PLoS ONE: Antitumor Virkninger av en Novel kromosom Region Vedlikehold 1 (CRM1) Inhibitor på ikke-småcellet lungekreft celler in vitro og i Muse tumorxenotransplantater

Abstract

Bakgrunn

kromosom Region Vedlikehold 1 (CRM1) er en kjernefysisk eksportør og dens inhibitor har anti-tumor aktivitet i ulike kreftformer. Denne studien vurderte terapeutisk effektivitet av romanen CRM1 inhibitor KPT-185 på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).

Metoder

NSCLC cellelinjer ble behandlet med KPT-185 for å vurdere endringer i celleviabilitet, cellesyklus, apoptose, og proteinekspresjon. NOD-SCID mus som bærer NSCLC celletransplantater ble behandlet oralt med KPT-276, en klinisk analog av KPT-185, for å undersøke effekt og bivirkninger av KPT-276 in vivo.

Resultater

KPT-185 signifikant reduksjon i levedyktigheten til seks NSCLC-cellelinjer på en tids- og doseavhengig måte, inkludert epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosinkinase-inhibitor (EGFR-TKI) motstandsdyktig H1975 og H1650GR cellelinjer. I tillegg KPT-185 indusert disse NSCLC-celler til å arrestere ved G1-fasen av cellesyklusen og forårsaket apoptose i en doseavhengig måte. KPT-185 behandling også redusert CRM1 protein nivåer i seks NSCLC-cellelinjer, og reduksjonen kan bli fullstendig avskaffet ved proteasominhibitor bortezomib. KPT-185 aktivert kaspase 3, 8 og 9, men hemmet Survivin ekspresjon i NSCLC-celler. I en muse H1975 celle xenograft modell, ble tumorvekst betydelig hemmet av oral KPT-276 administrasjon, og det var ingen signifikant mus vekttap eller andre bivirkninger.

Konklusjoner

Den aktuelle studien demonstrerte anti-tumor-effekter av KPT-185 i NSCLC-celler, inkludert EGFR-TKI-resistente NSCLC-cellelinjer. Videre studier vil vurdere anti-tumor aktivitet av KPT-185 i en klinisk studie for NSCLC

Citation. Wang S, Han X, Wang J, Yao J, Shi Y (2014) Antitumor Virkninger av en roman kromosom Region Vedlikehold 1 (CRM1) Inhibitor på ikke-småcellet lungekreft celler in vitro og i Muse tumorxenotransplantater. PLoS ONE 9 (3): e89848. doi: 10,1371 /journal.pone.0089848

Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA

mottatt: 18. august 2013, Godkjent: 28 januar 2014; Publisert: 04.03.2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i. verden, sto for 1,3 millioner på verdensbasis kreftrelaterte dødsfall hvert år [1]. Histologisk ca. 85% av pasienter med lungekreft er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [2], hvorav de fleste er diagnostisert på et avansert stadier av sykdommen og uegnet for kurativ kirurgi. Palliativ behandling inkluderer kjemoterapi og strålebehandling, og mer nylig, målretting terapi, slik som epidermal vekstfaktor reseptor-tyrosinkinasehemmere (EGFR-TKI) gefitinib, erlotinib, og icotinib. Disse behandlingene har bedret overlevelsen av pasienter med NSCLC [3]; Men pasienter som i utgangspunktet responderer på EGFR-TKI behandlinger etter hvert utvikle ervervet resistens. Dermed er nye terapeutiske agenter med lav toksisitet og bedre resultater sterkt behov for pasienter med NSCLC.

