Abstract
Dannelsen av levermetastaser ved kolorektalkreft pasienter som er den primære årsak til pasientens død. Nåværende behandlingsformer rettet mot levermetastaser fra kolorektal kreft har hatt minimal effekt på pasientutfall. Derfor er utvikling av alternative behandlingsstrategier for levermetastaser nødvendig. I foreliggende studie demonstrerte vi at rekombinant humant apolipoprotein (a) kringle V, også kjent som rhLK8, induserte den apoptotiske omsetning av endotelceller
in vitro
gjennom mitokondrie apoptose pathway. Interaksjonen mellom rhLK8 med glukoseregulerte protein 78 (GRP78) kan være involvert i induksjon av apoptose på grunn av inhiberingen av GRP78 av grp78-spesifikke antistoffer eller siRNA knockdown inhiberte rhLK8-mediert apoptose av humane navlevene endotelceller
i vitro
. Deretter for å evaluere effektene av rhLK8 på angiogenese og metastase, er en eksperimentell modell av levermetastaser etablert ved injisering av en human kolorektal kreft cellelinje LS174T, inn i milten av Balb /c nakne mus. Systemisk administrasjon av rhLK8 undertrykte betydelig levermetastaser fra humane tykktarmskreftceller og forbedret vert overlevelse sammenlignet med kontroller. Kombinasjonen av rhLK8 og 5-fluorouracil vesentlig øket overlevelse disse fordeler, sammenlignet med enten terapi alene. Histologiske observasjoner viste signifikant induksjon av apoptose blant tumorassosierte endotelceller i levermetastaser fra rhLK8-behandlede mus sammenlignet med kontrollmus. Sammen er disse resultatene tyder på at kombinasjonen av rhLK8 med konvensjonell kjemoterapi kan være en lovende metode for behandling av pasienter med livstruende tykktarmskreft levermetastaser
relasjon:. Ahn JH, Yu HK, Lee HJ, Hong SW, Kim SJ, Kim JS (2014) Undertrykkelse av tykktarmskreft levermetastaser ved Apolipoprotein (a) Kringle V i en Nude Mouse Model gjennom induksjon av apoptose i tumorassosiert endotelceller. PLoS ONE 9 (4): e93794. doi: 10,1371 /journal.pone.0093794
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 10 desember 2013; Godkjent: 07.03.2014; Publisert: 03.04.2014
Copyright: © 2014 Ahn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansielt støttet av Green Cross Corporation, et stipend fra Korea Helse 21 R D Project, departementet for helse, velferd og familiedepartementet, republikken Korea (A050905), et stipend fra KRIBB Forskningsinitiativet Program, og med en grunnleggende Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2012R1A1A2007994). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft dødsfall i USA. Det er anslått at i år 2013, nesten 142 820 nye tilfeller av kolorektal kreft ble diagnostisert og 50,830 pasienter døde av denne sykdommen [1]. Omtrent 25% av pasientene til stede med metastatisk sykdom ved diagnose. De resterende 75% blir behandlet kirurgisk med kur som mål [2], men selv med fullstendig fjerning av sykdommen til slutt går igjen i 50% av disse pasientene. Leveren er hovedorganet for metastaser i pasienter med kolorektal kreft, før og etter kirurgisk fjerning av den primære tumor, og dannelsen av levermetastaser utgjør en viktig dødsårsak av sykdommen [3]. Kirurgi er den primære behandlingsalternativ for isolerte metastaser, men bare 20-25% av pasientene som er egnet for reseksjon [4], og tilbakefall etter kirurgi er hyppig. Derfor er utvikling av en ny behandlingsform for denne livstruende sykdoms et presserende behov.
Angiogenese er utvikling av nye kapillærer fra pre-eksisterende blodkar. Fordi angiogenese er nødvendig for den store vekst og metastasering av primære tumorer, er den angiogene prosess betraktes som et lovende mål for nye kreftterapier [5], [6]. Mange angiogenese hemmere, som angiostatin og endostatin, som viser betydelige efficacies mot en rekke svulster, inkludert metastatisk kolorektalcancer i pre-kliniske omgivelser, er identifisert [7], [8]. Godkjenning av bevacizumab (Avastin), et humanisert monoklonalt antistoff mot vaskulær endotelial vekstfaktor, av USA Food and Drug Administration i 2004 som en førstelinjebehandling ved metastatisk kolorektalcancer ytterligere validert ideen om at blokkerer angiogenese er en effektiv strategi for ved behandling av human kolorektal kreft.
