Abstract
Selv om blokaden av androgen reseptor (AR) signale representerer den viktigste behandlingen for avansert prostatakreft (PRCA), mange pasienter utvikle seg til en dødelig fenotype av «Kastrering-Resistant» prostatakreft (CR-PRCA). Med hypotesen om at tidlig PRCA kan havnen en befolkning på androgen-svarer kreftceller som forløpere til CR-tilbakevendende sykdom, foretok vi utbredelsen av androgen-uavhengig celler fra PRCA-prostatektomi prøver av tidlig, lokaliserte (Stage-I) tilfeller. En samling av 120 kirurgiske prøver fra prostatektomi tilfeller ble etablert, hvorav 54 var adenokarsinomer. Hormon-frie celledyrkningsforholdene ble utviklet slik rutine formering av celler som uttrykker prostata basalcellemarkører og stilk /stamcellemarkører, og som proliferated som kuler /kuler i suspensjonskulturer. Kolonier av androgen-uavhengig epitelceller vokste ut fra 30/43 (70%) av tilfellene adenokarsinom studert i detalj. Fluorescens mikroskopi og flowcytometri viste at CR-PRCA celler var positive for CD44, CD133, CK5 /14, c-kit, inte α2β1, SSEA4, E-cadherin og aldehyd dehydrogenase (ALDH). Alle 30 CR-PRCA cellekulturer var også TERT-positiv, men negativ for TMPRSS2-ERG. I tillegg ble en undergruppe av 22 av disse CR–PRCA cellekulturer undersøkt av ortotopisk xenografting i intakte og kastrerte SCID-mus, genererer typisk histologisk lokalt invasive humane -PRCA eller udifferensierte kreftformer, henholdsvis, i løpet av 6-8 uker. Cultured PRCA celler og orthotopically-indusert
in vivo
kreft manglet PSA uttrykk. Vi rapporterer her spredning av kreft initiere Cells (CIC) direkte fra Stage I menneskelig PRCA vev uten valg eller genetisk manipulasjon. Utbredelsen av stammen /progenitor-lignende CR-PRCA celler avledet fra tidlige menneske prostata karsinom antyder eksistensen av en undergruppe av celler som er resistente mot androgen-deprivasjon terapi og som kan kjøre den påfølgende fremveksten av disseminert CR-PRCA.
Citation: Fiñones RR, Yeargin J, Lee M, Kaur AP, Cheng C, Sun P, et al. (2013) Tidlig Menneskelig Prostata adenokarsinomer Harbor androgen uavhengig kreftceller. PLoS ONE 8 (9): e74438. doi: 10,1371 /journal.pone.0074438
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 3 mai 2013; Godkjent: 01.08.2013; Publisert: 25.09.2013
Copyright: © 2013 Fiñones et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Alle midler ble sjenerøst gitt gjennom UC San Diego Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blokkade av androgenreseptoren (AR) signalering utgjør hoved behandling av prostatakreft [1]. Likevel, mange pasienter videre til en fatal fenotype av «Kastrering-Resistant» prostatakreft (CR-PRCA). Som PRCA er heterogen [2], [3], hypotese vi at tidlig PRCA kan inneholde en befolkning på androgen-svarer kreftceller som fungerer som forløpere til CR-tilbakevendende sykdom. Vi la ut på identifisering av androgen-uavhengig celler fra PRCA-prostatektomi prøver av tidlig, lokaliserte (Stage-I) saker, som finnes i prostata.
Eksistensen av epitel prostata stamceller er allment akseptert basert på usedvanlig evne til reproduksjon av prostata [4] – [6]. Mens androgen tilbaketrekking induserer apoptose av luminal epitelceller, basal celler forblir intakt, noe som muliggjør rask regenerasjon ved androgen erstatning og antyder at prostata stamceller bor i basalcellelaget. Prostata luminal-celler har vist seg å gi opphav til human -PRCA følgende over-ekspresjon av spesifikke gener [7]. Av notatet, har stammen /stamceller ikke blitt dyrket i en umodifisert tilstand fra tidlige stadier av CR-erytroaplasi [8], [9]. Til tross for tilstedeværelsen av kreft initiere Cells (CIC) i udøde PRCA cellelinjer avledet fra metastatisk PRCA [10], rollen epitelceller stilk /stamceller i generering av prostata CIC fortsatt ukjent [11].