I løpet av menneskelige kreftutvikling eller kreft progresjon, ondartede celler tilegne seg evnen til å eksportere viktige kjerneproteiner som kan påvirke behandlingseffekten. Disse proteinene inkluderer tumor suppressors og regulatorer av celle apoptose, er kjernefysiske lokalisering som krevde for riktig funksjon [4]. Kromosom region vedlikehold ett protein (CRM1 eller kalt XPO1) er et medlem av importin β super av kjernefysiske eksport reseptorer (karyopherins). Videre er CRM1 politimesteren formidler av kjernefysisk eksport, kan samhandle med leucine-rik kjernefysiske eksport signaler (Ness), og transportproteiner gjennom kjernefysiske pore komplekser til cytoplasma [5] – [7], inkludert EGFR, p53 og kjernefysiske faktor på kappa lett polypeptid-genet forsterker i B-celler inhibitor, a (IkB-α) [8] – [10]. Hvis aktiviteten av CRM1-mediert eksport er blokkert, kan proteinet funksjon endres. Derfor kan CRM1 inhibitorer benyttes som en ny klasse av målretting terapi mot kreft hos mennesker. Faktisk, til dags dato, mange små molekyl CRM1 hemmere har blitt utviklet og med høy anti-tumor aktivitet, for eksempel leptomycin B (LMB), ratjadone, goniothalamin, N-azolylacrylates, og CBS9106 [11] – [15]. Disse lavmolekylære inhibitorer kovalent binde til cysteinresiduet (Cys528) i NES-bindende spor av CRM1 protein [16] – [17]. En fase I klinisk studie av LMB ble gjennomført, men LMB ble ikke anbefalt for videre kliniske utviklingen på grunn av høy giftighet og manglende effekt [18]. Deretter en rekke LMB analoger er rapportert med redusert toksisitet [19].

I den senere tid har en annen klasse av CRM1 inhibitor blitt identifisert, inkludert KPT-185 og KPT-276 (Karyopharm Therapeutics Inc .; Boston , MA, USA). Disse inhibitorene er selektivt inhibitorer av kjerne eksport (SINE), og har blitt vist å være effektive for behandling av visse typer kreft, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, akutt myeloid leukemi, mantle celle lymfom, noe som resulterer i signifikant vekstinhibering og apoptose av tumorceller uten alvorlig toksisitet [20] – [22]. I mellomtiden er nivåene av protein CRM1 forhøyet hos lungekreft vev når sammenlignet med normale lungevev. Derfor, i denne studien, utforsket vi den terapeutiske effektiviteten av disse nye narkotika som CRM1 hemmere (dvs. KPT-185 og KPT-276) i NSCLC celler

in vitro Hotell og

in vivo

å forhåpentligvis gi ny innsikt i disse stoffene for fremtidig mål terapi av NSCLC.

Materialer og metoder

celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser

Den menneskelige NSCLC cellelinjer A549, H1650, H1975 , H2228, og HCC827 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Den H1650 Gefitinib-resistente (H1650GR) cellelinjen ble etablert i vårt laboratorium ved å eksponere cellen til økende konsentrasjoner av gefitinib i 10 måneder. Den resulterende cellelinje H1650GR var resistent mot gefitinib

in vitro plakater (IC

50 30 mm). NSCLC cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

KPT-185 og KPT-276 ble levert av Karyopharm Therapeutics. Bortezomib er innhentet fra Selleck Chemicals LLC (Houston, Texas, USA). Den pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California, USA). Antistoffer mot EGFR, GAPDH, avspaltes-caspase-3, caspase-8, spaltet-caspase-9, poly- (ADP-ribose) polymerase (PARP), Survivin, og sekundære antistoffer konjugert med pepperrot peroksidase (HRP) mot kanin-IgG og mus IgG ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Videre ble antistoffer mot CRM1, nukleær faktor kappa-lett polypeptid-genet enhancer av B-celler (NF-kB), og IkB-α oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Alle andre reagenser og kjemikalier ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Celleviabilitet assay

NSCLC-celler ble sådd ut ved en tetthet på 6000 celler per brønn i en 96-brønns plate og dyrket over natten. På den neste dag, ble vekstmediet erstattet med friskt medium inneholdende seriefortynninger av KPT-185 (opp til 10 uM) eller dimetylsulfoksyd (DMSO) som en kontroll. I dupliserte plater, ble NSCLC celler utsatt for KPT-185, gefitinib, eller KPT-185 pluss gefitinib. Etter at cellene vokste i opptil tre dager ble celleviabilitet målt ved hjelp av en Cell Titer 96® Aqueous ikke-radioaktive Cell Proliferation Assay (Promega, Fitchburg, WI, USA). Reagenset ble tilsatt til cellene og inkubert ytterligere i 3 timer. Absorbansen ble deretter målt ved 490 nm med en mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Dataene er oppsummert i prosent av ubehandlede (DMSO kontroll) celler.