Metastase er en meget kompleks prosess som består av en rekke trinn, herunder intravasation av tumorceller fra det primære stedet inn i blodet eller lymfesystemet sirkulasjon, overlevelse av cellene i det sirkulatoriske blod system, kolonisering av et sekundært organ, initiering og opprettholdelse av vekst og utvikling av nye blodkar for metastatisk tumor [9], [10]. Noen av disse trinnene i metastasering kan være et terapeutisk mål fordi svikt i ett trinn forstyrrer hele metastatisk kaskade. Men etter den tid primære kolorektal kreft blir oppdaget, har subkliniske eller klinisk relevante levermetastaser allerede skjedd [11]. Følgelig, rettet mot de senere trinn av metastaser, som for eksempel utvikling av nye blodkar, er lovende fordi denne prosessen ikke kan ha oppstått på tidspunktet for tykktarmskreftdiagnose. Dessuten er dette trinnet vurderes som mindre effektiv enn tidligere trinn, for eksempel intravasation, overlevelse i sirkulasjon, og første kolonisering på videregående nettstedet. Biologisk ineffektive prosesser kan målrettes enkelt fordi færre celler må være målrettet. I lys av disse betraktninger, antiangiogene terapi, som først og fremst er rettet mot den angiogenese-avhengig vekst av metastaser, er en klinisk tilgjengelige og biologisk relevant terapeutisk strategi for levermetastaser.
apolipoprotein (a) [apo (a) ] er et glykoprotein komponent av humant lipoprotein (a) og har blitt rapportert å være assosiert med utvikling av aterosklerose og koronar hjertesykdom [12]. Apo (a) består av gjentatte kringle-domener som tett ligner plasminogen kringle 4, fulgt av sekvenser som er homologe til den kringle 5 og protease-domener av plasminogen [13]. Den fysiologiske rolle (e) av apo (a) kringle-domener fortsatt dårlig forstått. Imidlertid, i samsvar med den foreslåtte rolle Kringles eksempel generelle inhibitorer av vekst av blodkar [14], foreslår nåværende bevis for at full-lengde eller forkortede former av apo (a) Kringles hemme angiogenese både
in vitro
og
in vivo Hotell og undertrykke tumorvekst i dyremodeller [15], [16], [17]. Vi har også vist at rekombinant apo (a) kringle V, kalt rhLK8, hemmer migrering av human navlestrengvene endotelialceller (HUVECs)
in vitro
, blant annet ved å interferere med aktivering av fokal adhesjon kinaser og den påfølgende dannelse av aktin stresset fiber /fokale sammenvoksninger [18]. rhLK8 også hemmet neovascularization av chick chorioallantoic membraner og kapillær infiltrasjon i Matrigel plugger
in vivo
. Nylig demonstrerte vi at systemisk administrering av rhLK8 i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel, paclitaxel, kan svekke veksten av PC-3MM2 humane prostatakreftceller i prostata og tibia fra nakne mus [19]. Vi har observert at behandling med rhLK8, særlig i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel, induserer apoptose i tumorassosierte endotelceller, etterfulgt av apoptose av de omkringliggende tumorceller. Men den nøyaktige biokjemiske mekanismen som rhLK8 induserer apoptose i endotelceller forble ukjent.
I den foreliggende studien undersøkte vi mekanismen for rhLK8-indusert apoptose i tumorassosierte endotelceller og testet om rhLK8 behandling, i kombinasjon med kjemoterapi, undertrykker tykktarmskreft levermetastaser. Vi fant at rhLK8 induserer apoptose i endotelceller gjennom den mitokondrielle apoptose sti
in vitro.