Current modeller antyder at -PRCA begynner med utvikling av prostata intraepitelial neoplasi (PIN), blir lokalt invasive adenokarsinom, etterfulgt av metastatisk androgen-avhengige og, til slutt, androgen-uavhengig kreft [4], [12], [13]. Ved hjelp av celleoverflatemarkører, og isolering av prostata CIC blitt rapportert [14] – [16]. I mus, innføring av konstitutivt aktiv AKT-kinase i Sca-1-anrikede prostata epitelceller resulterte i startfasen [17] og, i humane celler, over-ekspresjon av AKT, ERG og AR i luminal celler generert prostatakreft [7] . I eksemplarer av menneske stadium prostata jeg kreft, 0,1% av cellene uttrykte prostatakreft stilk /progenitor-lignende cellemarkører, inkludert CD44, CD133, CK5 /14 og inte α2β1 [18], [19]. Viktigere, kan primær PRCA celler bli udødeliggjort av hTERT gen-overføring, og viser høy selvfornyelse potensialet [9], [20].
Vi rapporterer her utbredelsen av CIC direkte fra Stage jeg human PRCA vev uten utvalg eller genetisk manipulasjon. En samling av 120 kirurgiske prostatektomi prøvene ble etablert, blant disse 54 prøvene var adenokarsinomer. Hormon- og serumfritt celledyrkningsforholdene ble utviklet for å tillate rutinen etablering av celler som uttrykker prostata basalcellemarkører og stammer /stamcellemarkører, og som proliferated som kuler /kuler i suspensjonskulturer. I tillegg carcinoma-avledet PRCA celler ble vellykket formeres fra 30/43 av disse adenokarsinom tilfellene. Av disse ble PRCA cellekulturer avledet fra 22 adenokarsinom prøver videre undersøkt av orthotopic xenografting og funnet å generere typiske prostata kreft, eller udifferensierte svulster, henholdsvis i ortotopiske xenograft modeller i hormonelt intakte og kastrerte SCID mus. De dyrkede celler er «Kastrering-Resistant» og androgen-uavhengig kreftceller og dermed tilfredsstille
in vitro Hotell og
in vivo
kriteriene for RIK. CR–PRCA celler formert som beskrevet her kan nå brukes til å analysere mekanismer for selvfornyelse [21] -. [23], endringer i genekspresjon, seleksjon for nye mutasjoner, metastatisk progresjon, og terapeutiske responser
metoder
Eksperimentelle metoder presenteres i metoder S1.
Etikk erklæringen
Alle humane prøver ble anonymt kodet og oppnådd i henhold til UCSD IRB # 130397. Alle prosedyrer utført i arbeidet beskrevet ble omhyggelig beskrevet til UCSD-IRB og ble presentert for, gjennomgått og godkjent av full UCSD Institutional Review Board. En detaljert informert samtykke pakken som ble spesialskrevet for denne studien ble omfattende forklart til hver pasient å donere vev, før de kliniske prosedyrer og, når forstått av og avtalt med hver pasient, ble behørig signert av hver pasient. Disse postene er på fil i de respektive kliniske avdelinger. Hele prosessen var fullt dokumentert i papirkopi og digitalt som en del av den kliniske pasientdata; disse postene er lagret. Forskerteamet har ikke hatt tilgang, som for tiden ikke har tilgang, og i fremtiden vil ikke ha tilgang til noen som identifiserer eller kliniske opplysninger eller oppfølging data for pasientene. Det var ingen personell lapper mellom klinisk og forskningsteam, aktiviteter som foregår i separate bygninger på UCSD Campus i La Jolla. Samtykket pasienter ble inngått studien fortløpende, uten noen kategorisering, enten på sosioøkonomiske, rasemessig, religiøs, næringsrik, miljøeksponering eller lignende baser. Alle vevsprøver studerte ble donert ved avslutningen av kliniske prostatektomi prosedyrer. Disse prosedyrene er, og har blitt omhyggelig overholdt og har blitt godkjent av UCSD-IRB Etikkutvalget. Prosedyren protokollene er, og har blitt re-visited og re-godkjent av UCSD-IRB-komiteen på årlig basis. Pasient personvern og samtykke blir tatt svært alvorlig på UCSD.