Strømningscytometrisk cellesyklus og apoptose assay

Etter behandling av NSCLC-celler med KPT-185 i 48 timer, ble de farget med propidium jodid (PI) farging buffer (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) i 30 minutter ved romtemperatur og deretter målt ved FACS-cytometri (BD Biosciences, NJ, USA). DNA-histogram ble analysert ved hjelp ModFit LT cellesyklusanalyse programvare (Bekreft Software House).

Cell apoptose ble oppdaget med en Alexa Fluor 488 annexin V /død celle apoptose Kit (Invitrogen) i henhold til instruksjonene i settet. I korthet, etter behandling med KPT-185 i 48 timer, cellene fra både fjæring og tilslutning ble oppsamlet og ko-inkubert med Annexin V-fluorescein isotiocyanat (FITC) og PI, deretter målt ved FACS-cytometri (BD Biosciences). Prosentandelen av Annexin V og PI negative celler ble beregnet basert på prikkplotter av FITC og PI.

RNA isolering og QRT-PCR

Totalt cellulært RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, NRW, Tyskland) og deretter revers-transkribert til cDNA ved bruk av superscript III første-tråd syntese system for RT-PCR (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. CDNA-prøvene ble ytterligere amplifisert ved Real-time PCR med følgende syntetiske primere (Invitrogen): CRM1, 5′-GCCTCACTGAGATTGCTGGT-3 «og 5′-TGAAGGGCCTCCATAAGAGT-3′; og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), 5»-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 «og 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3». PCR-betingelsene ble satt i et 20 ul reaksjonsblanding inneholdende cDNA (2 ul), primere (400 nM hver, 1 ul), og SYBR grønn hoved blanding (2 x, 10 ul) (Invitrogen). cDNA ble amplifisert i en Lightcycler480 real-time PCR-system (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) med følgende sykluser: 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 sek. Alle prøver ble analysert i triplikat og gjentatt tre ganger. De relative uttrykk nivåer av CRM1 ble normalisert til GAPDH hjelp av to-ΔΔCT metoden.

Protein utvinning og Western blot

Etter behandling av cellene med KPT-185 for 48 timer, cellene ble vasket to ganger med kald fosfatbuffer saltvann (PBS) og lyseres med NE-PER-buffer (Pierce Bioteknologi, Waltham, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Supernatanten (hele cellelysat) ble kvantifisert og deretter underkastet elektroforese ved bruk av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE). Proteinene ble deretter overført på en PVDF-membran (Millipore, Billerica, MA, USA) ved anvendelse av elektroblotting. Etter dette ble membranene blokkert med 5% tørket skummet melk i Tris-bufret saltvann plus Tween 20 (TBS-T) i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert med et primært antistoff ved 4 ° C over natten. På den neste dag, ble membranene vasket med TBS-T tre ganger og videre inkubert med et sekundært antistoff-HRP-konjugatet ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking med TBS-T igjen ble proteinene bånd påvist med Western Immobilon HRP deteksjon substrat (Millipore). Positive bildene ble tatt opp med en chemiluminescence instrument (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA).

immunfluorescens mikros

lokalisering og uttrykk for CRM1, EGFR, IkB-α, NF-kB og p53 ble påvist i nærvær og fravær av KPT-185 ved immunofluorescens-mikroskopi. NSCLC-celler ble behandlet med KPT-185 i 48 timer og løst i 30 minutter med 4% paraformaldehyd. Deretter cellemembraner ble permeabiliseringen ved behandling med Triton X-100 (0,1% w /v) i PBS i 15 min. Etter blokkering med blokkerende buffer bestående av 5% normalt geiteserum i 1 time, ble cellene behandlet med primært antistoff i 1 time. Etter vasking med PBS, ble cellene behandlet i 1 time med en sekundær FITC-konjugert antistoff og DAPI. Photomicrographic bildene ble tatt opp ved hjelp av en fluorescens mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Mus NSCLC celle xenograft analysen

Fire uker gamle kvinnelige ikke-obese diabetic alvorlig kombinert immunsvikt (NOD -SCID) mus ble kjøpt fra Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, og subkutant inokulert i flanken regionen med en suspensjon av H1975 celler (5,0 × 10

6 celler). Tumor volum ble målt tre ganger ukentlig og ble beregnet ved hjelp av følgende formel: volum (mm

3) = (bredde (mm))

2 × lengde (mm) /2. Når tumorvekst var stabil (gjennomsnittlig størrelse på 100 mm

