Abstract
De celleoverflateproteiner CD133, CD24 og CD44 er mulige markører for kreft stamcellepopulasjoner i tykktarmskreft, assosiert med aggressiv krefttyper og dårlig prognose. Det er viktig å forstå hvordan disse markørene kan forutsi behandlingsresultatene, bestemmes av faktorer som radioresistance. Omfanget av denne studien var å vurdere forbindelsen mellom EGFR, CD133, CD24, og CD44 (inkludert isoformer) ekspresjonsnivåer og strålingsfølsomhet, og dessuten analysere påvirkningen av AKT-isoformer på de uttrykk mønstre for disse markørene, for bedre å forstå de underliggende molekylære mekanismer i cellen. Tre koloncancercellelinjer som ble anvendt, HT-29, DLD-1, og HCT116, sammen med DLD-1 isogene
AKT
knock-out cellelinjer. Alle tre cellelinjer (HT-29, HCT116 og DLD-1) uttrykte varierende mengder CD133, CD24 og CD44 og toppen ti prosent av CD133 og CD44 uttrykker celler (CD133
høy /CD44
høy) var mer motstandsdyktig mot gammastråling enn ti prosent med lavest uttrykk (CD133
lav /CD44
lav). Den AKT uttrykk var lavere i brøkdel av celler med lav CD133 /CD44. Nedbryting av akt1 eller akt2 hjelp knock out celler viste for første gang at CD133 uttrykk var assosiert med akt1 men ikke akt2, mens CD44 uttrykk ble påvirket av tilstedeværelsen av enten akt1 eller akt2. Det var flere gener i cellen adhesjon sti som hadde signifikant høyere uttrykk i
AKT
2 KO cellelinje i forhold til
AKT
en KO cellelinje; men viktige gener i epiteliale til mesenchymale overgang pathway (
CDH1
,
VIM, TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, FN1, FOXC2 Hotell og
CDH2)
gjorde ikke forskjellig. Våre resultater viser at CD133
høy /CD44
høyt uttrykkende tykktarmskreftceller er forbundet med AKT og økt stråling motstand, og at ulike AKT isoformer ha varierende virkninger på ekspresjonen av kreft stamcelle markører, som er en viktig faktor når du målretter AKT i en klinisk setting
Citation. Sahlberg SH, Spiegelberg D, Glimelius B, Stenerlöw B, Nestor M (2014) Evaluering av Cancer Stem Cell Markers CD133, CD44, CD24: Association med AKT isoformer og stråling Resistance i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 9 (4): e94621. doi: 10,1371 /journal.pone.0094621
Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 15 september 2013; Godkjent: 19 mars 2014; Publisert: 23 april 2014
Copyright: © 2014 Sahlberg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet har vært finansiert med tilskudd fra det svenske Kreftforeningen, www.cancerfonden.se. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste diagnosen malignitet i verden. Flere studier har identifisert subpopulasjoner av kolorektal kreftceller som er mer motstandsdyktig mot kreft behandlinger som kjemoterapeutika og stråling [1], [2]. Vellykket behandling er avhengig av eliminering av disse svært resistente subpopulasjoner, og ikke bare de viktigste tumormassen. Disse cellene blir ofte referert til som kreft stamceller eller tumor-celler initiering, og flere celleoverflatemarkører er blitt vist å bli uttrykt i disse cellepopulasjoner [3]. CD133, CD44 og CD24 er tre forslag til stamcellemarkører i kolorektal kreft, men discouragingly fordelingen skiller mellom pasienter og tumor cellelinjer [4]. Det er derfor av stor interesse å forstå deres funksjon, og hvor de biomarkører samvirke med hverandre.
CD24 er et celleoverflate-protein, som er forankret på den ytre siden av plasmamembranen. Det er antatt å ha en viktig rolle i celledifferensiering, og kommer også til uttrykk i celler involvert i immunsystemet, slik som B-lymfocytter, hvor det positivt regulerer spredning av aktiverte T-celler. CD24 ekspresjon er også beskrevet i det sentrale nervesystemet [5]. Fordelingen i kolorektal cancer er tvist, selv om tidligere undersøkelser har vist at mellom 50 og 68% av pasienter som lider av kolorektal kreft uttrykte CD24 i stor utstrekning [5], [6], og videre at CD24 positive subpopulasjoner fra tykktarmskreftcelle Modellsøk har stamcelleliknende egenskaper [7]. I motsetning til dette har svulst initiere celler fra hode-og-hals og brystcancer blitt vist å være CD24 negative [8], [9].