Etisk bruk av immunmangelfull mus for vev-rekombinasjon transplantasjon og orthotopic transplantasjon av ER oppnådde menneskelige prostata kreft celler har blitt gransket og godkjent av UCSD IACUC myndighetene ved hjelp av dyret protokoll # S07410. De IACUC Utvalgene har blitt presentert med alle aspekter av forsøkene, herunder kilden til menneskeceller transplantert, de informert samtykke, etc. og har godkjent arbeidet med etiske dyrs rettigheter og på humanitært grunnlag.
Resultater
veksten av primære epitelceller prostata kulturer
Etter screening av en rekke media, vekstfaktorer, ekstracellulær matriks og miljø kombinasjoner, ble -PRCA cellene formert fra human Trinn i prostata karsinomer som beskrevet (se Methods S1), ved hjelp syntetisk medium mangler serum eller androgener. Enkelt epitele cellekolonier ble observert i løpet av 3 dager etter utplating inn i vekstmedium ( «Medium 6
+++»), og ved 7-9 d antallet kolonier var stabil. Disse kulturene overført til dannelse av epitelial, honeycomb-lignende celler, som holdes tett celle-celle kontakt (figur 1A), og som oppviste en liten, kompakt gruppe av celler midlertidig utpekt som en kreftcelle Cluster (CCC) (figur 1B-D) . PRCA cellekolonier i utgangspunktet delt med en dobling tid på -20 h (Fig 1E). Kulturer ble passert før om åtte
th passasje eller ~ 30 populasjonsdoblinger, og da cellene begynte å vedta en stor, flat morfologi og var positive for senescence-assosiert β-galaktosidase (Fig 1F). Resultatene fra 43 av 54 tilfeller diagnostisert som prostata adenokarsinomer av Gleason Score spenner fra 6-9 er oppsummert (tabell S1). Tabell S1 viser også antall epitelceller kolonier oppnådd fra hvert av de 30 adenokarsinom prøvene som ga epitel-kolonier. De resterende 13 adenokarsinom prøvene ga ingen kolonier og ble ikke ytterligere undersøkt.
(A) Typisk cellulær morfologi er vist, med et flertall av celler generert fra primær -PRCA prøver viser en stram, honeycomb morfologi. (B-D) Eksempler er vist (se piler) av semi-tilhenger klynger, betegnes Cancer Cell Clusters (CCCS), med opprinnelse i enkelte kolonier. Scalebar = 100 mikrometer. (E) Vekst av -PRCA celler fra en enkelt CCC 3 tidspunkter etter første observasjonen av kolonien: 0, 24 og 48 timer, kvantifisert ved bildeanalyse. (F) Senescence analyse av celler på 8
th passasje, som viser positiv farging for senescence-assosiert β-galaktosidase. Scalebar = 50 mikrometer.
Som kontroller prøver innhentet av transurethral reseksjon og diagnostisert som benign prostatahyperplasi (BPH) ble behandlet og dyrket identisk til adenokarsinom prøvene. Bare to av 50 prøver diagnostisert som BPH tilfeller generert lave tall (3-10) av dårlig voksende epitelceller kolonier.
De data som presenteres her demonstrere eksistensen av celler som kan bli direkte formeres fra Stage-I prostatakreft i definerte medier mangler serum eller androgener. Utbredelsen av androgen-uavhengige og kreftfremkallende celler fra tidlig (stadium I) menneskelige prostata adenokarsinom har ikke tidligere blitt beskrevet.