3), ble musene tilfeldig inndelt i 3 grupper og behandlet oralt med bærer (Pluronic F-68 /PVP-K29 /32), gefitinib (100 mg /kg qd for 3 uker) eller KPT-276 (100 mg /kg 3 ganger i uken i 3 uker) [22]. Vekstkurver for tumorcelle xenografter ble samlet ved å plotte de midlere relative tumorstørrelser +/- SE. Kroppsvektendring (målt tre ganger ukentlig) ble uttrykt som et forhold i forhold til vekten før første behandling. Mus ble avlivet når den en-dimensjonale tumordiameter nådd 15 mm eller etter tap av 10% av kroppsvekten. Betydningen av disse forskjeller mellom forskjellige grupper ble evaluert ved bruk av en ANOVA-test. Protein nivåer av CRM1, EGFR og Survivin i xenografttumorer ble oppdaget av immunhistokjemi. Denne studien ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Cancer Institute /Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences.

Resultater

Hemming av NSCLC celle levedyktighet av KPT-185

for å vurdere anti-tumor aktivitet av CRM1 inhibitor KPT-185, utførte vi celleviabilitet analyser i seks humane NSCLC-cellelinjer. Celler ble behandlet med serielle fortynninger av KPT-185 fra 1 nM til 10 uM for 2 og 3 dager. Dataene viste at KPT-185 redusert NSCLC cellelevedyktighet i en dose- og tidsavhengig måte, med en IC

50 fra 1,3 nM til 46 uM (figur 1 A-F). I denne studien representerte hver NSCLC cellelinje en forskjellig molekyl subtype av NSCLC. Interessant, KPT-185 like hemmet levedyktighet av EGFR-TKI-resistente H1975 og H1650GR celler og EGFR-TKI-sensitive HCC827 celler, noe som indikerer at KPT-185 kan være en god kandidat for effektiv kontroll av EGFR-TKI-resistente lungekreft . I tillegg viser våre data viste at det ikke var noen synergistisk effekt mellom KPT-185 og EGFR-TKI (gefitinib) behandling på tumorcellelevedyktighet hemming (figur 1G 3D). I tillegg er behandling av cellene med KPT-185 og gefitinib ikke resultere i en synergistisk effekt på celle apoptose.

De seks NSCLC-cellelinjer ble behandlet med KPT-185 og deretter tumorcelle-apoptose ble bestemt ved flow-cytometri-analyse . Dataene indikerte en dose-avhengig induksjon av celle apoptose etter 48 timers behandling (A). KPT-185 indusert apoptose i H1975 (B) og HCC827 (C) celler når sammenlignet med EGFR-TKI gefitinib behandling. En representant data av apoptose analysen i H1975 celler ble vist (D). (N = 3).

nedregulering av CRM1 og andre proteiner i NSCLC celler ved KPT-185

Deretter analyserte vi effekten av KPT-185 på regulering av CRM1expression i NSCLC celler. Nivået av CRM1 protein ble merkbart redusert etter behandling med KPT-185 i alle seks NSCLC-cellelinjer sammenlignet med kontrollceller (figur 4A). Imidlertid nivåene av CRM1 mRNA var høyere i H1975, HCC827 og H1650GR celler etter behandling med KPT-185 enn den til kontrollcellene (figur 4B), som indikerer at reduksjon av CRM1 protein ved KPT-185 var ikke på transkripsjonsnivået. Vi deretter undersøkt om KPT-185-redusert CRM1 protein uttrykk skyldes aktivering av ubiquitin /proteasome veien. H1975, HCC827, og H1650GR-celler ble behandlet med KPT-185 i nærvær eller fravær av bortezomib (10 nM; proteasominhibitor) i 48 timer. I nærvær av bortezomib, ble reduksjonen av CRM1 protein ved KPT-185 nesten blokkert (figur 4C), noe som tyder på at KPT-185-indusert CRM1 uttømming krever aktivering av ubiquitin /proteasom-reaksjonsveien. Vi så vurdert nivåene av ulike proteiner som er vist å bli eksportert av CRM1, slik som EGFR, p53, og IkB-α. KPT-185 behandling også redusert EGFR-ekspresjon i alle seks NSCLC-cellelinjer (figur 4D sample- og Figur S1). Det var imidlertid ingen vesentlig endring i nivået av NF-kB og IkB-α i disse cellene, men IkB-α og NF-kB ble akkumulert i kjernen i KPT-185 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (figur 4D, 4E 4E). I mellomtiden var det ingen endring i p53 protein nivåer i både HCC827 og H2228-celler, og p53-protein var ikke påvisbart i H1650 og H1650GR celler (Figur 4D).