CD133 (også kalt Prominin-1) er antatt å være forbundet med tumorgenisitet og progresjon av sykdommen. Oppreguleringen av CD133 i kolorektal cancer korrelerer sterkt med dårlig prognose og synkron levermetastase [10], selv om den nøyaktige rolle og funksjon av CD133 er ukjent.
CD44 har en rolle i tilrettelegging av celle til celle og celle-matriks-vekselvirkninger gjennom dets affinitet for hyaluronsyre og er involvert i celle-adhesjon og monteringen av vekstfaktorer på celleoverflaten. CD44 blir kodet av et enkelt gen, inkludert 20 eksoner. Den standard form (referert til som CD44s) består av exon 1-5 og 15-20. De variable eksoner er identifisert som v1-v10, henholdsvis. Differensial utnyttelse av 10 variant eksonene genererer flere CD44 varianter (CD44v) med ulike kombinasjoner av variant ekson produkter. Ulike isoformer av CD44 oppstår ved innføring av en eller flere av variant eksoner i det felles ryggraden er felles for alle former av CD44. Rollen til disse variant isoformer er ikke fullt ut forstått, selv om noen er antatt å mediere et kritisk trinn i colon cancer metastase [8], [11], [12]. CD44 kan ko-immunopresipitert med familien av ErbB-reseptor-tyrosinkinaser så som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), og virker sammen med HER2, HER3 og HER4 [8], [13]. EGFR er antatt å spille en viktig rolle i å regulere og opprettholde kreft stamceller, hovedsaklig gjennom nedstrøms signalisering via Phospho-inositol 3-kinase (PI3K) /AKT sti [14], [15].
AKT er en serin /treonin-kinase med tre forskjellige isoformer, akt1, akt2 og akt3, uttrykt fra tre separate gener og aktivert ved mange stimuli, slik som flere vekstfaktorreseptorer (for eksempel EGFR), B- og T-cellereseptorer. Den har en sentral rolle i mange cellulære funksjoner som er ansvarlig for proliferasjon, overlevelse, vekst, anti-apoptose, glukoseopptak, metabolisme, angiogenese og radioresistance [16]. AKT er også antatt å være involvert i epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) sti som fører til økt bevegelighet, redusert intercellulær adhesjon, tumorprogresjon og malign transformasjon. EMT veien er derfor involvert i kreftcelle invasjon og metastasering [17]. Induserer EMT, slik som reseptor-tyrosin-kinase-ligander eller transformerende vekstfaktor beta (TGFfi), Wnt og Notch, utløser en kaskade av celle-signalisering som fører til undertrykkelse av cellebindingsproteinet, E-cadherin. Prosessen involverer oppregulering av direkte virkende transkripsjons repressors som sneglen, Slug, gaffelhodeboks C2 og Zeb1, Zeb2 samt Twist og E47 som indirekte undertrykke E-cadherin. Andre markører for EMT er N-cadherin, vimentin og Fibronektin-1 som er uttrykt i mesenchymale celler [18]. EMT har også vist seg å være involvert i kreft stamcellene hvor tykktarmskreftceller med en høy ekspresjon av CD133 /CD44 viste EMT etter langvarig kultur [18], [19].
AKT har vært foreslått å være co-uttrykkes med CD133, som gir den CD133 uttrykker cellepopulasjon med en høyere motstand mot kjemoterapeutika, men detaljene om denne interaksjonen er ikke kjent [20], [21]. CD44 antas å negativt korrelert med AKT [22]. Imidlertid har flere studier vist at AKT er i stedet fosforyleres ved stimulering av CD44 med ligand, forårsaker en celleoverlevelseseffekt [23] – [25], og det er sannsynlig at CD44-isoformer har en regulerende rolle å være i stand til både å aktivere og undertrykke aktivering av AKT. Stråling i seg selv har også vist seg å øke ekspresjonen av AKT, CD133, og reduserer ekspresjon av CD44 i kolorektal kreftceller [26]. Men betydningen av de ulike AKT isoformer på CD133 eller CD44 uttrykk er ikke tidligere undersøkt.