Cell-markør uttrykk av PRCA celler
Tidlig-passasje PRCA celler utvidet fra enkeltkolonier ble analysert ved indirekte immunfluorescens for prostata stamcellemarkører inte α2β1, CK5 /14, CD44 og CD133. Tidlig passasje kulturer inneholdt både synlige cellegrupper og en voksende glorie av epitelceller avkom uttrykker inte α2β1, CK5 /14 og CD44 (fig 2A-C). CD133 uttrykk var begrenset til celler i de tette klynger (Fig 2D), men ble snart tapt etter aging
Prostata CCC og rundt prostata epitelceller PRCA cellene uttrykte:. (A) inte α2β1 (rød); (B) med høy molekylvekt cytokeratin (CK5 /14) (rød); (C) CD44 (grønn); og (D) CD133 (grønn). Kjerner oppdaget med DAPI (blå). Flow-cytometri av samme markører blir presentert for sammenslåtte PRCA celler og CCCS: (E) inte α2β1 (~99% positive); (F) CK5 /14 (-48% positive); (G) CD44 (~98% positive); og (H) CD133 (~38% positive). Uttrykk for CD133 falt raskt i senere koloni overføringer, som korrelerer med progressiv fortynning av CD133
+ CCCS, i forhold til raskere voksende CD133
lo /-. PRCA celler
Etter flowcytometri , -PRCA celler uttrykte integrin α2β1 (figur 2E), høy molekylvekt (basal celle) cytokeratin CK5 /14 (figur 2F) og CD44 (figur 2G). CD133 ble uttrykt i tidlige passasjen kulturer (figur 2H), men ekspresjonen var tapt ved utvekst til ark av epitelceller. Derfor omfanget av CD133 uttrykk av våre PRCA cellekulturer falt raskt fra ca 50% i fersk eksplanterte kolonier til ikke målbare nivåer på kultur passasje 2 og oppover.
PRCA cellekolonier ble også analysert for prostata stilk /progenitor og differensiering markører. Dobbel-farging for p63, CK8 /18, og c-kit, sammen med CD44, ble utført. Basalcellemarkør p63 ble for det meste lokalisert til kjernen i -PRCA /CCC-celler (Fig. S1A), slik det vanligvis finnes i normale prostata basalceller. Selv om p63 har en tendens til å bli underexpressed i adenokarsinomer [24], noen dyrkede prostata carcinoma-cellelinjer er blitt vist å uttrykke p63 atom [25]. I tillegg har cytoplasmatisk p63 vært forbundet med prostatakreft dødelighet [26]. Helstøpt PRCA /CCC celler også uttrykt prostata differensiering (luminal celle) markør CK8 /18 (Fig. S1B), og c-kit (Fig. S1C), som samlokalisert med CD44. Dyrkede PRCA cellene uttrykte verken kromogranin A eller PSA. Den overraskende mangel på PSA-ekspresjon ble bekreftet ved bruk av 8 ulike PSA-spesifikke antistoffer på 22 forskjellige -PRCA cellekulturer (data ikke vist).
Ekspresjon av aldehyddehydrogenase (ALDH) stamcelle-spesifikt enzym
ALDH, en avgiftende enzym ansvarlig for oksydasjon av aldehyder til karboksylsyrer, har fungert som en funksjonell markør [27], [28] i nærvær av stamceller og CIC i et bredt spekter av cancere [29] – [31]. I brystkreft CIC, dominerer den ALDH1A3 isotype og er prediktive for metastase [32], mens i prostatakreft de ALDH7A1 isotype dominerer [33]. I våre dyrkede -PRCA celler, ble ALDH sterkt uttrykt (90,0% for Pr # 109), men ble redusert til 9,8% i nærvær av ALDH-spesifikk hemmer diethylaminobenzaldehyde (DEAB) (figur 3). MCF7-celler ble anvendt som en ALDH-negativ kontroll i disse eksperimenter (data ikke vist). Med økende passasje nummer, ALDH uttrykk i PRCA celler redusert, nå mindre enn 1% etter 6 passasjer (data ikke vist).
PRCA # 109 celler, tr.1 ble trypsinert, reagerte med ALDH1A1 underlaget BODIPY- aminoacetaldehyd (BAAA). Den ALDH inhibitor DEAB ble tilsatt til en styrerøret av de samme cellene for å vise spesifisiteten av ALDH1-aktivert BODIPY-fluorescerende påvisning. Median fluorescerende ALDH1-signal på 3 × 10
5 enheter ble hemmet rundt 200 × ved DEAB inhibitor. 90,0% ALDH1-lyse-celler (A og C) ble redusert til 9,8% i nærvær av ALDH DEAB inhibitor (B og D). De relevante dot-tomter er vist til høyre, og en kontur plott sammenligne ALDH-aktivert fluorescens og som av celler der reaksjonen ble hemmet av DEAB er vist nedenfor (E).