Dets interaksjon med glukoseregulerte protein 78 (GRP78) på den endoteliale celleoverflaten kan spille en avgjørende rolle i denne prosessen. Vi demonstrerte også at rhLK8, spesielt i kombinasjon med konvensjonell kjemoterapi, undertrykte betydelig levermetastaser ved å indusere apoptose av tumorassosierte endotelceller
in vivo
, noe som resulterer i forbedret overlevelse vert i en eksperimentell dyremodell av levermetastaser.
Materialer og metoder
uttrykk og rensing av rhLK8 og dets derivater
Saccharomyces cerevisiae
BJ3501 stamme ble transformert med en ekspresjonsvektor for
rhLK8
, som ble konstruert for å uttrykke rhLK8 som et fusjonsprotein med et α faktor signalsekvens under kontroll av gjær
Gal
en promoter og deretter prosessert for å bli utskilt i kulturmedium [20]. rhLK8 proteiner ble renset til homogenitet fra kultursupernatanten av
S. cerevisiae
BJ3501 uttrykke rhLK8, som tidligere beskrevet [21]. Renset rhLK8 proteiner ble lagret i buffer inneholdende 100 mM NaCl og 150 mM L-glycin (pH 4,2).
DNA fragmentet som koder for rhLK8 protein kondensert til en hemagglutinin (HA) epitop ved den C-terminale ende (rhLK8 -Ha) ble amplifisert ved to cykler av polymerasekjedereaksjon (PCR) ved å bruke de følgende primere: rhLK8-forover (5′-TTT TTC CAT ATG GAA CAG GAC TGC ATG TTT GGG AAT GGG-3 «) og HA1-revers (5 «-CAC ATC ATA AGG GTA AGA GCC CCC GCC AAA TGA AGA GGA TGC ACA GAG AGG-3′) for den første syklusen med rhLK8-ekspresjonsvektoren som mal og rhLK8 fremover og HA2-revers (5»-GGA TCC TCA AGA CCC AGA GGC ATA ATC TGG CAC ATC ATA AGG GTA AGA GCC CCC-3 «) for den andre syklus ved hjelp av PCR-produktet fra den første syklusen som templat. Den forsterkede rhLK8-HA DNA fragment ble klonet inn i Dyre 15b prokaryote ekspresjonsvektor (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), som så ble brukt til å transformere
Escherichia coli
BL21 (DE3). Ekspresjon av transgenet ble indusert i henhold til produsentens instruksjoner. rhLK8-HA ble uttrykt som en 6 × His-tagget protein og løselig protein var affinitetsrenset ved å bruke PET-His-Tag systemer (Merck KGaA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Analyse av apoptose ved farging med Hoechst 33452
Confluent menneskelig navleveneendotel celle (HUVEC, Lonza, Walkers, MD, USA) kulturer ble inkubert i EBM-2 media (Lonza) supplert med en% FBS og forskjellige konsentrasjoner av rhLK8 (0,1-5 uM) i nærvær eller fravær av 3 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF). Etter en inkubasjonstid på 12 eller 24 timer, ble cellene farget med Hoechst 33452 (500 ng /ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) i 30 minutter ved 37 ° C, og apoptose ble bestemt ved kjerne kromatin kondensering ved anvendelse av en fluorescens mikroskop (Olympus BX51, Olympus, Center Valley, PA, USA) [22]. Tilfeldige mikroskopiske feltene ble undersøkt for hver eksperimentell tilstand, og andelen av celler som ble gjennomgår apoptose i hvert felt ble bestemt.
Western blotting av apoptose-relatert Proteiner
Celler ble lysert i Triton lyse -buffer [137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-100 og 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)] inneholdende proteaseinhibitorer. En porsjon av hvert lysat ble separert ved SDS-PAGE ved anvendelse av geler polymerisert 4-20% akrylamid i Tris /glysin-buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og immunoblotting ble utført med antistoffer mot procaspase-3, procaspase-9 ( Cell Signaling, Beverly, MA, USA), kløyvde caspase-3 og procaspase-8 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Eluerte prøver av ko-immunoutfellingsstudier eksperimenter ble også utsatt for SDS-PAGE, og elektroforese ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner. Hver membran ble inkubert med mus anti-grp78 antistoffer (BD Biosciences, 1:1,000) eller kanin anti-Hans antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; 1:1,000) og deretter med peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin antistoffer (KPL, Gaithersburg, MD, USA; 1:5,000).