Vi har nylig vist at både akt1 og akt2 er viktige i respons på stråling [27]. Knocking ut enten
AKT
en eller
AKT
to, eller begge deler samtidig, økt stråling følsomhet og DNA dobbel tråd rejoining hastighet ble svekket i
AKT
1 /2 KO-cellelinje. I denne studien har vi undersøkt forskjeller i uttrykk mønstre av CD133, CD24, CD44 og EGFR i tre tykktarmskreft cellelinjer; HT-29, HCT116 og DLD-1. Vi har også analysert stråling følsomheten av tykktarm kreft celler sortert for CD133
høy /CD44
høy og CD133
lav /CD44
lav uttrykk, og videre undersøkt påvirkning av to AKT isoformer (akt1 , akt2) på CD133 og CD44 uttrykk, inkludert CD44 spleisevariant isoformer. Akt3 uttrykkes ikke i de undersøkte cellelinjer, og er derfor utelukket. Videre validert vi effekten av AKT på genuttrykk i en storstilt transcriptomic analyse av flere veier.
Materialer og metoder
Cell Culture
tykktarmskreft celle- linjer HT-29 og HCT116 ble kjøpt fra The American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), katalognummer ATCC CCI-221 og ATCC CCL-247, henholdsvis. DLD-en X-MAN isogene cellelinjer ble hentet fra Horizon Discovery Ltd med de forskjellige AKT isoformer genetisk banket ut, katalognummer HD-R00-001, HD-R00-002 og HD-R00-003. Cellene ble dyrket i 75 cm
2 kulturflasker (Nunclon overflate, Roskilde, Danmark) i McCoys 5A medium (Flow Irvine, UK) med 10% føtalt bovint serum (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), 2 mM L-glutamin, 100IU /ml penicillin og 10 ug /ml streptomycin (Biochrom kg, Berlin, Tyskland). Cellene ble dyrket i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C og trypsinert med trypsin-EDTA, 0,25% trypsin, 0,02% EDTA (Biochrom Kg, Berlin, Tyskland).
Cell Sortering med Flow cytometry
For strømningscytometri-analyse av cellelinjene ble høstet ved å bruke ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) eller 0,25% trypsin, 0,02% EDTA, (Biochrom kg , Berlin, Tyskland). Etter resuspensjon av cellene i cellekulturmedium, ble cellene tellet og vasket i PBS med 0,5% BSA og oppsamlet ved sentrifugering. Cellene ble inkubert i 10 til 30 minutter med de merkede antistoffer, se tabell 1. Ved å følge antistoff merking ble cellene vasket i PBS med 0,5% BSA før flowcytometrisk analyse ble utført på en Sorp BD LSRII (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, USA). Døende og døde celler ble farget med propidiumjodid og ekskludert fra analysen. Duplikater og døde celler ble også utelatt av gating med FSC og SSC. For celle-sortering for klonogene analysen den FACSVantage SE DiVa eller FACSAriaIII Cell sorter (Becton Dickinson biovitenskap, San Jose, USA) ble brukt.
Cell-syklus analyse
Celler ble fiksert med 70% etanol, 30% PBS og holdt på -20 ° C i minst 24 timer. Cellene ble sentrifugert i 10 minutter, 2000G på 4 ° C og vasket to ganger med PBS før inkubering med 5 ug propidium jod /0,1% NP-40 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) i PBS sammen med 5 pg RNase (Sigma Aldrich , St. Louis, USA) i 30 minutter ved romtemperatur. Analyse ble gjort med flowcytometri (BD LSRII biovitenskap).