I tillegg , ekspresjon av ALDH7A1 isotype ble demonstrert ved indirekte immunofluorescens i 12 forskjellige dyrkede -PRCA cellekulturer som ble testet (fig. S2). Uttrykk for isotypen ALDH7A1 i PRCA celler dyrkes her er i samsvar med sin rapportert uttrykk i menneskelig PRCA og i immunohistologi deler av menneskelig erytroaplasi og deres metastaser [33].
Dyrkede PRCA celler lett generere forankringsuavhengig kuler /kuler i Matrigel kulturer
i motsetning til differensierte celler, normale og kreftfrem initiere stilk /stamceller sprer å danne kuler /kuler i henhold til forankringsuavhengig dyrkningsforhold [34]. Heft PRCA celler ble trypsinert til enkeltceller, gikk gjennom en 40 mikrometer sil, og 10
4 celler belagt i Matrigel suspensjonskulturer. Dette resulterte i dannelsen av voksende kuler i Matrigel ved 90% av de suspenderte enkeltceller (figur 4), som var uavhengig av Gleason Score (6-9) av kreft givere. Etter farging cellekjerner med DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol), ble antallet celler pr voksende sfære kvantifisert som 88 ± 9,7 celler pr koloni (figur 4A). Eksempler på kuler i Matrigel suspensjonskultur er vist (figur 4B) som er kuler som er avsatt på glassobjektglass ved cytosentrifuge (figur 4C). Spheres vedvarte i uttrykket av ALDH1, CD44, Inte α2β1, SSEA4 og TERT (ikke vist). Med påfølgende overføring av de heft erytroaplasi celler på en 01:03 subkultur ratio, en synkende andel generert Matrigel kuler, med 0,1% beholde denne kapasiteten ved passasje 7.
Lav passasje, heft PRCA celler (# 76 , tr 2) ble trypsinert og suspendert i Matrigel i medium 6
+++. Suspensjonskulturer ble dyrket i 14 dager, og kuler av replikate kulturer ble høstet på dag 1, 4, 7, 9, 11 og 14. Kulturer ble fordøyd med dispase, pelletisert på objektglass ved cytocentrifugation og fiksert med metanol. (A) Størrelsen på kulene ble bestemt ved å telle cellene i 200 fargede kuler på hver gang punkt. (B) Tidlig og sent tid punkt kuler ble fotografert under en invertert mikroskop. (C) Representative høstet kuler voksende 1, 4, 7, 11 og 14 dager i Matrigel kulturer, og avsettes på objektglass for bildebehandling, telling og antistoff farging.
CR-PRCA celler uttrykker telomerase revers transkriptase (TERT), mens normale humane prostata epitelceller er TERT-negative
TERT-ekspresjon av -PRCA celler som beskrives her ble analysert ved revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) amplifisering (figur 5A). Alle 30 adenokarsinomer som ga CR-PRCA dyrkede celler vist i tabell S1 uttrykt TERT RNA. RNA ekstrahert fra den humane cellelinjen teratom NTERA tjente som en tert-positiv kontroll, mens normale humane prostata epitelceller (NPrEp) avledet fra små donorer var TERT-negative (n = 3).
(A) TERT . RT-PCR-amplifisering av mRNA isolert fra -PRCA celler for ekspresjon av telomerase revers transkriptase (TERT) enzym. Alle de 30 PrCaCell kulturer testet uttrykt TERT mens NPrEp celler vokst fra tre unge givere ikke uttrykke TERT genet. Den udødelige NTERA (normal human teratom) cellelinje ble brukt som TERT-positiv kontroll. (B) TMPRSSG-ERG. RT-PCR resultatene av PrCaCell kulturer klarer å vise bevis for en TMPRSS2-ERG fusjon mRNA, mens cellene i menneske ryggvirvel metastase prostatakreft cellelinje Vcap gjøre uttrykke fusjon mRNA.
