Abstract
Til tross for fremskritt innen deteksjon og behandling, fortsetter kastrering resistent prostatakreft å være et stort klinisk problem. Den avvikende aktivitet hos stamcelle veier, og deres regulering av androgen reseptor (AR), har potensial til å gi innsikt i nye mekanismer og veier å forebygge og behandle avansert, kastrere bestandig prostatakreft. For å oppnå dette, undersøkte vi rollen av embryonale stamceller regulator Sox2 [SRY (kjønn bestemmelse region Y) -boks 2] i normale og maligne prostata epitelceller. I normal prostata, er Sox2 uttrykt i et parti av basale epitelceller. Prostatakreft var enten Sox2-positive eller Sox2-negativ, med prosentandelen av Sox2-positive svulster øker med Gleason Score og metastaser. I kastrering resistent prostatakreft cellelinje CWR-R1, ble endogen uttrykk for Sox2 trykt av AR signalering, og AR kromatin-IP viser at AR binder enhancer element innenfor Sox2 promoter. Likeledes, i normale prostata epitel-celler og humane embryonale stamceller, øket AR signale minker også Sox2 uttrykk. Resistens mot anti-androgen MDV3100 resulterer i en markert økning i Sox2 ekspresjon i løpet av tre prostatakreft-cellelinjer, og i det kastrering følsomme LAPC-4 prostatacancercellelinje ektopisk ekspresjon av Sox2 var tilstrekkelig til å fremme kastrering-resistente tumordannelse. Tap av Sox2 ekspresjon i kastrering-resistente CWR-R1 prostatakreft-cellelinje hemmet cellevekst. Oppregulering av Sox2 var ikke assosiert med økt CD133 uttrykk, men var assosiert med økt FGF5 (fibroblastvekstfaktor 5) uttrykk. Disse dataene foreslå en modell av forhøyet Sox2 uttrykk på grunn av tap av AR-mediert undertrykkelse under kastrering, og påfølgende kastrering-motstand via mekanismer som ikke involverer induksjon av kanoniske embryonale stamcelle trasé
Citation. Kregel S, Kiriluk KJ Rosen AM, Cai Y, Reyes EE, Otto KB, et al. (2013) Sox2 Er en androgen Receptor-trykt Gene som fremmer Kastrering resistent prostatakreft. PLoS ONE 8 (1): e53701. doi: 10,1371 /journal.pone.0053701
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: 13 august 2012; Godkjent: 03.12.2012; Publisert: 11 januar 2013
Copyright: © 2013 Kregel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Midler til dette arbeidet ble sjenerøst gitt av: The University of Chicago Kirurgisk avdeling, Seksjon for Urologi; University of Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC); en Pilot Award fra National Cancer Institute (NCI) P50 CA090386 SPORE i prostatakreft ved Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center of Northwestern University og Cancer Research Center ved University of Chicago; en American Cancer Society Institutional stipend (ACS-IRG, # IRG-58-004); en Cancer Center Support Grant (P30 CA14599); Den Brinson Foundation; Alvin Baum Family Fund; og The University of Chicago Cancer Research Foundation kvinner styret. S. Kregel støttes av en HHMI: Med-inn-Grad Fellowship (56006772) og en Cancer Biology Training Grant (T32-CA09594); E. Reyes er støttet av en Immunology Training Grant (AI07090-31). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tilbakefall av ondartet prostatakreft etter hormonbehandling er en signifikant klinisk problem og nye strategier for å forebygge og behandle kastreringsresistent prostatakreft. Androgen deprivasjon (ADT) har vært bærebjelken for prostatakreft behandling siden oppdagelsen av Charles Huggins og Clarence Hodges i 1941 at kastrering betydelig hjulpet pasienter med avansert prostatakreft [1]. Det er imidlertid uunngåelig sykdomsutvikling på grunn av veksten av kastrering-resistente prostatakreftceller. Det finnes en rekke mekanismer for utvikling av kastrering resistent prostatakreft (CRPC), hvorav de fleste sentrere på Androgen Receptor (AR) [2]. Således inhibere intracellulær signalisering innenfor AR prostatakreftceller har vært et stort fokus av prostatakreft forskning, noe som resulterer i en rekke kjemiske inhibitorer som målretter AR signalering som benyttes i klinikken [3]. Dessverre, mens alle disse hemmere produsere en innledende terapeutisk respons, dette er ofte etterfulgt av tilbakefall og progresjon av sykdommen.