klonogene analysen
Sammenhengen mellom uttrykket av CD133 og CD44 og stråling følsomhet ble evaluert ved å sortere og samle CD133
høy /CD44
høye og CD133
lav /CD44
lave uttrykke celler. Celle nummer etter sortering ble bestemt med en celleteller (TC20 Automatisert celleteller, Biorad Life Science, Hercules, CA, USA)), og en viss mengde celler var pre-belagt i 25 cm
2 vevskultur kolber. Den følgende dag ble cellene eksponert for eksternt påførte stråling ved hjelp av en
137Cs kilde (Best Theratronics Gammacell 40 Exactor, Springfield, USA). Etter en inkubasjonstid periode på 8-14 dager ble cellene vasket i PBS og fiksert med 99,5% etanol i 5-10 min. Koloniene ble farget med Mayers hematoksylin (Histolab Products AB, Västra Frölunda, Sverige) for 20-30 min og deretter skylles i vann. Kolonier med mer enn 50 celler pr koloni ble tellet og pletteringseffektiviteten (PE = antall kolonier i ubehandlede celler /antall celler sådd) og overlevelsesfraksjonen (SF = antall kolonier i behandlede celler /antall celler utsådd x PE) ble beregnet og plottet.
Statistiske analyser
flowcytometri analysene ble evaluert med BD FACSDiva programvare 7.0 (BD Biosciences). Den klonogene assay data ble behandlet med Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, Redmond) og grafer ble plottet og analysert med enveis ANOVA i GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA). En signifikansnivå på 95% ble anvendt. Denne analysen vurdert om overlevelses fraksjoner av de bestrålte CD133 og CD44 sorterte cellene var signifikant forskjellige fra hverandre for hver enkelt stråledose.
Western Blot
Celler ble dyrket i 3 cm petriskåler for ved minst tre doblingstidene før lysation eller tre separate cellekulturer av DLD-1, ble sortert ved strømningscytometri (se ovenfor) og volumet av lyseringsbuffer ble justert til antall celler er samlet i hvert hetteglass. Lysater ble fremstilt etter behandlingen ved vasking av cellene med iskald PBS, etterfulgt av tilsetning av 10 000 000 celler /ml lyseringsbuffer inneholdende 1% Tween-20, 20 mM Tris (pH 8,0), 137 mMNaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 1 mM natriumortovanadat aktiverte (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), og protease-inhibitor cocktail (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, USA) og inkubering på is i 30 min. Lysatene ble sentrifugert i 10 minutter i 4 ° C. Supernatanten ble overført til nye rør og pelleten kastet. Proteinkonsentrasjonen av løsningen ble bestemt ved BCA-proteinanalyse (Pierce). Like mengder protein ble applisert på en Tris-acetat 3-8% SDS-PAGE-gel (Life Technologies, Carlsbad, CA) og deretter overført til en nitrocellulosemembran (Millipore) ved våt-blotting. Nitrocellulosemembranen ble blokkert i 1 time i 5% BSA, PBS og deretter inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C. Antistoff spesifikt for CD133 /1 (W6B3C1) var fra Miltenyi bioteknologi (Heidelberg, Tyskland) og CD44 (103014) fra Biolegend (San Diego, California, USA). Antistoffer mot FoxO3a (2497), fosfor-FoxO (2599) og GSK-3beta (9315) og fosfor-GSK3B (9323) var alle fra Cell Signaling Technology (Beverly, MS, USA). Akt1 (sc55523 og akt2 (sc5270) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoff mot β-actin (A5441) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Etter vasking i PBS med 1% Tween-20, ble membranen inkubert med pepperrot peroksidase-merket sekundært antistoff (626 520 og 656 120) (Invitrogen, Camarillo, CA, USA) eller (405405) (Biolegend, San Diego, CA, USA) i 1 time ved romtemperatur. immunreaktive bånd ble visualisert i en CCD-kamera (SuperCCD HR, Fujifilm, Japan) etter behandling med Immobilon elektro-kjemiluminescerende løsning (Millipore, Billerica, MA, USA) i 5 min.