Cultured CR-PRCA celler uttrykker ikke påvisbare nivåer av TMPRSS2-ERG fusjon RNA
det er fortsatt uklart om uttrykk for TMPRSS2-ERG fusjon mRNA i en prostata kreft celle fungerer som en viktig driver for sine tumorigene egenskaper [33], eller hvorvidt fusjons hendelsen inntreffer
som følge av
en androgen responsiv tumorcelle tilstand, som foreslått ved induksjon av fusjons hendelse i normal prostata epitel-celler i respons til androgen [35], [36]. Uavhengig, av den 30 uavhengige -PRCA prøver dyrket, alle var negative for ekspresjon av TMPRSS2-ERG-fusjons mRNA ved hjelp av RT-PCR (figur 5B). Siden TMPRSS2-ERG-fusjons RNA kan være vanskelig å oppdage [37] har vi brukt flere forsterker oligo sett og den svært følsomme MyTaq forsterkersett (Bioline USA, Taunton, MA) (tabell S2). The human cellelinje Vcap, som uttrykker en TMPRSS2-ERG fusjon mRNA, ble bekreftet som uttrykker fusjons transkripsjon ved hjelp av bare en ng av isolert cellulært RNA (tabell S2). Det forsterkede fusjon av mRNA VCap-celler ble bekreftet ved sekvensering av DNA-amplifisering produkt [38] (ikke vist). Oppsummert har CR-PRCA celler dyrket her ikke uttrykke påviselig TMPRSS2-ERG fusjon RNA.
ortotopiske engraftment av PRCA celler
Felle antall erytroaplasi celler ble innpodet direkte inn i fremre prostata på mottaker SCID /beige mus og i mus kirurgisk og kjemisk kastrert. I noen forsøk ble -PRCA cellene først merket med EGFP ved infeksjon av dyrkede celler med en MSCV retrovirus som koder for EGFP [39].
In vivo
avbildning av SCID-mus xenopodet med EGFP-merkede celler generert et klart fluorescerende signal to uker etter engraftment i fremre prostata pode nettsted (figur 6A). Disse PRCA cellene utviklet seg til et lokalt invasive, cribriform (kjertel-in-kjertel) mønster forenlig med lav Gleason grad erytroaplasi (fig 6B og 6C). Økt cellularitet av stroma ved siden av komplekse kjertlene ble observert sammen med sentral nekrose i hulrommene og en uordentlig blanding av basal og cuboidal epitelceller (fig 6D-G). Interessant, enkle kreft kjertler uttrykte p63 i deres basalcellelaget (Fig 6D), mens i histologisk mer komplekse kjertler, p63 uttrykk ved basal celler ble redusert og uordentlig (Fig 6E).
(A)
in vivo
avbildning av EGFP-merket PRCA /CCC celler innpodet i fremre prostata av mottakerens SCID mus viser lokalisering av de grafts to uker etter pode inn i de fremre prostata kapsler. (B) Hematoxylin-eosin-farging av tumorvekst i prostata og urogenitale organer. (C) Høyere forstørrelse av cribriform kjertler antyder første utviklingen av invasiv prostatakreft. Både enklere og mer komplekse kjertler ble observert. (D) Proliferation markør p63-farget basalcellelaget av komplekse kjertler. (E) p63 uttrykk vises uro i histologisk høyere grad kjertler. (F) Enklere kjertler uttrykke markør CK5 /14, mens (G) kjertler som ser ut til å bli videre til cribriform prostatakreft bare sporadisk uttrykke med høy molekylvekt cytokeratin.
histologisk utseende av en lokal kreft induseres i en SCID-mus orthotopically xenotransplanted med 200 -PRCA celler blir sammenlignet med den til giveren Trinn i kreft vevsprøve (fig. S3). Begge svulster var sammensatt av små kjertler i hvilke celler med fremtredende nucleoli er hyppige. Gland strukturer ble ofte back-to-back eller kjertel-i-kjertel formasjoner. PRCA celle-indusert kreft i intakte SCID mottaker mus presentert en histologisk utseende som var umulig å skille fra kreft opprinnelsesland. I kastrerte mus, dårlig differensiert og spres svulster resulterte. I motsetning til dette opp til 10
5 normale humane prostata epitelceller (n = 3), som ble formert identisk og transplantert orthotopically inn i de fremre prostata av SCID og kastrerte SCID-mus ga ingen tumorvekst i opptil 30 uker.