Fraksjonering av cytosoliske og membranbundne proteiner
cytosoliske og membran fraksjoner ble utarbeidet av selektiv plasma membran permeabilization med digitonin, etterfulgt av membranen oppløsning [23]. I korthet ble cellene behandlet med 0,05% digitonin i isotonisk buffer A [10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl
2, og 1 mM EGTA (pH 7.4)] inneholdende proteaseinhibitorer [1 mM 4- (2- aminoetyl) benzensulfonyl fluor-hydroklorid, 0,8 uM aprotinin, 50 uM bestatin, 15 uM E-64, 20 uM leupeptin, og 10 uM pepstatin A] i 2 minutter ved romtemperatur. De permeabilized celler ble samlet ved 4 ° C. Etter sentrifugering ved 15000 x g i 10 minutter, ble supernatanten (cytosoliske fraksjonen), og pelleten (membran fraksjon) samles separat. For å frigjøre membran og organellebundne proteiner, ble pelleten ytterligere ekstrahert med iskald 1% Nonidet P-40 i buffer A inneholdende protease inhibitorer i 60 minutter ved 4 ° C. Begge cytosoliske og membran fraksjoner ble analysert ved Western blotting ved hjelp av antistoffer mot cytokrom c (BD Biosciences).
Byggingen av Expression Vector for glukose-regulerte Protein 78 (GRP78) og Transient Transfeksjon å HEK293 celler
GRP78
genet ble amplifisert ved PCR ved hjelp av følgende primere: forover (5′-TTT TTT GGA TCC ATG AAG CTC TCC CTG GTG GCC-3 «) og revers (5»-TTT TTT GCG GCC GCT CTA CAA CTC ATC TTT TTC TGC-3 «), og deretter klonet inn i den eukaryote ekspresjonsvektoren pcDNA3.1-myc-sin (-) b (Invitrogen). Transient transfeksjon av HEK-293 celler med
GRP78
ekspresjonsvektor ble utført ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen) reagenser i henhold til produsentens instruksjoner. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene vasket 3 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), høstet ved skraping, og sentrifugert i 5 minutter ved 500 x g. De oppsamlede celler ble lysert ved bruk av IP-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6) inneholdende 1% NP-40, og celle-ekstrakter ble analysert ved Western blotting.
Co-immunpresipitering av rhLK8- bindingsproteiner
HEK293 celler transfektert med
grp78
ekspresjonsvektorer ble samlet opp og ekstrahert ved hjelp av lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1% NP-40, 1 x proteaseinhibitor, og en mM fenylmetylsulfonylfluorid, pH 7,6). Celleekstraktene ble blandet over natten ved 4 ° C med 10 ug av monoklonalt anti-HA-antistoff, 2 ug HA-merket rhLK8, og protein G-agarose (Sigma). De immunadsorbenter ble utvunnet ved sentrifugering i 5 min ved 700 x g, vasket tre ganger, og sentrifugert (5 min ved 700 x g) i IP-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,1% NP-40, pH 7,6). Pelletene ble resuspendert i 30 ul SDS-PAGE ladningsbuffer (Sigma) og analysert ved Western blotting.
siRNA Transfeksjon
HUVECs ble trypsinert, telles og fortynnet i antibiotika-fritt EGM- 2 medium til 2,5 × 10
5 celler /ml for transfeksjon med Dharma
komne
1 (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet HUVECs ble sådd ut i 100 mm skåler og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 over natten. En milliliter 2 mikrometer ON-TARGETplus SMARTpool siRNA (Thermo Fisher Scientific) mot
GRP78
fortynnet i en × siRNA Buffer (tube-1) og Dharma
komne
1 (tube-2) fortynnet med serumfritt medium ble satt i separate rør, inkubert i 5 minutter ved værelsestemperatur, blandet sammen, og deretter inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. De ruges blandinger av siRNA og Dharma
komne
1 ble fortynnet i 8 ml serumfritt medium og deretter lagt til 100 mm fatet med HUVEC monolag. Etter 24 timer ble transfeksjon mediet erstattet med fullstendig medium inneholdende FBS og vekstfaktorer. To dager etter transfeksjon, ble HUVECs splittet, og på den fjerde dagen ble de høstet eller replated for andre forsøk.