De siste funn av somatisk celle omprogrammering ved hjelp av definerte gener for å lage induserte pluripotente stamceller (iPSCs) demonstrerer dypt at ekspresjonen av et par stamcelle gener er i stand til å provosere store endringer i genekspresjon og celle-adferd, hvorav mange er egenskapene til maligne celler [4]. Faktisk er slike stamceller reprogrammerings faktorer etablerte oncogener (c-myc og Klf4) eller er fremstår som onkogener (Sox2, OCT4, og Nanog) i en rekke kreftformer [5], [6], [7]. De Sox2, OCT4, og Nanog transkripsjonsfaktorer utgjør kjernen embryonale stamcelletranskripsjonsfaktor maskiner og er avgjørende mot å opprettholde pluripotency og hindre differensiering [8]. I studier med cellelinjer, disse genene ikke bare fremmer celle spredning og overlevelse, men også svekker normale differensieringsprosesser; som begge er kjennetegnene til tumorgenese og sykdomsprogresjon [5], [7], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. I noen tilfeller, blir ekspresjon av slike gener antas å markere sjeldne kreft stilk /initiere celler [12], [16]. Dermed er funksjonen til disse transkripsjonsfaktorer hos voksne kreftcellene tenkt å hemme differensiering og fremme stamcelle pluripotency og overlevelsesmekanismer som ligner på deres viktige funksjon i embryonale stamceller.
Sox2 [SRY (sex bestemme region Y) -boks 2] er en transkripsjonsfaktor som er nødvendig for å opprettholde overlevelsen og pluripotency av udifferensierte embryoniske stamceller, og har en ny rolle som et epigenetisk omprogrammering faktor og oncogen [5], [17], [18], [19] , [20]. I humane embryonale stamceller Sox2 regulerer ekspresjon av gener 1259, hvorav mange er co-regulert med Oct4 og /eller Nanog [21]. I prostata, er Sox2 ekspresjon observert i celler i basal-epitelcellelaget av normale kjertler epitel [22], og i prostata tumorer [22], [23]. Uttrykket av Sox2 i prostatakreft har vært tenkt å fremme en mer aggressiv svulst fenotype ved å fremme en «stamcelle som» svulst fenotype. Faktisk analyser genet rekke uttrykk viste at en iPS celle-lignende signatur er til stede i en del av godartede og aggressive prostatakreft, og denne signaturen ensidige verre sykdom prognose [24]. Vår gruppe har tidligere identifisert Sox2 som blir sterkt uttrykt i normale prostata epitelceller i forhold til epitelceller fra sædblærene: et organ med tilsvarende funksjon og utviklings opprinnelse som, i motsetning til prostata, er sjelden et område av tumorigenesis [25]. Sammen er disse dataene låne til hypotesen om at Sox2 funksjoner hos voksne normale og maligne epitelceller for å regulere ekspresjonen av mange av de samme målene genet reguleres ved Sox2 innenfor humane ES-celler, og dermed fremme en mindre differensiert embryonal stamcelle-fenotypen tumor; dessuten Sox2 uttrykk kan være begrenset til sjeldne kreft stammen /initiere celler der det gis en verre sykdom prognose. Alternativt Sox2 kunne ha en vesentlig annen funksjon i voksen epitelceller. Disse dataene antyder også at Sox2 kan fremme kastrering-motstand ved å redusere avhengigheten av prostatakreftceller på AR signale for deres vekst og overlevelse.