Diskusjoner
Foreløpig er Stage jeg prostata adenokarsinom anses for å være hormonavhengig og hormon-responsive; Vanligvis blir disse kreftformer behandlet av androgen-deprivasjon terapier (ADT). Mange pasienter videre til dødelig fenotype av kastrering-resistente (CR) PRCA, muligens antyde at «switching» av kreftceller fra hormon-avhengighet til hormon-uavhengighet. Alternativt kan små populasjoner av celler har kvaliteter som tillater dem å overleve ADT med potensial til å spre tilbakevendende CR-primær eller metastatisk sykdom.
I denne studien har vi spredd «kastrering Resistente» epitelceller direkte fra Stage -I human prostata kreftvev med Gleason Resultater fra 6 til 9 (tabell S1). Ved hjelp av forholdene beskrevet, kolonier av androgen-uavhengig epitelceller vokste ut fra 30/43 tilfeller (70%) av adenokarsinomer, 22 av disse ble studert av orthotopic xenotransplanation i SCID-mus. -PRCA Celle koloni tall varierte vanligvis fra ~40 til 500 per 10
7 inngangsceller (50 mg av utgangs kreftvev), en frekvens på 0,0004 til 0,005%, selv om noen av de kolonidannende karsinomer som genereres svært få kolonier (tabell S1).
Kolonier av heft PRCA celler proliferated i fravær av androgen og serum, men gjorde kreve bFGF, EGF og hypofysen ekstrakt. Epitel PRCA kolonier utgikk fra trange sentre for 10-30 celler, utpekt Cancer Cell Clusters (CCC) (figur 1), som tapte CD133 men uttrykte c-kit, p63, og E-cadherin, markører for basal celler i prostata [40 ]. Markørene uttrykt av PRCA /CCC celler – CD44, CD133, CK5 /14, c-kit, inte α2β1, ALDH, SSEA4 og E-cadherin – er karakteristisk for basal celler og av prostata stilk /stamceller [14], [41 ] -. [43], noe som tyder på at CCC ligner en epitelial prostata stamcelle nisje
uttrykket av CR-PRCA dyrkede celler av p63 og dens delvis tap på generering av mer komplekse
in vivo
kjertler følgende xenotransplantasjon (fig 6E) tyder på at de dyrkede CR-PRCA celler kan avvike bare moderat fra sine vanlige kolleger i den menneskelige prostata. Likevel, den betydelige
in vivo
tumorigenicity av cellene og deres entydig uttrykk for TERT tyder på at disse CR-PRCA celler dyrket fra Stage-I prostatakreft representerer en tidlig manifestasjon av kreftfremkallende prosessen. Faktisk vil det være av stor interesse for fremtidige eksperimenter for å sammenligne uttrykket av kreftrelevante gener mellom Cr-PRCA celler som er beskrevet her og menneskelige NPrEp celler.
ortotopiske xenografting av PRCA celler (fig 6) og resulterende svulst induksjon bekreftet den grunnleggende kreft fenotypen av de dyrkede cellene PRCA. Likevel,
in vivo
transplantasjon av et lite antall kultur isolert PRCA celler i SCID-mus under forskjellige forhold resulterte i ulike utfall. Først PRCA celler transplantert i kollagen eller Matrigel i fremre prostata av SCID mus ga komplekse, back-to-back cribriform mønster-kjertler som invaderte de omkringliggende stroma, karakteristisk for lav Gleason Grade prostatakreft. I løpet av 12 ukers observasjonsperiode for de othotopic xenograft forsøkene ble metastase ikke observert. Xenotransplantasjon av alle 22 dyrkede CR-PRCA cellekulturer resulterte i enkle eller mer komplekse kreft kjertler (Fig 6E /F). Imidlertid vil den mulige sammenhengen mellom Gleason Score av den opprinnelige kreft (tabell S1) og kompleksiteten av xenotransplanted svulster i SCID-mottakere være gjenstand for fremtiden forespørsel. Subkutan transplantasjon av så mange som 5 × 10
5 PRCA celler i intakte eller kastrerte SCID mus ikke resulterer i dannelsen av svulster (data ikke vist), fremhever mikroavhengige natur PRCA celler dyrket fra tidlig prostata karsinom .
for det andre transplantasjon med urogenitale mesenchyme (UGM) rekombinasjon xenograft modell [44], [45] under nyrekapselen av SCID-mus (figur S4) resulterte i enkle kjertler består hovedsakelig av cuboidal celler som presenteres som basal celler uttrykker p63 og E-cadherin. Noen av de kjertler utviklet et andre lag av luminal celler som manglet p63 ekspresjonen, men beholdt E-cadherin, i likhet med normal prostata utvikling [46], [47]. Disse resultatene antydet at embryo UGM i vevet-rekombinasjon xenograft pålagt normale proliferative signaler på Stage-I-avledet PRCA celler [48], [49].