De seks NSCLC-cellelinjer ble behandlet med KPT- 185 i 48 timer. Ekspresjon av CRM1 protein ble nedregulert (A og E), mens de CRM1 mRNA-nivåene var oppregulert (B, N = 3). I nærvær av den proteasominhibitor bortezomib, ble reduksjonen av CRM1 protein følgende KPT-185 behandling nesten blokkert i H1975, HCC827, og H1650GR-celler (C). EGFR uttrykk ble nedregulert følgende KPT-185 behandling. NF-kB og IkB-a proteiner nivåer ble ikke signifikant påvirket. KPT-185 oppregulert villtype p53 i A549-celler, downregulated mutant p53 i H1975 celle, og det var ingen effekt på HCC827 og H2228 celle. I tillegg ble p53 ikke oppdaget i H1650 og H1650GR celler (D E, 400 ×).

Induksjon av caspaseaktivering hos NSCLC celler ved KPT-185

For ytterligere å belyse de underliggende molekylære hendelser ved hvilken KPT-185 indusert apoptose i NSCLC-celler, analyserte vi aktivering og spaltning av kaspaser, PARP og survivin etter behandling av de seks NSCLC-cellelinjer med KPT-185 i 48 timer. Våre data viser at når sammenlignet med kontrollceller, caspaser-8, -9 og -3, og PARP ble aktivert eller spaltet, mens Survivin, en inhibitor av apoptose, ble nedregulert i NSCLC-celler behandlet med KPT-185 (figur 5A). Vi behandlet deretter H1975 celler med 100 mM av pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK i 2 timer før KPT-185 behandling. Vi fant at H1975 celle apoptose indusert ved KPT-185 ble fullstendig inhibert av Z-VAD-FMK (figur 5B).

De seks NSCLC-cellelinjer ble behandlet med KPT-185 i 48 timer. Caspaser-8, -9 og -3 og PARP ble aktivert eller spaltet, men Survivin ble nedregulert (A). I nærvær av de pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK, ble KPT-185-indusert apoptose fullstendig blokkert i H1975 celler (B, N = 3).

Effekt av KPT-276 videre NSCLC celler in vivo

Vi har vurdert effekten av CRM1 inhibitor KPT-276 (den kliniske tilsvarer KPT-185) på NSCLC celler

in vivo

. Vi først transplantert NSCLC H1975 celler med en EGFR-TKI motstand mutasjon i NOD-SCID mus. Etter tumorxenotransplantater ble etablert, ble musene administrert oralt med kjøretøy, gefitinib, eller KPT-276 behandlinger. Vi fant ut at KPT-276 behandling betydelig hemmet tumorvekst når sammenlignet med kjøretøyet eller gefitinib-behandlede tumor xenograft grupper (

P

0,05, figur 6A). Musene tolerert den administreres oralt KPT-276 (100 mg /kg) behandlinger, som angitt ved en gjennomsnittlig 6,64% vekttap (figur 6B). I tillegg, kjemoterapi-lignende bivirkninger, slik som diaré, ikke ble observert. Protein nivåer av CRM1, EGFR og Survivin i xenografttumorer ble oppdaget av immunhistokjemi. Ekspresjon av CRM1 ble nedregulert, og CRM1 var begrenset til kjernen i KPT-276 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen og gefitinib behandlingsgruppen (figur 6C). Ekspresjonen av EGFR og Survivin ble nedregulert i KPT-276 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen og gefitinib behandlingsgruppen (figur S2).

NSCLC H1975-celler ble transplantert inn i NOD-SCID-mus. Mus med en etablert NSCLC celle xenograft ble administrert oralt med kjøretøy, gefitinib, eller KPT-276. Tumorcellevekst xenograft ble undersøkt i 30 dager. Tumorvekstkurver viste en statistisk signifikant undertrykkelse av H1975 cellevekst in vivo i forhold til kjøretøyet eller gefitinib behandling (

P

0,05, A). Mus administrert oral KPT-276 (100 mg /kg, tre ganger i uken i tre uker) tolerert behandling vel (B). Proteininnholdet av CRM1was påvist i xenografttumorer ved immunhistokjemi (C, 400 ×).