Her viser vi at Sox2 er uttrykt i de fleste normale prostata basal epitelceller , og er jevnt uttrykt i en undergruppe av prostatakreft. Videre er Sox2 uttrykt i de aller fleste kastreringsbestandig metastatiske lesjoner prostata. I normale prostata epitelceller, humane embryonale stamceller, og kastrerings-resistente prostatakreftceller, ligandaktivering av AR fremmer en reduksjon i Sox2 uttrykk, som er et resultat av direkte binding av AR til den Sox2 cis-enhancer-regionen. Ekspresjon av Sox2 økes også innenfor prostata kreftceller som er resistente mot anti-androgen MDV3100. I kastrering-sensitive prostata kreft celler, er tilstrekkelig til å fremme kastrering-resistente tumordannelse Sox2 uttrykk. Ekspresjonen av Sox2 i prostatakreftceller, imidlertid ikke føre til endringer i differensieringsspesifikke PSA ekspresjon, en økning av CD133-positiv kreft antatte stilk /initierende celler, eller ekspresjonen av kjente humane embryonale stamceller (hESC) -associated Sox2 målgener. Dermed ser Sox2 å fremme kastrering motstand via mekanismer som ikke involverer re-uttrykk for embryonale stamcelle Sox2-målgener eller økt sjelden svulst stilk /initiere cellepopulasjoner.
Materialer og Metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og materialer
R1881 og Actinomycin D ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og MDV3100 ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, Texas), og lagret ved -20 i etanol . Alle humane prostatacancercellelinjer ble dyrket som tidligere beskrevet [26], [27]. Alle kulturer ble rutinemessig undersøkt for fravær av mykoplasma forurensning ved bruk av ATCC Universal Mycoplasma Detection Kit (Manassas, VA). PC-3, ble VCAP, og NCCIT cellelinjer kjøpt fra ATCC, og Du145, LNCaP, LAPC-4, c4-2, CWR22Rv1, CWR-R1, MDA-PCa2B, og E006AA cellelinjer ble sjenerøst gitt av Dr. John Isaacs på The Johns Hopkins University og har tidligere blitt karakterisert [28]. Den menneskelige embryonale stamcellelinje WA01 (H1) ble kjøpt fra WiCell (Madison, WI) og dyrket ved hjelp av materen uavhengig protokollen med mTeSR1 media (Stem Cell Technologies, Vancouver, f.Kr.). ES-celler ble anvendt i løpet av ti passasjer av tining. Utskilt total PSA og testosteron ble målt ved hjelp av Roche Elecsys Total prostataspesifikt antigen (PSA) og Testosteron (T) analyser. Cellevekst ble målt ved hjelp av Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen /molekylære prober, Eugene, Oregon).
Lentiviral Sox2, AR, og Kontroll vektorer (pReceiver-Lv105) ble kjøpt fra GeneCopoeia (Rockville, MD ). Lentiviral tetracyklin transaktivatorprotein (LV-rtTA) og induserbar lentiviral Sox2 vektor fra Hochedlinger lab ble kjøpt via Addgene [29]. Når det er nødvendig, Sox2-ekspresjon ble indusert ved anvendelse av 1 ug /ml Doksycyklin (Sigma). Knockdown av Sox2 uttrykk ved hjelp shRNA uttrykk ble oppnådd ved hjelp av anti-human Sox2 shRNA gen sett, som består av 4 ulike lentiviral målretting sekvenser mot Sox2 og en ikke-tie kontroll [HSH017628-HIVH1 (Sox2) og CSHCTR001-HIVH1 (kontroll) vektorer inneholder en GFP og puromycin-motstand komponenter; Genecopoeia]. Høy titer lentivirus ble gjort ved co-transfeksjon med ViraPower Lentivrial emballasje mix (Invitrogen, Grand Island, New York) og Lenti-X konsentrator. (Clontech, Mountain View, CA) i henhold til produsentens instruksjoner
Ikke-ondartet epitelceller kulturer ble etablert fra friske menneskelige prostata vev ervervet fra kirurgiske prøver som tidligere beskrevet [25]. Disse vev ble kjøpt under en fremskyndet protokoll godkjent av University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Vevsprøver ble administrert av University of Chicago menneskelig vev Resource Center kjerne anlegget; behovet for pasienten samtykke ble frafalt som ervervet prøver ble avidentifisert. 4 mm biopsi punches ikke-svulstvev ble tatt fra prostata og sædvæske vev av pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi; halvparten av dette vev ble løst og analysert ved hjelp av en patolog for å bekrefte fraværet av tumoren. Dissosiasjon av prostatavev og vekst av epitelceller er tidligere beskrevet [30], [31], og de samme fremgangsmåter ble anvendt for å etablere matchet prostata (Prec) og sædblæren (SVEC) epiteliale cellekulturer. Kulturer ble dyrket ved hjelp Keratinoctye Serum-Free definert media supplert med vekstfaktorer (GFS) (standard K-SFM, Invitrogen Life Technologies) og kan dyrkes opp til 8 passasjer før bemerkelsesverdig cellular senescence [32]. For våre eksperimenter, ble alle kulturer analysert ved eller før deres fjerde passasje.