Mikromatrise Expression analyse
To separate passasjer av DLD-en foreldre,
AKT
en KO,
AKT
2 KO og
AKT
1/2 KO celler ble dyrket til 70% samløpet og RNA ble ekstrahert (RNeasy mini-prep, Qiagen, Valencia, CA, USA) RNA-konsentrasjon ble målt med ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, dE) og RNA kvalitet ble evaluert ved bruk av Agilent 2100 Bioanalyzer system (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, California). 250 nanogram total RNA fra hver prøve ble brukt til å generere forsterkes og biotinylated sans-cDNA fra hele uttrykte genomet henhold til Genechip WT PLUS Reagens Kit Brukerveiledning (P /N 703174 Rev 1 Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) . Genechip HTA Arrays (Genechip Menneskelig transkriptomet Array 2,0) ble hybridisert i 16 timer i en 45 ° C inkubator, rotert ved 60 rpm. Ifølge Genechip Expression Vask, Stain og Skann Manual (PN 702731 Rev 3, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) arrays ble deretter vasket og farget med lufthåndtering Station 450 og til slutt skannet med Genechip Scanner 3000 7G.
Mikromatrise data Analysis
den rå data ble normalisert i fri programvare Expression Console levert av Affymetrix (https://www.affymetrix.com) ved hjelp av robust multi-matrise gjennomsnitt (RMA) metoden først foreslått av Li og Wong i 2001 [28], [29]. Etterfølgende analyse av genekspresjon data ble utført i den fritt tilgjengelige statistisk databehandling språk R (https://www.r-project.org) ved hjelp av pakker tilgjengelig fra Bioconductor prosjekt (www.bioconductor.org). For å søke etter de differensielt uttrykte gener mellom foreldrenes og
AKT
KO grupper en empirisk Bayes moderert t-test ble deretter påført, ved hjelp av «limma» pakken [30]. For å løse problemet med flere tester, ble p-verdiene justeres ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Benjamini og Hochberg [31]. De normaliserte data ble videre undersøkt ved hjelp av ressurser DAVID bioinformatiske 6,7 til sammen med Kyoto leksikon av gener og genomer (KEGG) pathway database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) til funksjonelt klassifisere og cluster gener relatert til epitelial til mesenchymale overgangs trasé [32], [33].
bekreftelse på
AKT
en og
AKT
to Knock-out med PCR
Total RNA ble isolert fra DLD-en foreldre,
AKT
en KO,
AKT
2 KO og
AKT
1/2 KO celler med RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia , CA, USA). cDNA ble syntetisert fra 0,1 mikrogram total RNA ved hjelp RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit med tilfeldig heksamerprimere (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og PCR ble utført med Taq DNA Polymarese (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) med primere mot akt1 (fwd: AGGCTCCCCTCAACAACTTC, rev: CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT) eller akt2 (fwd: GGTGCCTCCTGCATGTCC, rev: CCTCTCGGTCTTCATCAGC)
Transfeksjon med siRNA mot akt1 i DLD-1 Foreldre Cells
cellene var. transfektert med siAKT1 lyddemper (ambion av Life Technologies, Carlsbad, California) med Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, California) (følelse: 5 «GCGUGACCAUGAACGAUUtt og antisense: 5’AACUCGUUCAUGGUCACGCGG). De transfekterte celler ble inkubert i 37 ° C i en CO
2 inkubator i 48 timer før analysere CD133, CD44 og CD24 uttrykk på flowcytometri, se ovenfor.
Re-aktivering av akt1 eller akt2 i DLD-en
AKT
1/2 KO Cells
DLD-en
AKT
1/2 KO celler dyrket til en sammenfletting av 30-50% i antibiotika-frie McCoys celle medier (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) i 24 timer før transfeksjon. Cellene ble transfektert med pcDNA3 myr HA akt1 og pcDNA3 myr HA akt2 plasmider vennlig levert av William Sellers (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA) gjennom Addgene (Cambridge, MA). Lipofectamine 2000 og OptiMem var fra Life-teknologi (Carlsbad, California). De transfekterte celler ble inkubert i 37 ° C i en CO
2 inkubator i 72 timer før videre analysere CD133, CD44 og CD24 uttrykk ved flowcytometri, se ovenfor.