Analyse av rhLK8 Binding til GRP78 på HUVECs ved flowcytometri
For å måle bindingen av rhLK8 til GRP78-protein på overflaten av HUVECs ble rhLK8 merket med FITC ved bruk av et FITC-merking kit (Sigma) i henhold til produsentens instruksjoner. HUVECs som var blitt transdusert med egge siRNA eller GRP78-spesifikk siRNA ble trypsinert og nøytralisert ved trypsin nøytraliserende oppløsning (Lonza). 5 x 10
5 HUVECs ble farget ved bruk av FITC-merket rhLK8 eller GRP78 antistoffer i 1,5 timer ved 4 ° C, vasket med PBS, 3 ganger og analysert ved flowcytometri med en FACS Kaliber (BD Biosciences).
Animal Model for eksperimentell levermetastaser
atymiske BALB /c nakne mus ble bedøvet med en intraperitoneal (ip) injeksjon av ketamin /xylazin (Sigma). Milten ble deretter exteriorized gjennom en venstre lateral flanke innsnitt. Omtrent 3 x 10
5 LS174T humane kolorektale carcinom-celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) i 100 ul av Hanks balanserte saltløsning ble injisert inn i milten parenchyma ved hjelp av en 27-gauge nål. Bukhinnen og huden ble stengt i to lag med metallklips. Fra dagen for tumorcelle inokulering, mus hadde daglig i.p. administreringer av to, 10 og 50 mg /kg rhLK8 i to uker. I tillegg, kontroll og rhLK8 (2, 10 eller 50 mg /kg) behandlede mus ble ansatt i overlevelse eksperimenter (n = 10 /hver gruppe).
For å undersøke den terapeutiske effekten av rhLK8 behandling i kombinasjon med en konvensjonell kjemoterapi, ble musene injisert med LS174T celler tilfeldig delt inn i fire grupper (n = 5 pr gruppe) og behandlet som følger: (1) daglig ip administrering av bærer (100 mM NaCl, 150 mM L-glycin, pH 4,2); (2) i.p. injeksjon av 5-fluorouracil (5-FU, 8 mg /kg /dag) for de første fem dagene etter intrasplenic injeksjon; (3) daglig i.p. injeksjon av rhLK8 (10 mg /kg); og (4) daglig i.p. administrasjon av rhLK8 (10 mg /kg) og i.p. injeksjon av 5-FU (8 mg /kg /dag) i de første fem dagene etter intrasplenic injeksjon. Kontroll og rhLK8-behandlede mus ble også anvendt i overlevelse eksperimenter (n = 10 mus pr gruppe) eller ble avlivet ved CO
2 inhalering 2 uker etter behandling, og på dette tidspunkt lever ble samlet, veiet og analysert for å bestemme overflate svulst nodule tall eller ble utsatt for histologisk og immunhistokjemisk undersøkelse.
Etikk erklæringen
Alle kirurgiske prosedyrer ble godkjent av dyreetikk komité for Mogam Bioteknologi Research Institute eller Korea Research Institute of Biovitenskap og bioteknologi (KRIBB-AEC-13011) og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Care administrert til dyrene var i samsvar med retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health.