Western Blotting, Immunohistochemistry, og immunfluorescens
Hel-cellelysater innsamlet fra 100.000 celler ble brukt per kjørefelt. Antistoffer som ble brukt var: anti-AR (N-20, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); anti-Beta Actin (Sigma-Aldrich); anti-ΔNp63 (4A4, Santa Cruz); anti-Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-Nanog (D73G4 XP, Cell Signaling Technology); anti-Oct4 (C30A3, Cell Signaling Technology); og anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH, Cell Signaling Technology). Sekundær pepperrot peroksidase-konjugerte antistoffer var fra Cell Signa Technologies, og HRP oppdaget ved hjelp SuperSignal West Femto kjemiluminescenssubstrat (Peirce /Thermo Scientific, Rockford, IL). Alternativt ble sekundære antistoffer fra Rockland (Gilberts, PA) brukt og data tatt med et Licor Odyssey system (Lincoln, Nebraska)
farging for Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, kanin monoklonalt). Ble utført på formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) deler forvaltes enten ved University of Chicago menneskelig vev Resource Core-anlegg eller Northwestern University /University of Chicago prostata SPORE program og deres Specimen Procurement program. Etter deparaffinization og rehydrering, ble vev behandlet med antigen gjenfinning buffer (S1699 fra DAKO, Glostrup, Danmark) i en dampbåt i 20 minutter. Anti-Sox2 antistoff (1:25 fortynning) ble påført i en time ved romtemperatur i et fuktighetskammer. Etter TBS vask, ble antigen-antistoff-binding detektert med seg + systemet (DAKO, K4001 for mus primære antistoffer) og DAB + kromogen (DAKO, K3468). Vevssnitt ble raskt oppslukt i hematoxylin for kontra og var cover-sklei. Vev ble analysert av en utdannet Genitourinary patolog og scoret på prosentandelen av celler med positiv nukleær farging (0 = ingen farging, 1 = 1-10% positive celler, 2 = 11-50% positive celler, og 3 = 50% positive -celler); så vel som intensiteten av fargingen (0 = ingen flekker; 1 = svak farging; 2 = moderat farving; 3 = sterk farging). For bilder, ble lysbilder digitalisert ved hjelp av en Pannoramic Scan Whole Slide skanner (Cambridge Forskning og Instrumentering, Hopkinton, MA) og bilder tatt ved hjelp av Pannoramic Viewer programvareversjon 1.14.50. (3DHistech, Budapest, Ungarn)
For immunfluorescens, vev ble deparaffinized, rehydrert, og behandlet med antigen gjenfinning buffer. Antistoff binding av Sox2 (D6D9, Cell Signaling Technology, Alexa-Fluor 555-konjugert, 01:50 fortynning i TBST) og p63 (4A4, Santa Cruz Biotechnology, Alexa-Fluor 647 konjugert, 01:50 fortynning i TBST) ble gjennomført for 1 time ved romtemperatur. Vev var kontra farget med DAPI og monteres ved hjelp Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL). Fluorescent bildene ble tatt med en Leica TCS SP2 AOBS Laserskanning confocal mikroskop.