Diskusjoner

I denne studien har vi utforsket den terapeutiske effektiviteten av nye legemiddellignende CRM1 hemmere i NSCLC celler

in vitro Hotell og

in vivo

. Resultatene viste at SINE CRM1 inhibitor KPT-185 redusert NSCLC celleviabilitet og induserte dem til å gjennomgå apoptose i en doseavhengig måte. KPT-185 oppviste også en sterk anti-tumoraktivitet i EGFR-TKI-resistente NSCLC-cellelinjer. Videre KPT-185 også indusert cellesyklus arrest i G1 /S sjekkpunkt i KPT-185-sensitive NSCLC cellelinjer, nedregulert nivåer av CRM1 og EGFR protein, akkumulert p53, IkB-α og NF-kB i kjernen, og aktiverte caspases-8, 3 og 9 proteiner i NSCLC celler. Oral administrasjon av KPT-276 betydelig hemmet svulst xenograft vekst i H1975 bærende NOD-SCID-mus, som var resistent mot EGFR-TKI behandling. Viktigst, mus tolereres KPT-276 behandling med minimalt tap av kroppsvekt og uten alvorlig toksisitet. Videre studier vil vurdere de underliggende molekylære mekanismene for KPT-185 anti-tumor aktivitet i en klinisk studie for NSCLC.

Ja, nyere studier har vist at CRM1 overekspresjon er assosiert med tumor progresjon og dødelighet i flere humane kreftformer [23]. For eksempel, Zhang viste at CRM1 siRNA førte til CRM1 protein knockdown og redusert mantle celle lymfom (MCL) celleviabilitet, og sinus indusert CRM1 proteintranslokasjon inn i kjernen, hvor dens ekspresjon ble nedregulert [22]; således disse data viste seg å være motsatt til tidligere CRM1 inhibitorer [13], [14], [24], [25]. I denne studien demonstrerte vi at KPT-185 redusert NSCLC celleviabilitet, apoptose, og arrestert NSCLC-celler i G1 fasen av cellesyklusen. Disse data er i overensstemmelse med tidligere studier på CRM1-inhibitorer i forskjellige humane cancere [13], [14], [22] – [25]. Vår nåværende data videre viste at SINE inhibitor KPT-185 nedregulert CRM1 proteinnivåer i NSCLC cellene gjennom KPT-185-indusert proteasome nedbrytning av CRM1 protein. Det er således en mulig cytotoksisk mekanisme av CRM1 inhibitorer via ubikvitin /proteasom-reaksjonsveien, noe som reduserer eksport av tumorsuppressorgener proteiner (TSP) fra kjernen til cytoplasma, slik som p53, IkB-α og NF-kB. Etchin et al. videre vist at CRM1 hemmere kan binde seg til sporet av CRM1 protein som vanligvis ble okkupert av NES, og blokkere CRM1 styrt protein eksport [21].

En rekke studier har vist at NF-kB aktivering er vesentlig å opprettholde tumorcellelevedyktighet, og hemming av NF-kB aktivitet alene er tilstrekkelig til å indusere celledød [26], [27]. Men i vår nåværende studie, vi ikke observere noen betydelige endringer i NF-kB og IKB-a uttrykk nivåer i NSCLC celler etter KPT-185 behandling, men IkB-α og NF-kB ble delvis akkumulert i kjernen i KPT-185 behandlingsgruppen. CRM1 er kjent for å eksportere villtype p53 fra kjernen til cytoplasma av kreftceller via dets C-terminal NES, slik at for effektiv nedbrytning av p53 ved proteasomer. I vår nåværende studie fant vi at hemming av CRM1 aktivitet ved KPT-185 forhindret p53 fra spennende kjernen, noe som resulterer i atom p53 akkumulering og stabilisering i p53 bredt typen NSCLC A549 celler. I H1975-celler, som har et mutert p53, KPT-185 behandling nedregulert p53-nivåer og begrenset p53 til kjerne. I tillegg p53-nivåene var stabil i både HCC827 og H2228-celler, noe som tyder på at apoptose i disse celler er p53-uavhengig. Overraskende, p53 var ikke påvises i H1650 og H1650GR celler. Den H1650 cellelinjen har tidligere blitt beskrevet som en cellelinje som bærer mutant type p53 [28].

