandlet vi LLC celler med 1 mikrogram /ml salinomycin eller 40 ng /mL paclitaxel, slik at de kan komme seg i 24 timer i fravær av medikament. For å bestemme den spesifikke effekten av salinomycin og paclitaxel på ALDH +/- cellepopulasjoner, ble Aldefluor analyser etterfulgt av FACS analyse. Etter cellesortering, ble ALDH positive og negative celler sådd ut hver for seg og administreres sammen med salinomycin (1 pg /ml) eller paclitaxel (40 ng /ml) i 72 timer og cellelevedyktigheten ble bedømt ved MMT-analyser. Som vist i figur 2A, overlevelse av ALDH + -celler etter salinomycin behandling var signifikant lavere enn den til ALDH- celler (p 0,05). I kontrast, etter paclitaxel behandling overlevelse av ALDH + celler ble ikke påvirket, mens bare 67,7% ALDH- celler var i live (p 0,05). Disse resultater viser at salinomycin er svært cytotoksisk for ALDH + celler, men paclitaxel påvirker ALDH negativ populasjon.
A. * P 0,05. * P 0,05. * P 0,05. ** P 0,01. ** P 0,01.