Kvantitativ Real Time PCR (Q-RT-PCR) og PCR Array Analyser
RNA ble renset ved hjelp av Qiagen RNeasy Mini Kit med tilleggs DNAse fordøyelsen kit (Qiagen, Valencia, CA) og kvalitet testet ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For standard Q-RT-PCR, ble ekstrahert RNA konvertert til cDNA ved revers transkripsjon hjelp SuperScript® III revers transkriptase (Invitrogen). Nivåer av Sox2, PSA, FGF5 og GAPDH avskrift ble kvantifisert ved hjelp av
Strøm
SYBR® Grønn Master Mix (Invitrogen) ved hjelp av tilpassede primere for Sox2 [5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 «(fremover), 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC- 3 (bakover)]; PSA [5»-TCATCCTGTCTCGGATTGTG-3 «(fremover), 5′-ATATCGTAGAGCGGGTGTGG-3′ (bakover)]; FGF5 [5»-AGTCAATGGATCCCACGAAGC-3 «(fremover), 5′-TGAACTTGGCAG TTGCATGGA-3′ (bakover)]; og GAPDH [5»-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 «(fremover), 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3» (bakover)]. Standardkurver ble brukt for å vurdere primer effektivitet og gjennomsnittlige endringen terskel i syklusen (ΔCT) verdier ble bestemt for hver av prøvene i forhold til GAPDH endogene nivåer, og sammenlignet med bærerkontroll (ΔΔCT). Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer for å bestemme midlere standard feil, og studentens t-tester utført med normalisering å styre for å få p-verdier.
For de humane embryonale stamcelle PCR Arrays, RT
2 First Strand Kit (SA biovitenskap, Valencia, CA) ble brukt til å reversere transkribere RNA til cDNA. RT
2 qPCR Master Mix (SA biovitenskap) og menneskelige embryonale stamceller RT
2 Profiler ™ PCR Arrays (Cat # PAHS-081, SA biovitenskap) ble brukt til å undersøke transkripsjoner av 84 viktige gener som er involvert i vedlikehold av pluripotency og selvfornyelse status av embryonale stamceller. Arrays ble utført med biologiske replikater i tre eksemplarer for hver tilstand. RT
2 Profiler ™ PCR Array Data Analysis programvare ble brukt til å vurdere gjennomsnittlig endring i terskelsyklus (ΔCT) verdier for hver av prøvene i forhold til bærerkontroll (ΔΔCT), bestemme standard feil og oppnå p-verdier via students t -test.
AR Chromatin Immunoprecipication
Chromatin-IP-protokollene ble tilpasset fra tidligere rapporterte metoder [33]. Celler ble dyrket til 70-90% konfluens og ble behandlet i 24 timer med 1 nM R1881. Celler ble fiksert med 1% formaldehyd ved romtemperatur i 15 minutter; tverrbindings ble stanset med 0,125 M glycin i PBS i 15 minutter ved romtemperatur og vasket med iskald PBS. Etter celler ble skrapt av i PBS pluss 1 x protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals, Penzberg, Tyskland), ble cellepelletene samlet opp ved sentrifugering og cellekjerner utvunnet ved sentrifugering ved 14.000 rpm ved 4 ° C i 15 minutter. Cellekjerner ble re-suspendert og vasket i micrococcal nuklease-buffer (tris [pH 7,4] 10 mM, NaCl 15 mM, KCl 60 mM, Spermine 0,15 mM, Spermidin 0,5 mM, CaCl2 1 mM) og deretter inkubert med 10 000 U av micrococcal nuklease for 20 minutter ved 37 ° C med forsiktig thermomixing. Cellekjernene ble deretter oppsamlet og re-suspendert i RIPA-PIC-buffer [150 mM natriumklorid, 1,0% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich), 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0 /1 x protease inhibitor cocktail (Roche)] og ultralydbehandlet (Fisher Scientific, Hampton, NH, modell FB-120 Sonic Dismembrator). Sonikerte kromatin ekstrakter ble deretter pre-erte over natten ved 4 ° C ved inkubasjon med protein G-agarose perler ble behandlet med normal kanin IgG (Cell Signaling Technology), og kromatin fragmenter ble immunoutfelt med spesifikke antistoffer over natten ved 4 ° C. For et en-ml