EGFR regulerer viktige tumorigene prosesser, herunder proliferasjon, apoptose motstand, angiogenese og invasjon, og ofte overuttrykt under utviklingen og progresjon av NSCLC [29]. EGFR kan påvises i kjernen og eksportert til cytoplasma ved CRM1. I vår studie, viste vi at EGFR uttrykk ble redusert etter KPT-185-redusert CRM1 uttrykk i NSCLC celler. Noske et al. [30] viste den inverse sammenslutning av EGFR med CRM1 uttrykk i eggstokkreft vev. Nivåer av EGFR-protein ekspresjon ble redusert etter eksponering av eggstokkreft celler til leptomycin B (LMB), hvilket antyder at CRM1 spiller en rolle i den intracellulære transaktivering av EGFR [30]. I motsetning til dette, Lo et al. detekterte økte atom EGFR-nivåer etter LMB behandling i humane epidermoide karsinom A431-celler [31], noe som indikerer at økt atom EGFR ved LMB gir en plausibel mekanisme ved hvilke celler shuttle celleoverflate EGFR gjennom kjerne pore-komplekset og inn i kjernerommet.

survivin er et medlem av de inhibitorer av apoptose familie og beskytter mot apoptose etter enten direkte eller indirekte inhibering av aktivering av kaspaser [32]. PARP er et substrat for caspase og dens aktivering fører til apoptose. I vår nåværende studie, KPT-185 var i stand til å aktivere caspases-8, -9 og -3, PARP, men hemme Survivin i alle seks NSCLC-cellelinjer. Vår nåværende data viste også at KPT-185 var i stand til å indusere apoptose i både EGFR-TKI-sensitive og -resistente NSCLC-celler. Videre fant vi at den pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK helt forhindret KPT-185-indusert apoptose i H1975 celler. Våre resultater viste at SINE-indusert apoptose var avhengig av kaspase-aktivering i NSCLC-cellelinjer.

KPT-185 har vist seg å ha egnede farmakokinetiske egenskaper,

in vivo

, enten subkutant eller oralt. Imidlertid KPT-276, strukturelt beslektet med KPT-185, er egnet for oral terapi [22]. Mutka et al. bemerket at LMB har off-target effekter mot andre enn CRM1 proteiner og at disse off-target effekter kan bidra til LMB er bivirkninger (~ 20% av kroppsvekten tap) [33]. I denne studien, vi utnyttet KPT-276 i en dose på 100 mg /kg tre ganger pr uke i tre uker for å behandle mus som bærer NSCLC-tumorcelle xenografter. Vi har funnet at disse musene toler (mindre enn 10% kroppsvekttap) behandlingen. I tillegg KPT-276 viste høy antitumoraktivitet i EGFR-TKI-resistente NSCLC-celler xenografter. Disse resultatene indikerer at KPT-276 kan være et nyttig CRM1 inhibitor for klinisk behandling av NSCLC pasienter, særlig for EGFR-TKI-resistente pasienter.

Hjelpemiddel Informasjon

Figur S1.

lokalisering og ekspresjon av EGFR, IkB-α, og NF-kB ble påvist i nærvær og fravær av KPT-185 ved immunofluorescens-mikroskopi. Ekspresjon av EGFR ble nedregulert, og IkB-α og NF-kB ble akkumulert i kjernen i KPT-185 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (400 x)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089848.s001 product: (TIFF)

Figur S2. Bedrifter Den protein nivåer av EGFR og survivin ble påvist i xenografttumorer ved immunhistokjemi. Uttrykket av EGFR og survivin ble nedregulert i KPT-276 behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen og gefitinib behandlingsgruppen (400 ×)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089848.s002 plakater (TIF)

takk

Vi vil gjerne takke Karyopharm Therapeutics Incorporated selskapet for å gi KPT sinus forbindelser, og professor Michael Wang og Liang Zhang ved University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston Texas, USA, for kritisk kommentarer.

undersøkelsen ble presentert som en plakat på AACR 2013 årlige møtet i Washington DC, USA (Abstract # 3444).

Legg att eit svar