Resultater
CD133, CD44, CD24 og EGFR Expression i tykktarmskreft cellelinjer
CD133, CD44, CD24 og EGFR uttrykk i tre tykktarmskreftcellelinjer ble analysert med flowcytometri, se figur 1A. Det var en forskjell i ekspresjonen av CD133, CD44, CD24 og EGFR mellom cellelinjer. CD44 er vist som en befolkning som strekker seg fra lav til høy ekspresjon i alle tre cellelinjer. Påvisningen av CD24 ekspresjon var avhengig av anti-CD24-antistoff. Den høyeste uttrykk for CD24 ble sett i HT-29 celler med 95% positive celler ved hjelp av CD24 antistoff fra MACS), se figur 1B. CD133 ble uttrykt i de fleste av de HCT116 og HT-29-celler, mens bare 14% av DLD-1-celler var positive for CD133. Alle tre cellelinjer uttrykte EGFR. Rundt 80% av HT-29 og HCT116 hvor positivt for EGFR, mens 40% var positive i DLD-en.
A) HT-29, HCT116 og DLD-en. Uttrykket mønstre i dotplots er fra en representant strømningscytometer eksperiment. Gitteret demonstrerer marginen mellom høy og lav ekspresjon av proteinet definert ved isotype kontroller. B) Ekspresjon av CD24-positive celler i flowcytometri avhenge av anti-CD24-antistoff. Tabellen viser prosent av CD24 positive celler ved hjelp av tre forskjellige CD24 antistoffer.
Radiosensitivity av CD133
høy /CD44
høy og CD133
lav /CD44
lav Uttrykke celler
Sammenhengen mellom uttrykket av CD133, CD44 og stråling følsomhet ble evaluert ved å sortere og samle CD133
høy /CD44
høye og CD133
lav /CD44
lav uttrykker celler etterfulgt av eksponering for eksternt påførte gammastråling, og videre analysert med klonogene analyser, se figur 2. En høyere motstand mot stråling i CD133
høy /CD44
høy befolknings forhold til CD133
lav /CD44
lav befolkning ble observert for alle cellelinjene. Disse forskjellene var statistisk signifikant på alle stråledoser (2, 4 og 6 Gy) for DLD-1-celler, se figur 2C, ved 4 og 6 Gy for HCT116-celler, og ved 4 Gy for HT-29-celler, se figur 2A og B, med en P-verdi på 0,05 (enveis ANOVA). Det var ingen eller en liten forskjell i uttrykket av CD24 i CD133
høy /CD44
høy og CD133
lav /CD44
lav befolkning, bortsett fra i HCT116 hvor det var mindre positive CD24 celler i den CD133
lav /CD44
lav brøk. Antallet EGFR-positive celler i de sorterte fraksjoner var nesten det dobbelt i CD133
høy /CD44
høy i forhold til CD133
lav /CD44
lav andel i HT-29 og DLD-en -celler, mens i HCT116 var det bare en liten forskjell i den EGFR-ekspresjon mellom fraksjonene. Strålingen følsomhet for usorterte celler er vist i figur S1.
klonogene analyse av A) HT-29, B) HCT116 og C) DLD-1-celler. Toppen og bunnen 10 prosent av CD133 og CD44 uttrykker celler ble sortert ved flowcytometri (CD133
høy /CD44
høy eller CD133
lav /CD44
lav) og strålingen følsomhet ble analysert ved hjelp klonogene analyser. Styringen av begge fraksjoner ble normalisert og satt til 100% overlevelse. Feilstolpene representerer standardfeil av middelverdien fra minst to separate eksperimenter med triplikate prøver. En høyere motstand mot stråling i CD133
høy /CD44
høy befolknings forhold til CD133
lav /CD44
lav befolkning ble observert for alle cellelinjene. Disse forskjellene var statistisk signifikant på alle stråledoser (2, 4 og 6 Gy) for DLD-1 celler (figur 2C), ved 4 og 6 Gy for HCT116-celler, og ved 4 Gy for HT-29-celler (figur 2A og B ) med en P-verdi på 0,05 (enveis ANOVA). Prosentandelen av celler positive for EGFR, CD24 med BD biovitenskap antistoff eller CD24 med Miltenyi bioteknologi /MACS ble analysert med flowcytometri.