fortynnet kromatin oppløsning, ble 50 ug av de følgende antistoffer anvendt: Normal kanin IgG (Cell Signaling Technology) som en negativ kontroll; Histone H3 (Abcam, Cambridge, MA) som en positiv kontroll; og AR (N-20, Santa Cruz,) for de eksperimentelle betingelser. Perlene ble deretter samlet og vasket i TSE-buffer I [0,1% TritonX-100, 2 nM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,1)], TSE II buffer [0,1% SDS, 1% TritonX-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,1)], Brown Buffer III [0,25 LiCl, 1,0% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1% deoksycholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCL (pH 8,1)], og to ganger med TE-buffer [1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCL (pH 8,1)]. De immunoutfelte kromatin fragmentene ble eluert ut av agarosekuler ved hjelp av Brown elueringsbuffer [1% SDS, 0,1 M NaHCO3, 1 mM DTT, 1 x protease inhibitor cocktail (Roche)] og inkubert i 10 minutter ved 95 ° C under kraftig thermomixing. Eluert kromatin og inngangene ble deretter inkubert over natten ved 65 ° C med forsiktig thermomixing å reversere tverrbindinger. Prøvene ble deretter behandlet med 2 ug RNaseA (Novagen, Darmstadt, Tyskland) ved 37 ° C i 15 minutter, og deretter med 2 pg proteinase K ved 55 ° C i 30 minutter (Cell Signaling Technology). Til slutt ble immunoprecipiated DNA-fragmenter hentet av Fenol-Kloroform (Sigma-Aldrich) ekstraksjon og utsatt for Q-RT-PCR bruker kommersielt tilgjengelige SimpleChIP ™ Menneskelig Sox2 cis-Enhancer promoter primere (Cell Signaling Technology).
I vivo svulstdannelse
Alle dyrestudier ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av University of Chicago Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, protokollnumre 72066 og 72231). Alle operasjoner ble utført under Ketamin /xylazine anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
In vivo
svulstdannelse av LAPC-4 og CWR-R1 cellene ble gjennomført via en subkutan inokulering av en million celler i 4-6 uker gamle atymiske nakne mus (Harlan, Indianapolis, IN) ved hjelp av en 75% Matrigel og 25% HBSS-oppløsning (BD Biosciences). For å måle svulst ta i en kastrert vert, ble verts mus kirurgisk kastrerte en uke før celle inokulasjon. For å måle progresjon til kastrering motstand, ble dyre verter kastrert når tumorer nådde 0,5 cm
3. Å analysere sirkulerende totalt PSA fra svulsten implantat og for å bekrefte testosteron uttømming hos kastrerte verter, ble blod trukket via hjertestans punktering på den eksperimentelle endepunktet.
flowcytometrisystemer
Alle antistoff inkubasjoner, vasker, og strømningscytometriske analyser ble utført ved anvendelse av iskald cellesortering buffer (1 x PBS, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 2 mmol /l EDTA) i minimalt lys ved hjelp av tidligere rapporterte protokoller [26], [31]. Cellene ble farget med Levende /Døde Fixable Grønn død celle Stain Kit (Invitrogen) per produsentens instruksjoner. Etter vasking ble cellene inkubert med FcR Blokkering Reagens (Miltenyi Biotec, Køln, Tyskland, 1:20 fortynning i 10 minutter), og deretter merket med CD133 /2 (293C3) -APC-konjugert humant monoklonalt antistoff (Miltenyi Biotec) eller isotype kontroll mus IgG2b-APC (Miltenyi Biotec) ved en 1:10 fortynning i 30-min. Cellene ble deretter vasket og fikset i 15 minutter med 3,2% Ultra Pure EM Grade formaldehyd (Polysciences, Inc .; Warrington, PA). Etter fiksering ble cellene vasket og farget med FXCycle Violet (Invitrogen, 1:1000 fortynning). Analyse ble utført på en Becton Dickinson LSR II, og et minimum på 250.000 tellinger ble ervervet for hver eksperimentell tilstand. FACSDiVa Software ble brukt for datainnsamling, og FlowJo programvare ble benyttet for analyse.