Histologi og Immunohistochemistry
Å telle intrahepatisk knuter, den tumor- bærende lever ble dissekert, fiksert med 10% nøytral bufret formalin over natten, innstøpt i parafin, og delt inn i 4 um skiver. Snittene ble farget med hematoksylin og eosin (H E) og utsatt for immunhistokjemisk analyse. For frosne blokker, ble vevsprøver dissekert fra mus, innleiret umiddelbart i ornitin karbamoyl transferase (oktober, Miles, Elkhart, IN, USA) forbindelse, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -70 ° C. Frosne vev til CD31 /PECAM-1 og /eller terminal deoksynukleotidyl transferase-mediert dUTP nick ende merking (TUNEL) farging ble fremstilt og fiksert i kald aceton. Den TUNEL-analysen ble utført med en kommersielt tilgjengelig apoptose deteksjon kit (Promega, Madison, WI, USA) med noen modifikasjoner. Immunhistokjemi prosedyrer ble utført og alle antistoffer, og midler for immunohistokjemi ble kjøpt fra kilder som tidligere beskrevet [24]. Kontrollprøver utsatt for sekundære antistoff alene viste ingen spesifikk farging. De fargede seksjonene ble undersøkt under et Olympus BX51 mikroskop (Olympus) er utstyrt med et Olympus DP71 12,5 megapiksel digitalt mikroskop kamera.
Immunofluorescent Double farging for CD31 /PECAM-en (endotelceller) og TUNEL
Den TUNEL-analysen ble utført ved å følge CD31 /PECAM-en immunofluorescerende flekker som tidligere beskrevet [24]. Vevsprøver ble inkubert med 300 ug /ml av Hoechst 33342 flekken i 1 minutt ved romtemperatur. Propylgallat ble plassert på hvert lysbilde og deretter dekket med et glass dekkglass (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA). Endotelceller ble visualisert med rød fluorescens, og fragmentert DNA (TUNEL assay) ble visualisert med grønn fluorescens. Samlokalisering av røde og grønne signalene frem gule signaler (apoptotiske endotelceller).
Statistical Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av Student
t
-test, med unntak av
in vivo
overlevelse eksperimenter, som vi brukte log-rank analyse av et Kaplan-Meier overlevelseskurve. En verdi på
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekter av rhLK8 på endotelcelle apoptose in vitro
For å fastslå effekten av rhLK8 på endoteliale celle apoptose, ble HUVEC-monolag inkubert i EBM-2 inneholdende 1% FBS i nærvær eller fravær av 3 ng /ml bFGF og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av rhLK8 (0,1-5 pM) i 12 eller 24 timer. Apoptotiske endotelceller ble identifisert ved kjerne morfologi etter farging med Hoechst 33452 (Fig. 1A). Behandling med rhLK8 signifikant induserte apoptose av HUVECs i en tids- og doseavhengig måte i fravær (fig. 1B) eller nærvær (fig. 1C) av angiogene faktorer som for eksempel 3 ng /ml bFGF.
HUVEC-monolag ble inkubert i EBM-2 inneholdende 1% FBS i nærvær eller fravær av 3 ng /ml bFGF og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av rhLK8 (0,1-5 pM) i 12 eller 24 timer. Endothelial apoptose ble vurdert ved atom morfologi etter farging med Hoechst 33452.
(A)
Representative photomicrographs av kontroll (
venstre
) eller rhLK8 (5 mm) -behandlet HUVECs (
høyre
) i nærvær av 3 ng /ml bFGF i 12 timer. Apoptotiske endotelceller er indikert med piler.
B Hotell og
C
, prosentandelen av celler som gjennomgår apoptose ble bestemt i celler behandlet med ulike konsentrasjoner av rhLK8 i fravær (
B
) eller nærvær (
C
) av bFGF etter 12 (
fylte søyler
) eller 24 timer (
åpne barer
). Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SD. (
D-F
) HUVECs ble inkubert med rhLK8 (5 mm) for ulike tidsperioder som angitt. Cellene ble deretter oppsamlet og lysert, og fullcelle-proteiner ble separert ved SDS-PAGE. (
D
) Aktivering av kaspase-3 ble bestemt ved Western blotting ved å bruke antistoffer mot procaspase-3 eller et 20 kDa bearbeidet form av caspase-3, som angitt. (
E
) Western blotting ved å bruke antistoffer mot procaspase-9 ble utført for å bestemme aktiveringen av caspase-9. Actin (
nedre panel
) ble anvendt som en kontroll lasting. (
F
) cytosoliske og membranbundne proteiner ble fremstilt som beskrevet i «Materialer og metoder», og ble analysert ved Western blotting ved anvendelse av antistoffer mot cytokrom c for å bestemme frigjøring av cytokrom c inn i cytosol. Proteinprøver lastet på
lane C-16
ble fremstilt fra celler inkubert uten rhLK8 i 16 timer. De immunoblot som vises er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. (Replikater av Fig. 1D, 1E, og 1F er tilgjengelig i fig. S1).