Uttrykk av AKT i CD133
positive /CD44
positiv og CD133
negativ /CDD44
negativ Befolkning i DLD-en
De ulike populasjoner av CD133
positive /CD44
positiv, CD133
negativ /CD44
positiv og CD133
negativ /CD44
negativt i DLD-1 celler ble sortert, samlet og videre analysert for uttrykket av AKT med western blot, se figur 3A og B. uttrykk for total AKT var lavere i CD133
negativ /CD44
negativ befolkningssammenlignet med befolkningen positive for CD44 og /eller CD133. Lignende mønster ble sett for akt1 og akt2, se figur 3B.
A) DLD-1 celler ble sortert ved flowcytometri og ulike populasjoner med CD44
positive /CD133
negative (Q1), CD44
positive /CD133
positive (Q2), CD44
negativeCD133
negative (Q3), ble samlet. B) De sorterte celler ble videre analysert med western blot for total AKT, akt1 eller akt2 og betaactin uttrykk.
Influence of AKT isoformer på uttrykk for CD24, CD133 og CD44
siden AKT uttrykk var annerledes i den sorterte CD133
positive /CD44
positiveand CD133
negativ /CD44
negative befolkningsgrupper, påvirkning av AKT isoformer ble evaluert ved bruk av tykktarmskreft cellelinje DLD-en og
AKT
1,
AKT
2 og
AKT
1/2 isogene knock-out cellelinjer, se figur 3AB, og bekreftelse av knock-outs i Figur S2. Gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (MFI) av CD44 uttrykk ble økt fra 100% i foreldre til 150% i
AKT
en KO og
AKT
2 KO og 250% i
AKT
1/2 KO cellelinje, se Figur 4A og B. Videre CD133 uttrykk ble redusert når akt1 ble banket ut som vist i
AKT
en KO, så vel som i
AKT
1/2 KO cellelinje. Men enkelt knock-out av
AKT
2 sett i
AKT
2 KO cellelinjen ikke redusere nivået av CD133, se figur 4A. Den CD24 uttrykk ble fullstendig avskaffet i
AKT
1/2 KO men økte i enkelt
AKT
en eller
AKT
2 KO cellelinjer se figur 4C. Påvirkningen av AKT isoformer på uttrykk for CD24, CD133 og CD24 ble ytterligere bekreftet med siRNA mot akt1 og ved gjeninnføring av akt1 eller akt2 i DLD-en
AKT
1/2 KO celle-linje, se figur S3 og S4. I tillegg har vi bekreftet at det ikke var noen forskjell i cellesyklus-fordeling mellom cellelinjer, se figur 4D.
A) I foreldrecellene, ca 10% av cellene ble CD133-positive celler. Men i
AKT
en og
AKT
Mål 1/2 knock-outs, de CD133 positive celler ble redusert til 0,3 og 0,1% henholdsvis. Dette ble ikke sett i
AKT
to knock-out celle-linje, der 33% av cellene var positive for CD133. B) Den gjennomsnittlige fluorescerende intensiteten av CD44 normalisert til DLD-en foreldrecellelinje økt til 150% i
AKT
en KO, 160% i
AKT
2 KO og 300% i
AKT
1/2 KO cellelinje. Feilstolpene representerer standardavviket (SD) fra minst to eksperimenter. C) Den prosent av CD24 positive celler analysert med to forskjellige CD24 antistoffer fra BD Biosciences og Miltenyi /MACS i flowcytometri. Standardavviket er fra gjentatte forsøk. D) Cell-syklus fordeling i DLD-1 foreldre,
AKT
en KO,
AKT
2 KO og
AKT
1/2 KO celler.