Floa spheroid Kultur analysen
In vitro
flytende kuler ble dyrket fra 1 × 10
5 LAPC-4 og LNCaP celler transduced med enten lentiviral Sox og GFP ConFtrol vektorer [pReceiver-Lv105; GeneCopoeia (Rockville, MD)]. Celler ble dyrket i Ultra-Low feste 25 cm
2 cellekulturflasker (Corning, Corning, NY) og dyrket i suspensjon i 5 dager. Spheroids dannet etter 5 dager ble overført til 10 cm
2 retter (Corning, Corning, New York) i 24 timer for å tillate vedlegg. Sfæroidene ble deretter farget med krystallfiolett-oppløsning (Sigma-Aldrich), vasket og tellet. Sphere dannelse ble utført i tre eksemplarer.
Statistiske analyser
I alle tilfeller data ble gjengitt ved hjelp av flere biologiske og tekniske replikater. Data ble analysert ved hjelp av Sigmaplot 11,0 programvare ved hjelp av en enveis ANOVA med parvis flere Sammenligning prosedyrer (Holm-Sidak metoden).
Resultater
Sox2 er uttrykt i Normal Prostata Basal Epitelceller og i et delsett med prostatakreft
for å vurdere utbredelsen og mønster av Sox2 protein uttrykk i prostata, gjennomførte vi en immunhistokjemisk evaluering av en rekke menneskelige prostata vev og svulster. Disse analysene viser at i normal og godartet hyperplastiske (BPH) prostata vev Sox2 uttrykk er begrenset til basal epitelceller (Figur 1a). Analyser av prostatakreft viser at Sox2 er enten jevnt uttrykt eller jevnt fraværende (figur 1A). Hoveddelen (12 av 14) av kastrerings-resistente metastaser analysert uttrykker også Sox2 (figur 1 B og C). Prosentandelen av Sox2-positive svulster øker med Gleason Score, med en liten undergruppe av gunstige-prognose Gleason Score 6 svulster og flertallet av dårlig prognose Gleason score 10 og kastreringsresistent metastaser positive (figur 1C). Interessant, analyser av pre-maligne prostata intra-epithelial neoplasi (PIN) lesjoner dokumentert en blandet basal og luminal epitel cellefarging (figur 1C). Disse tumor-data er konsistent med den observasjon gjort av Jia et al. å bruke en annen Sox2 antistoff som viser at uttrykket korrelerer med Gleason grad [23]. Våre data i kontrast til denne rapporten, men som vi observere sterk basal-epitelial farging i ikke-maligne vev, samt ensartet sterk Sox2 ekspresjon i en liten prosentandel av tumorer, i stedet for en gradvis økning av fargeintensitet [23]. Disse data dokumentere at Sox2 er jevnt uttrykt i en undergruppe av prostatakreft, og indikerer at Sox2 uttrykk overfører en unik svulst undertype som ikke ser ut til å være begrenset til sjeldne kreft initiere /stilk-lignende celler i prostatakreft.
A) Immunhistokjemisk farging av Sox2 demonstrere representant atom basal epitel farging (mørk rød) i normale kjertler (Region 3) #, og to forskjellige kreft områder som enten er jevnt Sox2-positve (Region # 2) eller Sox2-negative ( Region # 1). B) Uttrykk for Sox2 i representative kastreringsresistent metastatiske lesjoner. Boksen i 8 x forstørrelse tilsvarer den region som vist i den 40 x bildet. C) Prosent og distribusjon av Sox2 uttrykk blant prostata sykdomstilstander. I normal, BPH, og HGPIN vev, er Sox2 uttrykt i basal-epitelceller (grå søyler). Positivt uttrykk er definert av mer enn 50% av kreftcellene positive med en relativ intensitet på 1 eller mer på en skala fra 0-3. Hos kreft vev og metastaser, er Sox2 enten jevnt uttrykt eller fraværende, og andelen av Sox2-positive svulster øker med Gleason score (svarte striper). BPH: Benign prostatahyperplasi; HGPIN: høyverdig prostata intraepitelial neoplasi; GS: Gleason Score (N = antall enkeltpasientprøver analysert)
Sox2 er Co-Uttrykt Innenfor en del av p63-positive Basal Epitelceller
uttrykk for Sox2 i. AR-negative basal-epitelceller innebærer at Sox2 kan fungere for å fremme overlevelsen av prostata stilk og basalforbigående forsterkende celler, eller for å opprettholde dem i en udifferensiert tilstand. I normal prostata, er den parakrine interaksjonen mellom stromale og epiteliale celler androgen avhengig, hvor AR-positive stromale celler produserer en serie av vekstfaktorer, kollektivt betegnet «andromedins» som signalerer til nærliggende epitelceller for å fremme spredning av AR-negativ, p63-positive basal epitelceller og overlevelse av AR-positive /prostata spesifikt antigen (PSA) -positive luminal epitelceller [34]. For å finne ut hvor stor andel av basal-epitelceller var Sox2-positive, gjennomførte vi co-immunfluorescens farging av Sox2 og p63. Disse data viser at 75% av prostata basale epitelceller som ligger i prostata randsone uttrykker både Sox2 og p63, mens de resterende 25% av cellene uttrykker p63, men ikke Sox2 (figur 2A). Denne observasjonen innebærer at Sox2 uttrykk skisserer to mulige populasjoner av basale epitelceller; Disse cellene kan også ha unike fenotypiske egenskaper og kan utlede forskjellige tumorer [35].