Caspase-3 og caspase-9 Aktivering og Cytokrom C Slipp inn i cytosol ved rhLK8
for å undersøke de biokjemiske egenskapene til rhLK8-indusert apoptose av HUVECs, vi først testet effekten av rhLK8 på aktivering av en effektor caspase, caspase-3, som er et viktig steg i apoptose. HUVECs behandlet med rhLK8 (5 uM) viste reduserte nivåer av 32-kDa procaspase-3, men økte nivåer av det 20-kDa behandlet fragment av caspase-3 (fig. 1D og fig. S1A), noe som indikerer at aktiveringen av caspase-3- . Spalting av et caspase-3-substrat, poly ADP-ribose polymerase, ble også påvist i rhLK8-behandlede HUVECs (data ikke vist). Effektor caspaser er aktivert på nedstrømssiden av caspase-8 eller caspase-9, som er de initiator kaspasene involvert i signalisering gjennom to forskjellige apoptotiske reaksjonsveier, død reseptoren og mitokondrielle veier, henholdsvis [25]. For å finne ut hvilken vei er ansvarlig for rhLK8-indusert endotelceller apoptose, testet vi effekten av rhLK8 (5 mm) på aktivering av caspase-8 eller caspase-9. Nivået av procaspase-9 var signifikant redusert i rhLK8-behandlede HUVECs sammenlignet med kontrollceller (Fig. 1E og fig. S1B), mens ingen forskjell i nivået av procaspase-8 ble observert (data ikke vist), som indikerer at den mitokondrielle pathway (også kjent som den indre vei) var involvert. Fordi den mitokondrielle veien initieres ved frigjøring av cytokrom c og andre polypeptider fra mitokondrie intermembrane plass inn i cytosol, undersøkte vi cytokrom c frigivelse i rhLK8-behandlede HUVECs. rhLK8 (5 uM) forårsaket en tidsavhengig reduksjon i nivået av cytokrom c på mitokondriemembranen, mens nivået av cytosolisk cytokrom c ble samtidig øket (fig. 1F og S1C fig.).
rhLK8 samspill med GRP78
Nylig har plasminogen kringle V (PK5) er rapportert å indusere caspase-avhengig apoptose av tumorceller og endotelceller ved å binde seg til GRP78 på celleoverflaten [26]. Basert på den høye sekvens homologi mellom PK5 og rhLK8, testet vi muligheten for at rhLK8 kan indusere apoptose av endotelceller ved å samhandle med GRP78. Vi blandet utdrag fra HUVECs eller HEK293 celler uttrykker Hans-merket GRP78 med 10 mikrogram av monoklonalt anti-HA antistoff, 2 mikrogram HA-merket rhLK8, og protein G-agarose og immunoprecipitants ble immunoblottet med anti-GRP78 eller anti-His antistoffer. Både endogent GRP78 i HUVECs (fig. 2A og S2A fig.) Og His-tagget GRP78 i HEK293-celler (Fig. 2B og fig. S2B) klart bundet til rhLK8 tilsatt til ko-immunpresipitasjon blanding. Men ingen GRP78 protein ble registrert da co-immunoprecipitation analysen ble utført i fravær av HA-merket rhLK8 protein.