Influence of AKT isoformer på uttrykk for CD44 Variant isoformer
de fleste (98-100%), av DLD-en, HCT116 og HT-29 celler var positive for CD44, oppdaget med et antistoff som detekterer alle varianter av CD44. Uttrykket mønster av CD44 variant isoformer v3, v4 /5, v6, v7 og v7 /8 ble videre undersøkt i DLD-en foreldre og
AKT
1/2 KO cellelinjer se tabell 2. Bare små mengder (~1-6%) av cellene var positive for CD44 variant isoformene (uttrykk i enkle, levende celler), og uten vesentlige endringer i uttrykk nivåer mellom AKT dyktige og mangelfulle DLD-1 cellelinjene. I tilfelle av CD44v7, som hadde en høyere påviselig nivå, ble uttrykket noe redusert i
AKT
1/2 KO celler i forhold til foreldre.
biokjemiske analyser av DLD- 1
AKT
Knock Out cellelinjer
Western blot analyse evalueres videre protein uttrykk for CD133 og CD44 samt Fox0 og GSK3p og deres innflytelse av AKT isoformer. Uttrykket av CD44 var oppregulert i
AKT
en KO,
AKT
2 KO og
AKT
1/2 KO cellelinjer i forhold til foreldre og CD133 uttrykket ble redusert i
AKT
en KO og
AKT
1/2 KO cellelinjer, men ikke i
AKT
2 KO cellelinje som sett i strømmen cytometri analyse.
AKT
1, A
KT
2 og
AKT
1/2 KO cellelinjer som hadde en redusert ekspresjon av fosforylert Fox01 og Fox03a, så vel som et redusert ekspresjon i total Fox03a i
AKT
1/2 KO cellelinje. Men det var ingen forskjeller i uttrykket av fosforylert (S9) eller total GSK3p mellom
AKT
KO cellelinjer, se figur 5A.
A) Protein uttrykk for CD44, CD133, fosfor-FOXO, total FOX03a, fosfor-GSK3p og total GSK3p fra western blot analyse. B) Gene uttrykk, oppregulering (+), nedregulering (-) eller ikke endret (NC), av CD44, CD24, CD133, FOX01, FOX03, FOX04, GSK3p og LYN i DLD-en
AKT
en KO,
AKT
2 KO eller
AKT
1/2 KO celler i sammenligning med DLD-1 foreldre celler.
forskjeller i genuttrykk i de DLD-1 AKT isoformer Knock-out cellelinjer
Gene uttrykk analyse ble utført for å ytterligere undersøke forskjellene mellom isogen
AKT
isoform knock-out cellelinjer se figur 5B. Gener ble ansett som vesentlig opp eller ned regulert med forholdstall ≥1.5 fold og med p 0,05. Knock-out av
AKT
en og
AKT
2 isoformer ble bekreftet i DLD-1 cellelinjer og genuttrykket av CD44 og CD133 bekreftet resultatene fra flowcytometri og vestlig blot-analyse. CD44 var oppregulert i
AKT
1,
AKT
2 og
AKT
1/2 KO cellelinjer i forhold til foreldrecellelinje og CD133 var opp- regulert i
AKT
2 KO men nedregulert i
AKT
en og
AKT
1/2 KO cellelinjer. Den CD24 uttrykk var lavere i
AKT
1/2 KO cellelinje i forhold til foreldre imidlertid; Det var ingen forskjell i
AKT
en eller
AKT
2 KO cellelinjer. FOXO1 ble oppregulert i
AKT
en KO og
AKT
1/2 KO celle-linje, mens FOXO3 var bare oppregulert i single
AKT
en KO og
AKT
2 KO cellelinjer. Det var ingen forskjell i FOXO4 uttrykk mellom cellelinjer. LYN ble oppregulert bare i
AKT
1/2 KO men det var ingen forskjell i uttrykket av GSK3p mellom cellelinjene, se figur 5B.
Vurdering av forskjeller i epitelial til mesenchymale Transition, Notch, Wnt og celle adhesjon Pathways mellom
AKT
2 KO og
AKT
1 KO cellelinjer
En markør for epitelial til mesenchymale overgang (EMT ) er reduksjon av celleadhesjon. Det var flere gener i celle adhesjon pathway (
CLDN1, ITGB8, NEO1 Hotell og
PVRL3
) som hadde signifikant høyere uttrykk i
AKT
2 KO cellelinje sammen til
AKT
en KO cellelinje. Videre induksjon av EMT innebærer Notch og Wnt og tyrosin kinase reseptorer.