A) Immunofluorescent co-farging av Sox2 (grønn) med basal-spesifikk markør p63 (red), som viser at 75% av normale basal-epitelceller er positivt for både Sox2 og p63 (gul), mens de resterende 25% er Sox2-negative (rød). DAPI flekker høydepunkter kjerner (representative bilder av normal prostata epitel kjøpt fra tre forskjellige individuelle pasientprøver). B) Western blotting av en rekke pasient avledet Prostata (PREC) og sædvæske (SVEC) epitel selge (PREC) kulturer viser at en del av disse kulturene uttrykke påviselig Sox2, mens andre prec og alle SVEC kulturer ikke. C) immunocytokjemisk farging av Sox2 viser uniform atom Sox2 uttrykk i Sox2-positive PrECs og mangel på Sox2-positive celler i Sox2-negative PrECs (representative bilder av tre uavhengige forsøk).
På bakgrunn av dette, vi etablert en rekke ikke-ondartet prostata epiteliale celle (PREC) kulturer fra ferske dissosiert prostatavevet og analysert dem for Sox2 uttrykk. Slike Prec kulturer uttrykker ikke påviselig nivå av AR protein, som de består av for det meste p63-positive forbigående forsterkende celler, sammen med små bestander av CD133-positive stamceller, PSCA-positive mellom celler, og Kromogranin A-positive nevroendokrine celler [ ,,,0],26], [31]. Som en ekstra kontroll, isolert vi pasient matchet sædvæske epitelceller (SVEC) kulturer som bruker de samme metodene. Western blotting analyser dokumentert at PREC kulturer var enten Sox2-positive eller Sox2-negative, og matchende SVEC kulturer var konsekvent negativ (figur 2B) [25]. Den heterogene cellepopulasjoner i slike kulturer Prec antydet at Sox2 kan være sterkt uttrykt i en liten undergruppe av celler. Immunocytokjemiske analyser av Sox2 uttrykk, men, dokumenter at flertallet av celler i Sox2-positive PREC kulturer uttrykker Sox2; mens det er få, om noen, påvisbar Sox2-uttrykkende celler i Sox2-negative Prec kulturer (figur 2C). Derfor, i ikke-maligne PREC kulturer, Sox2 uttrykk er ikke begrenset til en unik cellepopulasjon som CD133-positive prostata stamceller.
Økt androgen reseptor (AR) Signa Reduserer Sox2 Expression i Normal Prostata Epitelceller ( PrECs) og humane embryonale stamceller (hESCs)
Det er tidligere påvist eksperimentelt at aktivering av AR signalering av androgen bindende i prostata epitelceller induserer deres vekst arrestasjon og eventuell terminal differensiering i sekretoriske-luminal celler [36] , [37], [38]. Ekspresjonen av Sox2 i basale epitelceller og mangelen på Sox2 ekspresjon i ikke-maligne AR-positive luminal epitelceller antydet at AR kan undertrykke Sox2 uttrykk. Ved hjelp av Sox2-positive Prec kulturer, ble responsen av Sox2 uttrykk for eksogen ekspresjon og ligand induksjon av vill-type AR evaluert.