For immunoprecipitation (
IP
) eksperimenter, celleekstrakter (
A
) HUVECs eller (
B
) HEK293-celler som uttrykker 6 x His-tagget GRP78-protein ble blandet over natten ved 4 ° C med 10 ug HA monoklonalt antistoff, 2 ug HA-merket rhLK8, og protein G-agarose. Eluerte prøver ble separert ved SDS-PAGE. GRP78 bundet til rhLK8 ble påvist ved Western blot (
WB
) ved anvendelse av et anti-GRP78 monoklonalt antistoff eller anti-His-antistoff. For å bestemme bindingen av rhLK8 til GRP78-protein på overflaten av HUVECs, HUVECs som var blitt transdusert med egge siRNA eller
GRP78-
spesifikke siRNA ble høstet og farget med (
C
) FITC -merket rhLK8 eller (
D
) anti-grp78 antistoffer og analysert av flowcytometri. Ufargede celler eller celler farget med FITC-merket sekundært antistoff bare ble anvendt som negativ kontroll. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. (Replikater av Fig. 2A og 2B er tilgjengelig i fig. S2).
rhLK8 binder seg til GRP78 uttrykt på overflaten av HUVECs
For å avgjøre om rhLK8 binder seg til GRP78 uttrykt på overflaten av HUVECs, HUVECs ble behandlet med enten den spesifikke siRNA for
gRP78
eller kryptert siRNA, farget med FITC-konjugert anti-rhLK8 eller gRP78-antistoffer, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Både rhLK8 og grp78-antistoffer bundet til overflaten av HUVECs transdusert med kontroll siRNA på en doseavhengig måte, mens bindingen av rhLK8 og grp78-antistoffer ble redusert i HUVECs transdusert med
GRP78
-spesifikk siRNA (Fig. 2C og 2D).
rhLK8 induserer apoptose av endotelceller in vitro ved å samhandle med gRP78
for å avgjøre om grp78 proteiner er involvert i rhLK8-indusert apoptose av endotelceller, HUVECs ble behandlet med en antistoff mot GRP78 før behandling med rhLK8. Behandling med en GRP78 antistoff betydelig redusert nivå av aktiv caspase-3 i HUVECs sammenlignet med kontrollcellene, hvilket indikerer at GRP78 kan spille en rolle i rhLK8-mediert endotel celle apoptose (Fig. 3A og S3A fig.). Disse dataene er støttes ytterligere av de resultater som viser at apoptose i HUVECs med GRP78 siRNA knockdown var ikke forskjellig med eller uten behandling med rhLK8 (fig. 3B og fig. S3b-D), mens den apoptose av HUVECs transfektert med det forvrengte siRNA var signifikant indusert ved behandling med rhLK8, som bestemt ved økningen i aktiv caspase-3, og nedgangen i procaspase-9 (fig. 3B og fig. S3b-D). Konsekvent, GRP78 antistoff behandling eller
GRP78
knock-down av siRNA transfeksjon avskaffet rhLK8-indusert apoptose av HUVECs på cellenivå, som vurderes med antall apoptotiske celler (fig. 3C).
(
A
) for å bestemme hvorvidt GRP78 kan være involvert i rhLK8-mediert apoptose endotelcelle, HUVEC-monolag ble behandlet med rhLK8 (1 eller 5 uM) etter forbehandling med 5 ug GRP78-antistoff i 30 min. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (
B
) HUVECs transfektert med egge siRNA eller
grp78
-spesifikke siRNA ble behandlet med 5 mikrometer av rhLK8. Den etterfølgende induksjon av apoptose ble påvist ved antistoffer mot aktiv caspase-3 eller procaspase-9. Ekspresjon av GRP78 ble påvist ved hjelp av anti-GRP78 monoklonalt antistoff. GAPDH ble brukt for lasting kontroll. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. (C) HUVECs behandlet med GRP78 antistoff eller transfektert med
grp78
-spesifikke siRNA ble behandlet med rhLK8 (5 mm) og endotelceller apoptose ble vurdert ved atom morfologi etter farging med Hoechst 33452. Representative mikrofotografier vises. Apoptotiske endotelceller er indikert med piler. De forstørrelser er × 100. (Replikater av Fig. 3A og 3B er tilgjengelig i fig. S3).
Behandling med rhLK8 Undertrykker Vekst av Intrasplenically Injisert LS174T celler i leveren
Som angiogenese er avgjørende for tumorcellemetastase og fast tumorvekst, undersøkte vi effekten av rhLK8 på levermetastaser av intrasplenically injiserte LS174T celler. Mus i rhLK8 behandlingsgruppen som mottok daglig i.p. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