Mangel på PSA uttrykk ved de dyrkede PRCA celler beskrevet her og av sine orthotopically xenotransplantasjon-indusert kreft var uventet. En annen overraskelse var at disse kultur PRCA cellene til slutt senesced tross uttrykk for TERT. -PRCA Celler alltid differensiert og senesced etter ~8 overføringer i kultur, noe som tyder på at i fravær av en passende mikromiljøet /nisje disse cellene var dødelig. Men disse samme cellene var tilsynelatende udødelig
in vivo
i nærvær av sin prostata mikromiljøet, som dokumentert av orthotopic xenotransplantion av rundt 200 PRCA celler, noe som resulterer i en kreft byrden av 20 g, tilsvarer ~ 25 celle doublings. Derfor selvfornyelse av CR-PRCA celle CIC synes å være betinget, noe som krever en passende mikromiljøet. Faktisk, den vanlige definisjonen av CIC omfavner en udødelig fenotype [50], som CIC har ofte blitt isolert fra fullt utviklet seg og /eller metastatisk kreft [51] – [53]. I tillegg, i kastrerte mus enkelte dyrkede CR–PRCA celler som ble orthotopically xenotransplanted inn i den fremre prostata av SCID-mus har vokst kontinuerlig til mus måtte ofres mens de bar en magetumorbyrden lik vekten av mus (data ikke vist ).
tilstedeværelsen av CR-prostata kreft celler som innehar en stamcelle fenotype tidlig prostatakreft er i samsvar med de siste resultatene [54] at dokumentet en systematisk økning i PRCA stilk /stamceller i løpet av ADT av PRCA pasienter, forklare hvordan gjeldende ADT kan resultere i en uønsket utvidelse av en PRCA stilk /stamceller befolkning med terapi fiasko. Våre funn tyder på at CR-PRCA celle CIC som er til stede i mer enn halvparten av Stage-I pasient kohort undersøkes kan være knyttet til behandlingen svikt beskrevet av andre [54].
Andre forskere har isolert antatte PRCA stammen celler ved hjelp av en modifisert Hoechst 33342 fargestoff-utløps assay for å isolere side-anrikede populasjoner av putative stamceller fra ondartet prostatavevet [55] – [58]. En annen tilnærming har undersøkt eksistensen av en androgen-uavhengig stamcelle som kan gi opphav til androgen-avhengige, fullt differensierte luminal celler via en transitt-forsterkende befolkningen positive til uttrykk CK5 /14, CK18, CD44, ABCG2, CD133, og integrin α2β1 [14], [59], [60]. En tredje tilnærming har undersøkt immortalisering av prostata stamceller ved tvungen ekspresjon av human telomerase (hTERT) [9], [20], [41], [61]. Til slutt, har menneskelige prostata tumor initiere celler blitt beskrevet som viser stilk-lignende egenskaper med økt NF-kappaB aktivitet [62]. Forholdet mellom de PRCA celler som presenteres her, og cellepopulasjoner beskrevet av andre forskere, vil kreve ytterligere eksperimentell undersøkelse.
I sammendraget, data presentert påvise kreftceller, i de tidligste stadiene av menneskelige prostata adenokarsinomer , som kan spres i definerte medier mangler androgener. De unike dyrkningsforhold presentert her, og det er relativt enkelt for forplantning av androgen-uavhengig proliferativ cellepopulasjoner kan forventes å stimulere ytterligere forskning. Betydelig, kan disse metodene brukes til små biopsiprøver, slik karakterisering av antatte CR-prostatakreftceller og tilrettelegging evidensbasert klinisk behandling tidlig i sykdomsforløpet.
